復配涂封劑調節橡膠苗低溫脅迫的生理響應研究

程琳琳，安 鋒*，謝貴水，王紀坤，王立豐，張希財

(1.中國熱帶農業科學院 橡膠研究所，海南 海口 571101；2.農業農村部儋州熱帶作物科學觀測實驗站，海南 儋州 571737)

天然橡膠是重要的工業原料和戰略物資，2019年我國橡膠樹種植面積約達114.7萬hm2，僅次于印度尼西亞和泰國(兩國橡膠種植面積均為367.6萬hm2)[1]。異于橡膠樹原產地的熱帶季風氣候環境，我國植膠區地處熱帶北緣和南亞熱帶，寒害是其主要的限制因子[2]。寒害常使橡膠樹產量降低，也直接威脅樹體的生存，進而影響了栽培橡膠樹的經濟效益。根據寒害發生時的天氣條件[3]，寒害對樹干危害較嚴重的癥狀表現為爆皮流膠，導致樹皮受損甚至樹體死亡。樹干是橡膠樹產膠和割膠的主要部位，樹干的受害將直接影響橡膠樹的膠乳生產，從而嚴重影響膠園的整體產量。在寒害調查和評價中，樹干流膠程度是橡膠樹寒害分級的關鍵標準[4]。因此，如何減少因寒害而產生的爆皮流膠癥狀對橡膠樹的抗寒栽培管理至關重要。

脫落酸(ABA)作為重要的信號分子物質，是植物抵御非生物脅迫的一種天然激素，在植物的旱、鹽、低溫等逆境反應中發揮重要的作用[5-7]，也是植物水分平衡和脅迫適應性的重要調節因子，在植物的抗寒馴化中起著重要的作用[8]。王紀坤等[9]采用7-33-97芽接苗為材料，噴施脫落酸溶液后進行低溫處理，發現ABA可以提高橡膠樹細胞滲透調節物質的含量，提高其體內的各種保護酶活性，降低膜脂過氧化程度，從而提高其抵御低溫脅迫的能力，以25 mg/L的ABA預處理的抗寒效果最佳。殼聚糖是一種大的陽離子多糖，它是我國資源豐富且相對廉價的化合物，具有良好的成膜性、附著性和吸濕性[10]。殼聚糖能促進植物的生長與抗滲透物質的合成，增強清除氧自由基的能力，防止膜系統受破壞，從而增強植物自身抵抗能力[11]。殼聚糖在提高水稻幼苗[12]、茶樹[13]、草莓[14]、荔枝[15]等作物的抗寒性及種子萌發[16-18]等方面具有良好的效果，可以作為激發子啟動植物防御系統，提高植物的抗冷性。在橡膠樹上，王立豐等[19]認為0.05 g/L殼聚糖提高橡膠樹芽接苗和萌條抗寒性的效果最佳。Ca2+作為第二信使參與了植物的營養生長、代謝調節過程。同時，作為磷脂的磷酸根和蛋白構象靈活變化的信號，它還可以防止亞細胞結構被破壞，穩固膜的結構，從而使得植物適應環境的脅迫[20]。外源CaCl2的使用改變了細胞內Ca2+濃度，Ca2+作為第二信使傳遞細胞外的信息到細胞內，調節植物生理變化，從而提高植物對寒冷環境的適應性，在胡椒[21]、番木瓜[22]、閩楠[23]等植物中均有報道。張希財等[24]在橡膠樹袋裝苗防寒中用到了CaCl2，認為0.05～0.30 g/L CaCl2對橡膠樹袋裝苗防寒具有良好的效果。

目前，市售割面涂封劑大多數為成膜劑、單一生長調節劑與各種植物油脂混配，主要是通過生長調節劑促進樹體生長，以及油脂膜使割面與外界隔離而起到物理防護作用，在樹皮防寒方面，主要是對外界低溫的被動防御，另一方面，一旦防護膜受外界大風、雨水等因素脫落，其防寒效果就會失去。復配割面涂封劑克服大多數市售割面涂封劑的被動防御機制，結合脫落酸、殼聚糖、CaCl2在橡膠樹抗寒調節中的作用，誘導樹體自身的抗寒性，提高樹體自身抵御低溫的能力。據此，本試驗以熱研7-33-97橡膠樹袋裝大型苗為材料，結合前人在橡膠樹防寒、抗逆方面研究效果與試驗篩選的基礎上，分析了以脫落酸、殼聚糖和氯化鈣混配的割面涂封劑對低溫脅迫下橡膠樹的生理影響，為復配割面涂封劑的研發和橡膠樹抗寒栽培提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為熱研7-33-97橡膠樹大型全苗(2018年8月芽接，高度為2.1～3.5 m，2019年8月從苗圃移植至育苗容器)。選擇生長正常、生長勢基本一致的植株作為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計 以市面上銷售的橡膠樹割面涂封劑為T1，以ABA 25 mg/L+殼聚糖0.05 g/L+CaCl28.0 g/L混合液與毛棕櫚油(由本單位油棕種質資源課題組研發)混配后作為T2(即新型復配割面涂封劑)，以清水作為對照(CK)。將試劑1(T1)、試劑2(T2)、清水分別涂抹在橡膠樹植株已木質化的莖干部位，每個處理20株。自然條件下，2種試劑用清水涂抹2 d后，將所有植株移入人工氣候室中，進行低溫脅迫處理。人工氣候室控制條件：12 h光照，12 h黑暗，相對濕度為80%；光照時段的光照強度為75～100 lx，溫度控制在(16±1)℃；黑暗時段的溫度控制在(4±1)℃。分別于低溫脅迫的第2、5、8天選取植株木質化莖干的韌皮部，測定其各項生理指標；從植株開始出現流膠癥狀時，記錄已木質化莖干和其他部位流膠情況，低溫脅迫的第9天統計最終的流膠情況。

1.2.2 測定方法 每個時間梯度生理指標測定均選取3個植株木質化莖干韌皮部混合后設置3個重復。莖干韌皮部相對含水量和相對電導率測定參照李小琴等[25]的方法。可溶性糖(SS)和超氧陰離子(O2-·)含量采用北京索萊寶科技有限公司的試劑盒測定。可溶性蛋白(SP)含量采用考馬斯亮藍G-250法[26]測定。游離脯氨酸(Pro)[26]含量采用酸性茚三酮法測定。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[27]測定。SOD活性采用NBT光化還原法[26]測定。POD活性采用愈創木酚法[27]測定。CAT活性采用紫外吸收法[28]測定。橡膠樹流膠情況根據流膠處的形狀進行統計：采用游標卡尺測量流膠的長度、寬度等，然后計算各個處理的已木質化莖干和其他部位的點狀和條形流膠的總面積。

1.3 數據處理

所有試驗數據為3次重復測定的平均值，采用Excel 2007軟件對進行數據處理與分析，并采用Origin Pro 2018軟件進行繪圖，多重比較采用Duncan新復極差法。

2 結果與分析

2.1 不同處理對低溫脅迫下橡膠樹莖干韌皮部相對含水量和相對電導率的影響

低溫下，植株的吸水量減少，在低溫脅迫的開始，植株主要通過降低含水量來達到抵御低溫的目的。如圖1所示，在低溫脅迫2～5 d的過程中，植株相對含水量(RWC)呈下降的趨勢。后期，由于植物對低溫脅迫的適應性，5～8 d過程中，植株的RWC又有所升高。由于復配割面涂封劑可以有效提高細胞液濃度，維持細胞的滲透壓，減緩低溫脅迫下橡膠樹莖干韌皮部RWC的降低，所以，T2的植株RWC與T1和CK相比，效果達到了顯著(P<0.05)或者極顯著水平(P<0.01)，低溫處理2、5、8 d，T2分別比T1和CK提高了4.24%、4.35%、1.88%和5.98%、6.44%、4.51%。

圖1 不同處理對橡膠樹莖干韌皮部相對含水量和相對電導率的影響

植物組織相對電導率的大小反映了其細胞電解質滲出相對含量的高低。不同處理在低溫脅迫2～8 d過程中，低溫脅迫的開始，植株對低溫具有一定的適應性，但是隨著低溫時間的延長，植株細胞膜出現了一定的損傷，所以細胞液部分外漏，與植株莖干韌皮部RWC的變化趨勢一致，植株莖干韌皮部REC呈先下降后升高的變化趨勢。由于T2的效果較優，有效緩解了細胞電解質的滲出量，從而減緩了橡膠樹莖干韌皮部REC的升高，與T1和CK相比，低溫處理2、5、8 d時，分別降低35.32%、21.38%、21.44%和40.00%、35.40%、22.13%，差異均達到了極顯著水平(P<0.01)。

數值為3個數值的平均值，誤差棒為標準差，小寫字母表示處理間存在顯著差異(P<0.05)，大寫字母表示處理間存在極顯著差異(P<0.01)。下同。

2.2 不同處理對低溫脅迫下橡膠樹莖干韌皮部滲透調節物質含量的影響

低溫下，植物細胞產生Pro、SP、SS等一系列滲透調節物質，其中游離脯氨酸可以穩定植物組織代謝和細胞原生質體的膠體狀態，降低植物的冰點；可溶性蛋白可以提高細胞保水能力；可溶性糖可以維持植物細胞膨壓。低溫處理2～5 d，植株細胞外滲減少，組織中Pro外滲減少，所以，Pro先呈現下降的趨勢，隨著低溫脅迫時間的延長，細胞有了一定的損傷，組織外滲有所增加，所以Pro含量又有所增加。

由圖2可知，經不同試劑處理后，植株莖干韌皮部游離Pro含量呈先下降后上升的趨勢。低溫2～5 d過程中，由于植株自身的保護作用，細胞含水量降低，組織中SP和SS含量增加，隨著5～8 d低溫環境的延續，SP結構被破壞，SS發生降解，因而植株莖干韌皮部中SP和SS含量又呈現了下降趨勢。由于T2可以有效提高橡膠樹莖干韌皮部游離Pro、SP、SS等滲透調節物質的含量，有效地避免了低溫對植株的損傷，與T1和CK相比，Pro、SP、SS含量差異均達到了顯著(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)。

圖2 不同處理對低溫脅迫下橡膠樹莖干韌皮部滲透調節物質的影響

2.3 不同處理對低溫脅迫下橡膠樹莖干韌皮部產生活性氧的影響

低溫脅迫造成植物體內氧代謝的加速，植物就會產生大量包含O2-·在內的活性氧物質，MDA是植物細胞膜脂過氧化的產物，它的含量體現了細胞膜受損的程度，低溫脅迫下，由于植株膜系統受低溫脅迫的影響，橡膠樹植株組織中O2-·和MDA的含量逐漸上升。后期，由于植株組織滲透調節物質的產生，對植株細胞膜系統產生了一定的保護作用，MDA和O2-·的含量又逐漸降低。但是，與T1和T2不同的是：CK可能是滲透物質含量較低的原因，導致O2-·含量一直呈現上升的趨勢。

由圖3可知，不同試劑處理后，在低溫脅迫2、5、8 d時，T2植株莖干韌皮部中的MDA含量，T2分別比T1和CK降低40.26%、34.95%、34.00%和48.46%、49.31%、53.48%，差異均達到極顯著水平(P<0.01)。植株莖干韌皮部的O2-·含量，T2分別比T1和CK降低45.87%、23.14%、32.03%和56.64%、31.29%、43.93%，差異均達到極顯著水平(P<0.01)。以上結果表明，T2在降低低溫脅迫下，橡膠樹莖干韌皮部的MDA和O2-·含量方面，效果優于T1和CK。

圖3 不同處理對橡膠樹莖干韌皮部丙二醛和超氧陰離子含量的影響

2.4 不同處理對低溫脅迫下橡膠樹莖干韌皮部活性氧清除相關酶類的影響

逆境下，為了避免植物產生的活性氧(ROS)對生物系統的氧化傷害，植物細胞會產生一系列酶類抗氧化劑來克服活性氧的毒性。SOD可以有效清除植物細胞內O2-·的含量，從圖4可知，SOD活性隨著低溫脅迫的延長而呈現下降的趨勢，與圖3中的O2-·含量變化并不一致，可能是SOD清除了大量超氧陰離子而致使SOD的活性有所下降的緣故，T2分別比T1和CK高出16.81%、1.85%、10.70%和97.37%、19.04%、13.77%，差異達到顯著(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)。POD可以有效降低因低溫脅迫而產生的氧自由基，POD活性的變化趨勢與MDA含量的變化趨勢一致，這證明了POD在降低氧自由基對細胞膜過氧化中的作用，T2的橡膠樹莖干韌皮部POD分別比T1和CK高41.58%、41.79%、38.07%和1.23倍、1.29倍、1.20倍。CAT可以有效分解H2O2。CAT活性的變化趨勢與POD活性的變化趨勢一致：先上升后下降，T2分別比T1和CK高出1.83倍、47.93%、63.56%和3.48倍、2.07倍、2.34倍，差異達到顯著(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)。以上結果表明，與T1、CK相比，在提高低溫脅迫下橡膠樹莖干韌皮部活性氧清除系統中SOD、POD和CAT等相關酶活性方面，T2的效果更佳。

圖4 不同處理對低溫脅迫下橡膠樹莖干韌皮部SOD、POD、CAT活性的影響

2.5 不同處理對低溫脅迫下橡膠樹流膠的影響

低溫脅迫的第4天，植株開始出現流膠癥狀，低溫脅迫的第8天，植株流膠癥狀達到頂峰。流膠多出現在植株莖干的葉痕處、未木質化的復葉葉柄處及幼嫩莖干處。對于已木質化莖干，T2流膠個數比T1和CK均減少83.33%，T2流膠面積比T1和CK分別減少90.97%和98.81%；對于其他部位，T2流膠個數比T1和CK分別減少20.00%和65.22%，T2流膠面積比T1和CK分別減少91.37%和53.37%(表1)。由此可知，低溫脅迫下，T2既有效降低了橡膠樹涂抹復合涂封劑的流膠癥狀，也促進了未涂抹部位抵御寒害的能力，降低了未涂抹部位流膠癥狀的發生。

表1 低溫脅迫下調節劑使用對橡膠樹流膠的影響

3 結論與討論

寒害作為中國天然橡膠樹種植區主要的氣象災害之一，也是中國植膠區特有的主要限制性因子[29]。由于氣候的變化，橡膠樹寒害發生總體呈逐年減少的趨勢。但是，不斷增加的極端天氣事件致使嚴重或特重的橡膠樹寒害呈上升的趨勢，天然橡膠的產量面臨巨大的挑戰[30]，主要體現在以下2個方面：一是全球變暖造成的樹體物候期提前所遭遇的突如其來的寒害，二是全球變暖引起的植膠區北移而增加的遭受寒害的風險[3]。橡膠樹寒害樹冠受寒癥狀為嫩葉枯焦，葉片、枝條干枯，莖干受害表現為黑斑，外層或整個樹皮受害，嚴重出現爆皮流膠和由于莖基流膠的“爛腳”癥狀[31]。橡膠樹爆皮流膠可能發生在樹體的所有部位，但是由于橡膠樹生產的特殊性，樹干爆皮流膠危害最嚴重。因此，如何采取相應的栽培技術措施以減少流膠癥狀的發生和探索橡膠樹耐受低溫脅迫的機理，對橡膠樹的抗寒栽培至關重要。生產中常用割面涂封劑在橡膠樹停割后對割面進行涂封，以達到橡膠樹對寒害的預防，但是，大多數市售的割面涂封劑僅由成膜劑、單一生長調節劑與各種植物油脂混配而成，主要是通過生長調節劑促進樹體生長及油脂膜使割面與外界隔離起到物理防護作用，只能使樹體進行被動地防御寒害。在本研究中，復配割面涂封劑可以誘導樹體自身抵御低溫脅迫的各種機制，有效促進橡膠樹的冷馴化，并降低了低溫脅迫下橡膠樹植株流膠癥狀的發生，對于實際生產具有重要的應用依據。

橡膠樹抗寒生理研究的早期，組織含水量、細胞透性、代謝過程中清除自由基的酶類、起滲透調節作用的有機物質等生理指標就已作為評價橡膠樹抗寒能力的基本參數[2]。低溫脅迫發生時，生物膜的膜相從液晶相轉變為凝膠相，細胞外部滲透壓膨脹，膜上產生更多的諸如超氧陰離子、過氧化氫等的氧自由基，加快了膜脂過氧化產物MDA的積累，致使膜發生破裂，膜透性增加，膜內攜帶水的可溶性滲透物質滲出，植物含水量降低，植物組織相對電導率上升[32]。由于ABA是植物水分平衡和脅迫適應的重要調節因子，明顯增強植物抗氧化防御系統，增加植物滲透調節物質含量，激發植物對低溫等逆境的適應性響應，引發植物冷馴化，提高植物抗寒性[33-34]。Rouhollah等[35]在外源ABA對“Sultana”葡萄低溫脅迫下影響的研究中，發現ABA可以提高低溫脅迫下“Sultana”葡萄葉片相對含水量、可溶性糖、脯氨酸和總酚化合物的增加，降低相對電導率。魯榮海等[36]在脫落酸處理對低溫脅迫下茄子幼苗生理生化影響的研究中，發現噴施不同濃度的ABA處理均能提高低溫脅迫下茄子幼苗SOD、POD、CAT的活性，增加其SS、SP的含量，降低其REC和MDA含量，促進茄子幼苗在低溫下的生長，緩解低溫對茄子幼苗的傷害，并提高茄子幼苗對低溫脅迫的抵御能力。殼聚糖是甲殼素經強堿脫乙酰的產物，也叫甲殼胺，在農業生產中應用較為廣泛，可以有效提高作物抗逆性[37]。殼聚糖(chitosan)可以降低低溫脅迫玉米幼苗的MDA含量和REC，提高SS和Pro含量，提高過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性，從而提高其抵御低溫的能力[38]。王沛等[39]在噴施殼聚糖對核桃抗凍性影響的研究中，發現外源殼聚糖可以顯著提高核桃枝條內SOD、CAT、POD活性及Pro含量，提高核桃樹的抗寒性。劉術均等[40]發現葉面噴施殼聚糖溶液可以有效地提高低溫脅迫下茄子幼苗的Pro、SS含量，提高SOD、CAT、POD的活性，延緩細胞質膜過氧化的進程，維持細胞膜的完整性，最終降低其低溫冷害指數，提高茄子幼苗抵御低溫的能力。Ca2+是植物在非脅迫和脅迫條件下生長發育必需的基本元素，它具有構造元素(細胞壁、細胞膜的結構成分)和第二信使的雙重作用。黃玉婷等[41]為了解鈣離子信號通路與茶樹抗寒性之間的關系，采用人工模擬低溫和外源施用鈣調素(CaM)抑制劑、鈣信號通道抑制劑和CaCl2，測定茶樹葉片抗寒相關生理指標，結果表明：鈣調素抑制劑和鈣信號通道抑制劑使低溫脅迫下茶樹SOD活性降低；外源Ca2+則提高了其SOD活性。廉潔等[42]在CaCl2對低溫脅迫下番茄幼苗的影響中發現，外源CaCl2維持了低溫脅迫下植株內部SOD、POD活性穩定，清除植株體內過量氧化物，對抗冷脅迫對植株造成的損害，從而提高耐冷型番茄品種應對冷脅迫的能力。但這些研究均局限于單一物質對植物抗寒生理的影響。在本研究中，復合割面涂封劑由ABA、殼聚糖、CaCl2復配而成，處理橡膠樹植株后，維持了低溫脅迫下韌皮部細胞RWC，減緩了電解質滲出率REC的升高，降低了活性氧物質O2-·含量和膜脂過氧化物的MDA含量，增加了滲透調節物質Pro、SP、SS的含量，增強了抗氧化系統中SOD、POD、CAT的活性，保護了脂膜系統，降低了低溫對植株的傷害，提高了植株抵御寒冷的能力，從而降低了植株流膠癥狀的發生率，因此，新型割面涂封劑有效提高了植株的抗寒性。

有機物(激素或非激素)與無機物復配的抗寒調節物質是利用它們相互間的協同誘導效應，激發植物一系列生理生化反應，從而提高植物抗寒性。復配劑的效果優于單一抗寒調節物質，在棉花[43]、玉米[44]、油菜[45]等作物上均有報道。本研究中所用的抗寒調節物質是基于ABA[9]與殼聚糖[19]在提高橡膠樹抗寒性的基礎上，與無機物CaCl2混配，結合ABA在植物冷馴化、殼聚糖在作物抗寒及CaCl2在植物逆境脅迫中的有效調節作用，有效增強了橡膠樹植株質膜的相對穩定性，維持了組織的水分平衡，促進了其抗氧化防御系統的作用，最終提高了低溫脅迫下橡膠苗的抗寒性，有效降低了植株因低溫造成流膠癥狀的發生率，對橡膠樹新型割面涂封劑的研發、抗寒栽培措施的實施及抗寒機理探索提供了重要的理論依據。