天然植物提取物工藝優化及防腐抑菌效果研究

劉維兵 楊 林 包曉瑋

1.青島德慧海洋生物科技有限公司 山東青島 266000

2.新疆農業大學食品科學與藥學學院 新疆烏魯木齊 830000

肉類制品因含有豐富的營養物質，且存在殺菌不徹底的情況，極易發生腐敗變質。與其它防腐保鮮技術相比，添加防腐劑對肉制品進行防腐保鮮，具有操作簡便、成本低廉的優點，是肉制品加工中經常使用的方法。目前市面上防腐劑大多為化學防腐劑，過量使用極易產生毒副作用，因此需要一種無毒副作用，且能達到抑菌防腐作用的天然防腐劑。近年來，從天然植物中提取的有效活性物質被驗證抑菌譜廣，可以有效地抑制肉類產品中微生物的生長，應用于肉類產品中可以滿足人類對綠色、健康、安全的產品需求[1，2]。

目前從天然植物提取物中提出的有效活性物質又被稱作為“植物源”，從天然植物中提出的單體成分，如茶多酚等單獨使用無法做到廣譜抑菌，且抑菌防腐效果一般，添加量小無法達到抑菌效果，而添加量增大又會影響肉制品的感官品質[3～6]。

本試驗采用粗獷提取方法，從多種天然植物中提取各種有效活性成分。以總黃酮為評價指標，通過不斷優化提取工藝參數，最終得到一款天然植物抑菌劑，通過驗證該天然植物抑菌劑具有抑制肉制品中微生物生長的作用，且能延緩肉制品中揮發性鹽基氮含量的增長速率[7～9]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

決明子，青島德慧海洋生物科技有限公司；

迷迭香、刺梨根、刺山柑，新疆農業大學；

沙棘種皮，青河縣惠華商貿有限公司；

綠茶，嶗山區山海游農漁特產經銷處；

雞胸肉，青島市城陽蔬菜水產品批發市場；

平板計數培養基，上海保藏生物技術中心；

化學試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 設備、儀器

電子天平LE2002E/02，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

旋轉蒸發器RE-3000E，上海耀特儀器設備有限公司；

立式高壓滅菌器LDZX-50KBS，上海申安醫療器械廠；

生物安全柜HR40-IIA2，青島海爾特種電器有限公司；

紫外-可見分光光度計TU-1810，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 試驗方法

將天然決明子種子胚芽、迷迭香地上部分、刺山柑、刺梨根、沙棘種皮、綠茶等分別粉碎，過60目篩分離雜質，按質量比1∶1∶1∶1∶1∶1，混勻備用。

1.2.1 設計天然提取物單因素試驗

1.2.1.1 提取溫度對總黃酮含量的影響

依據以往研究，控制超聲提取時間為3h，料液比為1∶30，乙醇濃度為65%，將超聲提取溫度分別設為20、35、50、75、90℃。提取結束后測定提取物的總黃酮含量確定最佳提取溫度。

1.2.1.2 提取時間對總黃酮含量的影響

控制超聲提取溫度為50℃，料液比為1∶30，乙醇濃度為65%，將超聲提取時間分別設為1、2、3、4、5h。提取結束后測定提取物的總黃酮含量確定最佳超聲提取時間。

1.2.1.3 料液比對總黃酮含量的影響

控制超聲提取時間為3h，超聲溫度為50℃，乙醇濃度為65%，將料液比分別設為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50。提取結束后測定提取物的總黃酮含量確定最佳料液比。

1.2.1.4 乙醇濃度對總黃酮含量的影響

控制超聲提取時間為3h，超聲溫度為50℃，料液比為1∶20，將乙醇濃度分別設為35%、50%、65%、80%、95%，提取結束后測定提取物的總黃酮含量確定最佳料液比。

1.2.2 設計天然提取物正交試驗

根據單因素試驗結果，影響總黃酮含量的主要因素有提取溫度、提取時間、料液比、乙醇濃度。故以此四因素設計L9(34)正交試驗，以提取物中總黃酮含量為評價指標，確定提取的最佳工藝條件(見表1)。

表1 L9(34)正交試驗的因素與水平

1.2.3 天然植物提取物總黃酮含量測定

天然植物提取物中黃酮含量的測定采用改良比色法。將萃取液或(+)兒茶素標準溶液的樣品(0.25mL)與蒸餾水(1.25mL)在試管中混合，然后加入5%NaNO2溶液(75mL)。靜置5min后，加入10%AIC13.6H2O溶液(150mL)，然后將混合物靜置另外6min，加入1M NaOH(0.5mL)。用蒸餾水將混合物稀釋至2.5mL，并充分混合。與類似制備的含有已知(β)-兒茶素濃度的標準品相比，立即用分光光度法在510nm處對空白進行了吸光度測量。

1.2.4 天然植物提取物抑菌防腐測定試驗

取20mL天然植物提取液，按體積比1∶10加入無菌生理鹽水進行稀釋，取100g雞胸肉，將雞胸肉浸泡在天然植物提取稀釋液中20min，文火煮熟取出雞胸肉再次浸泡20min，對照組采用同體積的生理鹽水浸泡處理，置36℃霉菌培養箱中貯藏。

1.2.4.1 天然植物提取物抑制雞肉中菌落總數試驗

每隔24h取肉樣2g溶于200mL無菌生理鹽水中，做梯度稀釋，取稀釋液200μL涂布于平板計數培養基上，48h后觀察菌落總數。

1.2.4.2 雞肉中揮發性鹽基氮含量測定試驗

稱取2～5g試樣(精確到0.0001g)于50mL具塞錐形瓶中，加蒸餾水30mL，旋渦振蕩10min，4 000r/m離心10min，上清液為樣液，取20mL的2%硼酸溶液于150mL錐形瓶中，加混合指示劑2滴，使凱氏蒸餾裝置的冷凝管末端浸入此溶液,蒸餾裝置的蒸汽發生器的水中應加甲基紅指示劑數滴，硫酸數滴，且保持此溶液為橙紅色，否則補加硫酸，準確移取10mL樣液注入蒸餾裝置的反應室中，用少量蒸餾水沖洗進樣入口，塞好入口玻璃塞，再加入10mL的氧化鎂溶液，小心提起玻璃塞使其流入反應室，將玻璃塞塞好，且在入口處加水封好，防止漏氣，蒸餾10min，使冷凝管末端離開吸收液面，再蒸餾1min，用蒸餾水洗冷凝管末端，洗液均流入吸收液，吸收氨后的吸收液立即用0.01mol L鹽酸標準液滴定，溶液由藍綠色變為灰紅色為終點，同時進行試劑空白測定。按照公式(1)進行計算。

(1)

式中：

X—樣品中揮發性鹽基氮的含量，mg/100g；

V1—滴定試樣時所需鹽酸標準溶液體積，mL；

V2—滴定空白時所需鹽酸標準溶液體積，mL；

c—鹽酸標準溶液濃度，mol/L；

m—試樣重量，g；

V—試樣分解液蒸餾用體積，mL；

V0—樣液總體積，mL；

14—與1.00mL鹽酸標準滴定溶液[c(HCI)=1.000mol/L]相當的氮的質量，mg。

1.3 數據處理

每次實驗均進行3次重復操作，所有實驗數據采用SPSS 16.0 統計軟件對結果進行顯著性分析，處理結果均以X±SD表示，圖表制作利用Excel 2003軟件。

2 結果與分析

2.1 提取溫度對總黃酮含量的影響

如圖1所示，隨提取溫度的升高，總黃酮含量也在不斷上升。當提取溫度升高到50℃時，隨著提取溫度的不斷上升，總黃酮含量反而出現下降的趨勢；提取溫度在50℃時，總黃酮含量達到最高峰。故將提取溫度初步定為50℃。

圖1 提取溫度對總黃酮含量影響

2.2 提取時間對總黃酮含量的影響

如圖2所示，隨提取時間的延長，總黃酮含量也在不斷上升；當提取時間延長到3h時，隨著提取時間的再次延長，總黃酮含量基本保持不變。故將提取時間初步定為3h。

圖2 提取時間對總黃酮含量影響

2.3 料液比對總黃酮含量的影響

如圖3所示，隨著溶劑液體的不斷增大，總黃酮提取含量在不斷下降，當料液從1∶10減小到1∶20時，總黃酮含量基本保持不變；但將1∶20的料液比繼續稀釋，總黃酮含量出現下降趨勢。故初步將料液比定位1∶20。

圖3 料液比對總黃酮含量影響

2.4 乙醇濃度對總黃酮含量的影響

如圖4所示，隨著乙醇濃度的不斷增大，總黃酮提取含量也在不斷上升，但當乙醇濃度達到65%時，出現拐點；隨著乙醇濃度的繼續增長，總黃酮含量反而出現下降的趨勢。故初步將乙醇濃度定為65%。

圖4 乙醇濃度對總黃酮含量影響

2.5 正交結果分析

通過分析試驗極差值可以看出(見表2)，影響提取物總黃酮含量的因素主次順序為A>B>D>C，提取溫度為主要控制因素，其次是提取時間，最優組合是A2B3C1D2。綜合來說，對因素A、B、C、D分析，確定優水平為A2、B3、C1、D2。以最佳工藝A2B3C1D2進行驗證試驗，得出提取液總黃酮含量為8.26g/100mL。故選擇配方為A2B3C1D2為最佳配方，即提取溫度為50℃，提取時間為4h，料液比為1∶20，乙醇濃度為65%。

表2 L9(34)正交實驗設計與結果

3 總結

天然植物提取物的最佳工藝條件為，提取溫度為50℃，提取時間為4h，料液比為1∶20，乙醇濃度為65%，得出提取液總黃酮含量達到最大值為8.26g/100mL。應用天然植物提取物的肉制品，TVB-N、菌落總數與對照組相比顯著降低(p<0.01)。天然植物提取液具有明顯抗菌活性。