文冠果幼胚的組織培養(yǎng)和植株再生

張成華 于海燕 秦兆寶

摘要：本文研究了文冠果成熟胚的分生力。結(jié)果表明：文冠果幼胚接種在 MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L培養(yǎng)基上，叢生芽誘導(dǎo)率為83%。繼代增殖在MS+BA0.5mg/+NAA0.11mg培養(yǎng)基上，繁殖系數(shù)最高達(dá)4倍以上，生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS（大量減半）+IBA1.8mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖3%+瓊脂6.5g/L，生根率達(dá)87%。

關(guān)鍵詞：文冠果胚;組織培養(yǎng);植株再生

文冠果是我國北方重要的木本油料樹種，據(jù)資料報(bào)道文冠果種子含油率30-60%，種仁含油率55-60%。除種子供醫(yī)藥和食用油料外，還可作高級(jí)潤滑油、增塑劑、油漆、肥皂等工業(yè)原料，近年來亦被認(rèn)為是一種很有開發(fā)潛力的生物能源植物;油餅可提取蛋白質(zhì)和氨基酸，也可作精飼料;果皮能提取糠醛;葉子可蒸炒加工成茶葉。文冠果也是一種生態(tài)優(yōu)良的綠化觀賞樹種。

文冠果不同種源的種子含油量存在明顯差異，因此對(duì)種子含油量高的文冠果種源進(jìn)行大量繁殖，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。采用組織培養(yǎng)技術(shù)是發(fā)展大規(guī)模、快速繁殖優(yōu)良文冠果的必然選擇，加速優(yōu)樹繁殖，提高單位面積產(chǎn)量。

1 文冠果幼胚（非成熟胚）誘導(dǎo)叢生芽的發(fā)生

1.1 材料和處理

1.1.1 種源：選用選優(yōu)的當(dāng)年采摘的新鮮成熟種子。

1.1.2 種子預(yù)處理：將種胚剝離外面的種皮，種子用洗衣粉搓洗3-4次，用溫水洗滌多次，并在溫水中浸泡24小時(shí)，然后用單面刀片在外種皮上切一小口，剝開種皮，備用。

1.1.3 種仁消毒處理：將種仁放在超凈工作臺(tái)上，打開紫外燈滅菌15min，再用75%乙醇消毒1min，接著把種仁放入0.1%Hgcl2中消毒3.5min，并要輕輕搖動(dòng)燒杯，以使消毒劑與種仁充分接觸。用無菌水洗滌4次，每次沖洗時(shí)間不少于1min，最后用濾紙吸干種仁表面的水分。

1.2 啟動(dòng)培養(yǎng)基配制

從文冠果幼胚誘導(dǎo)叢生芽，選用MS培養(yǎng)基，摸索細(xì)胞分裂素（如BA）和生長素（如NAA）的最佳配比，尋找高誘導(dǎo)率的啟動(dòng)培養(yǎng)基配方。

1.2.1 啟動(dòng)培養(yǎng)基配方設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)BA和NAA兩個(gè)因子，其中BA設(shè)計(jì)7個(gè)濃度水平，NAA設(shè)計(jì)3個(gè)濃度水平。用交叉分組方法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)培養(yǎng)基組方做20瓶，每瓶放入2粒消毒的種仁。

1.2.2 培養(yǎng)條件

接入種仁后的培養(yǎng)瓶（見圖1），放培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。溫度控制在20-28℃之間，光照強(qiáng)度為2000-3000LX，每日光照14小時(shí)，20d后觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在20d培養(yǎng)的時(shí)間里，有的幼胚可長出叢生芽，有的幼胚無法誘導(dǎo)出叢生芽，有的幼胚死亡。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果列入于下（見表1）

1.2.4、對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)

同一株文冠果樹上結(jié)的種子，其基因型都各不相同，因此種子間差異是屬于無法控制、無法預(yù)料的隨機(jī)因素。而培養(yǎng)基中的BA和NAA兩因素的影響都屬于可控制、可重復(fù)的因素。因此在同樣培養(yǎng)條件下，使用同樣配方進(jìn)行的幾次實(shí)驗(yàn)，可視為重復(fù)，它們之間的差異是由隨機(jī)誤差所致。

方差分析可以驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的正確性。不過，做方差分析時(shí)，當(dāng)因素增加到3個(gè)或3個(gè)以上時(shí)，由于分析計(jì)算復(fù)雜性大増，所需實(shí)驗(yàn)次數(shù)也將以幾何級(jí)數(shù)增加。因此在方差分析中，3因素及3因素以上方差分析較少用到，一般實(shí)驗(yàn)中多用到2因素方差分析。以下是對(duì)BA和NAA兩因素方差所進(jìn)行的分析。由于BA為0.3、0.5、1.0時(shí)，都進(jìn)行了NAA三個(gè)水平實(shí)驗(yàn)。因此，就選擇了兩者相對(duì)應(yīng)的濃度水平進(jìn)行方差分析。同時(shí)由于BA為0.9和1.0時(shí)，它們濃度較近，但它們的誘導(dǎo)率差異卻是明顯的。因此，選擇了BA濃度為1.0時(shí)做方差分析。

5.32是位于4.46與8.65之間，因此F1達(dá)到顯著，而F2僅為0.67，小于4.46，因此F2屬于不顯著。NAA濃度變化對(duì)叢生芽誘導(dǎo)試驗(yàn)的影響不顯著。

該實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與已知的植物激素生理作用機(jī)理相吻合。即有BA促進(jìn)細(xì)胞分裂，組織増大，產(chǎn)生愈傷組織，誘導(dǎo)芽分化等作用;而NAA作用它既影響細(xì)胞分裂，伸長和分化，也影響影響營養(yǎng)器官和生殖器官的生長、成熟和衰老。

2 文冠果繼代培育和擴(kuò)繁

選擇生長旺盛的芽叢做繼代培育（見圖2），但是，繼代培養(yǎng)基不同啟動(dòng)培養(yǎng)基，所以必須重新進(jìn)行繼代培養(yǎng)基組方篩選。

將叢生芽生長旺盛的叢苗分割成若干單株，它都能分別進(jìn)行分化，生長出許多叢生芽。這樣，無異于從一塊“優(yōu)良”的愈傷組織，可以得到無數(shù)的繼代苗，因此也稱之為擴(kuò)繁。從幼胚分化出的叢生芽具有兩個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)：一是基型類型多，有利于優(yōu)良苗木選育;二是容易進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

2.1 繼代苗培養(yǎng)基篩選

繼代培養(yǎng)基配制的原則，基本上與誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基相同：以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用交叉分組方法尋找BA和NAA最佳組方。由于是長苗，因此仍要求 BA/NAA的高比值。其觀察比較指標(biāo)是繁殖系數(shù)，即在一代繼代培養(yǎng)中，由一個(gè)繁殖單位（如一個(gè)芽叢或芽）得到的新苗的個(gè)數(shù)。

2.2 方差分析

0.79、0.35都小于4.46和8.65，因此FA和FB均屬于不顯著。即把叢生芽塊切割后，只要在培養(yǎng)基中將BA和NAA濃度控制在一定范圍內(nèi)，基本都能促進(jìn)芽生長成新苗，但難以區(qū)分到底是BA還是NAA對(duì)小苗生長的影響更大。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)BA0.4mg/L和NAA0.8mg/L的組合對(duì)繼代苗繁殖系數(shù)影響最大。

3 文冠果繼代苗生根

將培養(yǎng)高2-3cm的繼代苗，切下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，使其長出不定根，形成完整小苗。

3.1 生根培養(yǎng)基篩選

生根培養(yǎng)基組方中，以1/2、1/4、大量元素減半三種MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，因此，根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，在文冠果幼苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，只是加入IBA并輔以NAA，誘導(dǎo)繼代苗生根，而不能加入細(xì)胞分裂素。同時(shí)，試驗(yàn)了 White、B6培養(yǎng)基，以及1/2 white組方。

在生根培養(yǎng)中，交叉分組方法配制組方。而每一培養(yǎng)基配方重復(fù)4次，每次20瓶。生根培養(yǎng)的觀察指標(biāo)是在15d以內(nèi)。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

IBA和NAA是兩種化學(xué)合成、具有生長素類似效應(yīng)的植物生長調(diào)節(jié)劑。雖然它們都具有誘導(dǎo)組培苗生根作用，但是其效應(yīng)卻并不相同：IBA作用強(qiáng)烈，作用時(shí)間長，所誘發(fā)的根多而長;而NAA誘發(fā)的根少而粗。為此，在實(shí)際應(yīng)用中，它們常搭配使用。但是，在不同物種中，IBA和NAA使用濃度各異，效果也千差萬別。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，White、B5以及1/2 white、1/4white配方都很不理想，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果，基礎(chǔ)培養(yǎng)基以1/2MS、1/4MS與IBA、NAA組合較為理想。

3.3 方差分析

由方差分析可知，4.00是位于3.63和6.23 之間，因此Fa達(dá)到顯著;而FB為2.32，小于3.63，因此FB屬于不顯著。即，在IBA和NAA在一定濃度范圍內(nèi)，IBA的濃度變化對(duì)誘導(dǎo)文冠果繼代苗影響顯著，而NAA濃度變化影響不顯著。

在本試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)文冠果繼代生根時(shí)，以NAA為0.5mg/L和IBA為1.8mg/L最為理想（見圖3）。

3.4 用正交設(shè)計(jì)尋找更佳組方

做正交設(shè)計(jì)驗(yàn)證是否IBA1.8mg/L和 NAA0.5mg/L是最佳組合。

使用L4（23）正交表做3因子2水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)表明，在上述NAA和IBA最佳配比的各種濃度配合中，繼代苗生根率皆低于IBA1.8mg/L和 NAA0.5mg/L配方。為此，可以判斷使用的一系列文冠果繼代苗生根培養(yǎng)基中，該配方為最佳配方。

4 文冠果的組培苗移栽

4.1、馴化煉苗

我們選擇3-5條生根良好的健壯苗，打開瓶蓋，在室溫下馴化鍛煉一周，濕度在50-60%，溫度保持在18-28℃。

4.2、基質(zhì)準(zhǔn)備

將基質(zhì)經(jīng)太陽暴曬一天，按照珍珠巖+草碳土=2：8混合均勻，混合時(shí)加入殺菌劑進(jìn)行消毒。

4.3、移栽

取出小苗，去凈根部的培養(yǎng)基，用800倍的百菌清溶液速蘸，ABT1號(hào)400ppm生根溶液速蘸進(jìn)行處理，深栽淺埋，不要握根，栽入營養(yǎng)缽進(jìn)行培養(yǎng)。移栽后澆少量水，搭上拱形棚，蓋上遮陰網(wǎng)，保持濕度在75-90%，溫度在20-30℃，培養(yǎng)10d左右，根系生長出新的根，葉片增加，慢慢進(jìn)行通風(fēng)和去掉遮陰網(wǎng)，進(jìn)行噴施植物生長調(diào)節(jié)劑GGR6號(hào)10ppm溶液葉面肥料，促使生長健壯，有利于快速出圃。

4.4、移入大田苗圃

1個(gè)多月后，小苗長的粗壯、旺盛，移入苗圃可以大田栽種。

用文冠果的幼胚通過不同組方進(jìn)行快繁培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了良好的繁殖系數(shù)，為文冠果大規(guī)模化生產(chǎn)提供了可靠的理論和技術(shù)服務(wù)，同時(shí)為我們實(shí)現(xiàn)文冠果組培工廠化育苗鋪了一條新路。

參考文獻(xiàn)

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課題項(xiàng)目：“十二五”國家科技支撐計(jì)劃“生物質(zhì)液體燃料資源植物品種選育和豐產(chǎn)栽培技術(shù)示范”課題（2011BAD22B08）。

作者簡介：張成華 （1973.10-）、女、漢族、中級(jí)農(nóng)藝師、主要從事植物的組織培養(yǎng)研究與繁育工作27年。