廣泛型線粒體肌酸激酶基因在結直腸癌中的表達及生物學意義

唐興奎，林玉坤，何嘉琳，羅喜俊，梁俊杰，朱顯軍

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球范圍內影響人類健康與生活質量的常見惡性胃腸道腫瘤之一。據統計分析，結直腸癌占所有惡性腫瘤死亡原因的第5位［1］。目前，結直腸癌的根治性治療方法迄今仍首推外科手術治療，然而其5年生存率僅為50%左右［2］。全身放化療是中晚期結直腸癌腫瘤患者手術前新輔助和術后治療的標準有效的方法之一，但藥物不良反應大并且容易產生耐藥而導致治療效果差甚至失敗［3］。腫瘤復發轉移是治療失敗的關鍵原因，因此，分析結直腸癌的生物學特性，探索其復發轉移機制具有重要的臨床價值。

腫瘤的發生發展過程中，腫瘤細胞往往需要攝取大量的能量以維持其快速增殖代謝特性，而肌酸激酶（Creatine kinase，CK）則是細胞能量代謝中的關鍵酶，可逆地催化磷酸基團從三磷酸腺苷向肌酸的轉移。目前在哺乳動物中已發現了五種不同的亞型的CK，包括在細胞質中有的CKB（腦型），CKM（肌肉型）和CKMB（混合型），以及線粒體中普遍存在的線粒體肌酸激酶（uMtCK）和線粒體肌酸激酶（sMtCK）［4?6］。uMtCK作為細胞能量穩態的中央控制器，可與許多細胞中的胞質CK共表達，特別是在腦，胎盤，腎臟，睪丸，精子和內皮細胞等高能量需求的組織中［4，5］。既往研究發現：uMtCK在肺癌、胃癌、前列腺癌及乳腺癌等腫瘤中呈高表達狀態，并且與腫瘤細胞的增殖、凋亡、轉移能力息息相關［6-12］。然而，目前尚缺少uMtCK對結直腸癌生物學作用影響的報道，本文將探究uMtCK在結直腸癌組織中的表達特點，并研究其對結直腸癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響及潛在機制。

1 資料與方法

1.1 組織標本

選取2017年01月至2019年12月期間在我院行結直腸癌根治性手術的患者60例，收集其新鮮癌組織和配對癌旁組織標本以及臨床資料。

1.2 主要試劑和儀器

RNAiso Plus（9180）、逆轉錄試劑盒（RR036）、熒光定量PCR試劑盒（RR820）購自日本Takara公司，細胞培養基、胎牛血清及Matrigel膠均購自美國Corning公司，CCK?8細胞增殖試劑盒（KGA317）、細胞周期檢測試劑盒（KGA512）購自上海凱基公司，PI3K、AKT、p?AKT、mTOR、p?mTOR、GAPDH兔抗人單克隆抗體購自美國CST公司。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR反應RNAiso Plus提取組織或細胞的總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將總RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行目的基因的實時熒光定量PCR反應。反應條件設置：預變性95℃30 s，共40個循環（95℃5 s，65℃30 s，95℃5 s）。引物序列由上海生工公司合成：uMtCK引物上游：5′?CTACTCCAGGATCCCGTAGC?3′，uMtCK引物下游5′?TCGGAGGTCTGGGTACTCAG?3′；GAPDH引物上游：5′?CTCCTCACAGTTGCCATGTA?3′，下游5′?GTTGAGCACAGGGTACTTTATTG?3′。采用2?ΔΔCT法計算目的基因相對表達水平，內參為GAPDH。

1.3.2 細胞培養與轉染人正常結直腸粘膜細胞（FHC）以及結直腸癌細胞（HT?29、SW620、LoVo、HCT116、RKO、SW480）置于37℃5% CO2培養箱中進行培養，均使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基。

收集處于對數生長期的結直腸癌細胞接種于6孔板（5×105/孔），按照Lipofectamine 3000說明書進行小干擾RNA（siRNA）轉染處理，實驗分組為si?NC、si?uMtCK?1和si?uMtCK?2。

1.3.3 CCK?8細胞增殖實驗采用CCK?8法進行細胞增殖實驗。收集轉染24 h后的結直腸癌細胞接種于96孔板（1000/孔），分別接種后24 h、48 h、72 h加入10μL CCK?8試劑，避光孵育2 h，450 nm波長下測定OD值，繪制生長曲線。

1.3.4 Transwell實驗采用Transwell法分別檢測細胞遷移和侵襲。收集轉染48 h后的結直腸癌細胞，以不含胎牛血清的DMEM培養基重懸細胞，按2×105/100μL接種于Transwell培養板上室（侵襲實驗所用上室經10% Matrigel膠預包被處理），下室加入500μL含10%胎牛血清的DMEM培養基，培養24 h后取出小室，4%多聚甲醛固定細胞，0.5%結晶紫溶液染色，顯微鏡下選取隨機選擇5個高倍視野進行拍照，統計細胞數量。

1.3.5 Western blot實驗收集轉染48 h后的結直腸癌細胞，提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量，取等量的蛋白樣品進行SDS?PAGE電泳，接著電轉至PVDF膜，分別進行5%脫脂奶粉封閉非特異性抗原，PI3K（1∶1000）、AKT（1∶1000）、p?AKT（1∶1000）、mTOR（1∶1000）、p?mTOR及GAPDH（1∶5 000）等一抗孵育過夜，次日孵育HRP標記的二抗（1∶5 000），ECL試劑發光顯色后進行半定量分析。

1.4 統計學分析

統計學分析采用GraphPadPrism 7.0軟件。計數資料比較則采用卡方檢驗，計量資料中兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD?t檢驗。生存分析采用Kaplan?Meier法，組間比較采用log?rank檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 uMtCK高表達與結直腸癌患者的預后有關

為了驗證uMtCK高表達與結直腸癌患者臨床病理特征和生存時間的相關性，我們收集了上述臨床病例的病理特征資料和隨訪資料，并分析uMtCK表達量與臨床病理特征和生存時間的關系。結果表明：uMtCK在結直腸癌中呈高表達現象（圖1A）；Kaplan?Meier生存分析顯示，高表達uMtCK的患者無瘤生存時間較低表達者明顯縮短（圖1 B）；uMtCK高表達與T分期、N分期和TNM分期密切相關（表1）。以上結果表明，uMtCK高表達可能影響腫瘤進展，并提示患者的不良預后。

表1 uMtCK表達水平與結直腸患者臨床病理特征的相關性（n）

圖1 uMtCK高表達與結直腸癌患者的預后A：uMtCK在

2.2 uMtCK在結直腸癌細胞株表達升高

熒光定量PCR檢測5株結直腸癌細胞（HT?29、SW620、LoVo、HCT116、RKO、SW480）內uMtCK的表達，以人正常結直腸粘膜細胞（FHC）作為對照組。結果顯示，uMtCK在結直腸癌細胞中的表達均高于人正常結直腸粘膜細胞（圖2A，P＜0.001）；選擇表達水平較高HT?29和RKO細胞構建uMtCK低表達細胞模型，熒光定量PCR檢測發現，轉染siRNA后HT?29和RKO細胞內LINC00239表達顯著受到抑制（圖2B，P＜0.001），提示模型構建成功。

圖2 uMtCK在人結直腸癌細胞、正常結直腸粘膜細胞A：及siRNA轉染后的結腸癌細胞；B：中的表達情況，***P＜0.001

2.3 敲低uMtCK表達抑制結直腸癌細胞的增殖能力

為了探究uMtCK對結直腸癌細胞增殖特性的影響，我們利用uMtCK低表達細胞進行了CCK?8增殖實驗。結果顯示，si?uMtCK?1和si?uMtCK?2組細胞的增殖能力較siNC組明顯減弱（圖3，P＜0.001）。說明敲低uMtCK表達抑制細胞增殖能力。

圖3 敲低uMtCK表達對結直腸癌細胞增殖能力的影響A：HT?29細胞；B：RKO細胞；***P＜0.001

2.4 敲低uMtCK表達抑制結直腸癌細胞遷移及侵襲能力

為了探究uMtCK對結直腸癌細胞轉移能力的影響，我們通過Transwell實驗檢測發現，si?uMtCK?1和si?uMtCK?2組細胞遷徙數量和侵襲數量均較siNC組顯著減少（圖4，P＜0.001）。說明敲低uMtCK表達抑制細胞遷移及侵襲能力。

圖4 敲低uMtCK表達對結直腸癌細胞遷移及侵襲能力的影響A：HT?29細胞；B：RKO細胞；***P＜0.001

2.5 敲低uMtCK表達抑制結直腸癌細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路活性

PI3K/Akt/mTOR信號通路與結直腸癌的發生發展密切相關。為了驗證uMtCK和PI3K/Akt/mTOR信號通路活性的相關性，我們利用Western blot實驗檢測發現，si?uMtCK?1和si?uMtCK?2組細胞內PI3K、p?AKT、p?mTOR蛋白表達量較siNC組明顯下調。說明敲低uMtCK表達抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路活性（圖5）。

圖5 敲低uMtCK表達對結直腸癌細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路活性的影響A：HT?29細胞；B：RKO細胞；***P＜0.001

3 討論

惡性腫瘤的發生是由于促癌基因被激活和/或抑癌基因下調/失活所誘發，近年研究發現，腫瘤組織和正常組織中不同基因表達量存在顯著差異，提示其在腫瘤演進過程中起著重要作用，既可能是促癌基因的推動腫瘤演進的重要因素，又可能對腫瘤演進起到抑制作用［13］。同樣地，部分特異基因可通過各種機制的表達失調參與結直腸癌的演進，與腫瘤演進及復發轉移密切相關，有望成為具有結直腸癌診斷、治療及預測預后的生物學標志物［14］。本研究首次發現uMtCK高表達于結直腸癌組織，其表達量與患者的腫瘤分期存在緊密聯系，高表達uMtCK提示患者無瘤生存率降低。因此，我們認為uMtCK是結直腸癌潛在的促癌基因，有望成為新型的腫瘤標志物和預后判斷指標。

分子蛋白可在結直腸癌組織中構建復雜而又精密的調控體系，其表達失調能夠引起結直腸癌細胞內的各種生物學變化，在不同層次精細的調控腫瘤細胞的增殖、分化和轉移［15］。已有研究顯示，uMtCK高表達能夠促進乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤的增殖或轉移能力［6-12］。本研究也發現uMtCK能夠調控結直腸癌細胞的增殖特性，敲低uMtCK表達能夠降低結直腸癌細胞的增殖能力，提示靶向抑制uMtCK表達可以發揮抗腫瘤作用。腫瘤細胞遷移和侵襲是惡性腫瘤的關鍵特征，是導致惡性腫瘤患者死亡的直接因素［16］。本研究揭示uMtCK是結直腸癌細胞遷移和侵襲的重要調控因子，敲低uMtCK表達可以同時抑制結直腸癌細胞的遷徙及侵襲能力。

研究發現，PI3K/Akt/mTOR信號通路在腫瘤細胞轉移復發過程中發揮關鍵作用［17］。PI3K是PI3K/Akt信號通路關鍵蛋白之一，它廣泛存在于各類腫瘤細胞，參與調節腫瘤細胞的生長、遷移、侵襲等惡性生物學行為［18］。PI3K/Akt/mTOR信號通路傳導鏈上另一個關鍵性調節蛋白是Akt，它是PI3K最重要的下游底物，當PI3K被誘導激活后，腫瘤細胞的細胞膜將迅速產生PIP3蛋白，PIP3蛋白充當第二信使，它和腫瘤細胞內與生長因子受體后，進一步促進Akt蛋白磷酸化，最后使后者活化［17］。活化Akt再通過蛋白磷酸化作用激活其下游靶蛋白mTOR，最終對腫瘤細胞的增殖、周期及轉移等惡性行為發揮調節作用［19］。本研究通過Western blot檢測uMtCK低表達細胞模型中PI3K/Akt/mTOR信號通路關鍵蛋白的表達，結果發現，敲低uMtCK能夠下調PI3K蛋白及Akt磷酸化、mTOR磷酸化蛋白的表達，提示PI3K/Akt/mTOR信號通路活性受到抑制。由此可見，uMtCK在結直腸癌細胞中介導PI3K/Akt/mTOR信號通路轉導，這可能是uMtCK調控結直腸癌細胞增殖、遷徙及侵襲的分子調控機制之一，具體機制仍需進一步研究。

綜上所述，本研究首次證實uMtCK高表達于結直腸癌，其高表達與患者的腫瘤分期及臨床預后有關。更重要的是，本研究細胞實驗表明uMtCK能夠調控結直腸癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力，并揭示uMtCK與PI3K/Akt/mTOR信號通路異常激活密切相關。總的來說，本研究提示了uMtCK可能成為結直腸癌預后及靶向治療的潛在腫瘤標志物。