禽腺病毒4型Fiber-2蛋白原核表達及間接ELISA的構建

潘靜，孟凱，秦曉冰

（1.青島農業大學動物醫學院/山東省預防獸醫學重點實驗室，山東 青島 266109；2.山東省農業科學院家禽研究所，山東 濟南 250100）

2015年7月以來，以包涵體肝炎和心包內出現淡黃色透明液體為主要臨床癥狀的“雞心包積水綜合癥”（hydropericardium-hepatitis syndrome，HHS）在中國大面積暴發流行，該病是由禽腺病毒4型（fowl avianadenovirus serotype 4，FAdV-4）引起的急性傳染病，對我國家禽綠色健康養殖構成巨大的威脅和挑戰［1］。被FAdV-4感染的家禽出現急性死亡，死亡高峰集中在1周之內，死亡家禽出現典型的心包積液以及包涵體肝炎癥狀。此外，FAdV-4感染能夠導致宿主的免疫抑制，由此導致的免疫失敗、繼發感染、混合感染進一步加劇了HHS的危害［2］。目前亟待有效檢測該病毒的商業產品。FAdV-4包括3種主要結構蛋白，分別為纖突蛋白Fiber、六鄰體蛋白Hexon和五鄰體基座Penton［3］。其中FAdV-4的基因組中有2個Fiber基因開放閱讀框，能夠編碼2個Fiber蛋白——Fiber-1和Fiber-2［4］。纖突蛋白Fiber-2和六鄰體蛋白Hexon可作為免疫原性蛋白起到一定的保護作用，通過比較其保護效率發現Fiber-2蛋白的免疫原性和保護原性最好［5］。

血清學診斷技術已被用于家禽FAdV感染的檢測，其進展主要集中在ELISA檢測技術的改進上。早期間接ELISA采用全病毒作為包被抗原，但病毒抗原的制作繁瑣、低效且靈敏度和特異性低。而基于重組蛋白的ELISA方法更靈敏、特異和準確，易形成標準化并適于大規模運用［6］。

本研究以從山東省某肉雞場分離到的一株FAdV-4毒株（命名為FAdV-4 SDJN0105株，于2021年1月29日保藏于武漢大學菌種保藏中心，保藏號為CCTCC No：V202114）為模板擴增Fiber-2基因，通過原核表達Fiber-2蛋白作為包被抗原，優化反應條件，建立了FAdV-4間接ELISA抗體檢測方法，豐富了當前檢測FAdV-4的方法，為定量測定免疫雞體內抗體水平提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 病毒、血清、載體及試驗動物

禽腺病毒4型毒株SDJN0105株由本實驗室分離；FAdV-4陽性血清和陰性血清由本實驗室利用SPF雞制備和保存；雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、雞新城疫病毒（NDV）、禽白血病病毒（ALV）、H5和H9亞型禽流感病毒陽性血清由本實驗室保存；FAdV-8b陽性血清由濟南飛智生物技術有限公司惠贈；表達載體pET-30a（+）購自上海捷瑞生物工程有限公司；大腸桿菌BL21（DE3）購自北京全式金生物技術有限公司；SPF雞購自濟南斯派福瑞禽業科技有限公司。

1.2 主要試劑

DL5000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、限制性內切酶NdeⅠ和Hin dⅢ、Taq DNA聚合酶購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；質粒小提試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE電泳液、5×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、脫脂奶粉、BSA、一抗稀釋液購自碧云天生物技術有限公司；明膠購自Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司；ECL發光液購自環亞生物科技有限公司；蛋白Marker購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；無縫克隆試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；HRP標記的兔抗雞二抗購自Proteintech中國公司。

1.3 包被抗原的制備

1.3.1 SDJN0315株FAdV-4基因組提取 將病變雞的肝組織剪碎研磨，離心過濾后，稀釋1 000倍接種LMH細胞，72 h凍融細胞3次，接種下一代細胞，如此盲傳3代，收集細胞上清，用病毒基因組提取試劑盒提取FAdV-4基因組DNA，于-80℃保存。

1.3.2 Fiber-2基因克隆與優化 根據NCBI上Fiber-2基因保守區序列設計一對Fiber-2全長擴增引物，上游引物：5′-ATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGACATTC-3′，下游引物：5′-TTACGGGAGGGAGGCCGCTGGACAGC-3′。以FAdV-4基因組DNA為模板，PCR克隆Fiber-2基因。利用密碼子優化軟件MaxCodonTMOptimization Program（V13）對Fiber-2核苷酸序列進行優化，使之更易在大腸桿菌中表達。由生工生物工程（上海）股份有限公司合成含目的基因的pUC57-Fiber-2質粒，并用無縫克隆引物擴增優化后的Fiber-2基因，無縫克隆上、下游引物，分別為5′-TGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTATGCTCCG GGCCCCTAAAAGA-3′和5′-GGCCATGGCTGAT ATCGGATCCAATTCTTACGGGAGGGAGGCCGCTG GACAG-3′。本試驗所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3 pET-30a（+）-Fiber-2重組質粒的構建 將pET-30a（+）質粒經限制性內切酶NdeⅠ和Hin dⅢ酶切，經核酸電泳鑒定正確后用DNA膠回收純化試劑盒回收線性載體質粒。將線性載體質粒pET-30a（+）、目的基因Fiber-2用無縫克隆試劑盒連接，轉化到DH5α感受態細胞，挑取單克隆菌落搖菌提質粒，經PCR、瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.3.4 Fiber-2蛋白表達純化與鑒定 將測序正確的重組質粒pET-30a（+）-Fiber-2轉化到BL21（DE3）感受態細胞，挑取單克隆菌落培養，測序鑒定陽性后對其進行誘導表達。當菌液OD600值達到0.8時，加入IPTG，使之終濃度為0.2 mmol/L，15℃誘導16 h，離心收集菌體。超聲裂解，4℃離心3 min，分別取上清和沉淀，沉淀用等量PBS重懸，分別取出80μL，加蛋白上樣緩沖液煮沸后進行SDS-PAGE電泳，分析蛋白的表達方式。將表達產物通過Ni-IDA親和層析柱進行純化，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定目的蛋白濃度。純化后的蛋白用Western-Blot試驗鑒定其免疫原性，一抗用鼠源His單克隆抗體孵育，二抗用羊抗鼠抗體孵育。

1.4 Fiber-2間接ELISA方法的建立

采用方陣法優化抗原最佳包被量和血清稀釋梯度。用pH 9.6、0.05 mol/L PBS作包被液稀釋Fiber-2蛋白，使其濃度分別為1、2、4、8、10 μg/mL，包被96孔酶標板，每個濃度包被3個孔，100μL/孔，37℃放置1 h后4℃包被過夜。次日棄去孔內液體，用PBST洗滌，200μL/孔，靜置1 min后棄去拍干，重復5次。用1%BSA作封閉液，100μL/孔，37℃封閉1 h，洗滌，同上。將FAdV-4陰性血清、陽性血清分別按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800稀釋加入96孔板中，100μL/孔，每個梯度3個重復，混勻，37℃溫育30 min。洗滌拍干加入1∶10000稀釋的HRP標記的兔抗雞二抗，100 μL/孔，37℃溫育30 min。洗滌拍干加入TMB底物顯色液，37℃避光反應10 min。加入2 mol/L濃硫酸終止液，50μL/孔，15 min內讀取OD450值，并計算陽性與陰性OD450的比值（P/N值）。陽性OD450值接近1.0，陰性OD450小于0.2，且P/N值最大時為最佳抗原包被量和血清稀釋梯度。

最適抗原濃度包被96孔板后，從不同包被方式（37℃包被1 h、37℃包被3 h、4℃包被過夜）中確定最佳包被方式。以同樣的方法確定最佳封閉液（0.5%BSA、1%BSA、5%脫脂奶粉、1%明膠），最佳封閉時間（30 min、1、2 h），待檢血清和二抗最佳孵育時間（30 min、1、2 h），最佳底物顯色時間（5、10、15 min）。

1.5 陰陽性臨界值的確定

采取50只SPF雞的陰性血清，根據建立的ELISA方法對50份血清進行OD450值檢測，計算平均值）和標準方差（SD），陰陽性臨界值的判定為：大于等于+3SD）為陽性，小于為陰性［7］。

1.6 特異性試驗

利用建立的ELISA方法，以FAdV-4陽性血清為陽性對照，陰性血清為陰性對照，PBS為空白對照，以檢測陽性（經試劑盒鑒定）的NDV、IBV、IBDV、H5、H9、ALV、FAdV-8b血清為試驗組，均設3個重復孔，驗證該方法的特異性。

1.7 重復性試驗

批內重復性檢測：用制備的同一批次ELISA試劑盒檢測5份FAdV-4陽性血清和2份FAdV-4陰性血清，每個樣品3次重復，計算同一份血清樣品OD450值得變異系數，確定間接ELISA方法的批內重復性。

批間重復性檢測：對上述7份血清用不同批次的ELISA試劑盒進行檢測，每個樣品3次重復，計算同一份血清樣品OD450值得變異系數，確定間接ELISA方法的批間重復性。

1.8 臨床樣品檢測

利用建立的間接ELISA方法以陽性血清為陽性對照，以陰性血清為陰性對照，對30份疑似感染禽腺病毒4型雞的血清進行檢測，測定OD450值，同時利用PCR方法檢測相應肝臟組織，比較這兩種方法對FAdV-4感染的檢出率，間接判斷建立的間接ELISA方法的準確性。

1.9 穩定性檢測

將同一批次試劑盒4℃保存，分別在6、12、18個月后再次鑒定新鮮的血清樣品，檢測結果同PCR方法檢測相應肝臟組織比較，確定該試劑盒的保質期。

2 結果與分析

2.1 pET-30a（+）-Fiber-2重組蛋白的表達純化與鑒定

以優化的含目的基因的pUC57-Fiber-2為模板，用無縫克隆引物擴增Fiber-2基因，經核酸電泳檢測得到1 440 bp的條帶（圖1），膠回收得到純化的目的片段。用無縫克隆試劑盒將目的片段和線性載體連接轉化到表達菌，挑取5個菌落搖菌提質粒測序后與優化的Fiber-2序列進行比對，同源性為100%。將含重組質粒的BL21（DE3）菌液進行誘導表達后超聲破碎，制備上清與沉淀兩個樣品做SDS-PAGE電泳，結果（圖2）顯示在上清與沉淀中均有重組蛋白的表達，蛋白分子量為60 kDa。考慮蛋白降解、變性、復性困難等因素，只將上清中表達的蛋白做純化處理，蛋白純度為90%，濃度為0.24 mg/mL。Western-Blot試驗結果（圖3）顯示其免疫原性良好。

圖1 優化的Fiber-2基因克隆結果

圖2 SDS-PAGE分析重組蛋白上清純化結果

圖3 Western-Blot分析重組蛋白免疫原性

2.2 間接ELISA方法的建立

通過方陣優化法確定Fiber-2抗原最佳包被量為4μg/mL；最適宜包被條件為37℃包被1 h；最佳封閉液和封閉時間為0.5%BSA封閉1 h；待檢血清最佳稀釋度為1∶400，孵育時間為30 min；HRP標記的兔抗雞二抗最佳孵育時間為30 min；最佳顯色時間為10 min。

2.3 ELISA陰陽性臨界值的確定

50份FAdV-4抗體陰性血清樣品OD450值的平均值（）為0.206，標準方差（SD）為0.038，根據公式得出陰陽性的臨界值為0.320。因此，當待檢血清樣品OD450值≥0.320即可判為陽性。

2.4 特異性試驗結果

如表1所示，間接ELISA方法測定的NDV、IBV、IBDV、H5、H9、ALV、FAdV-8b血清OD450值均小于0.32，為陰性，說明本試驗建立的間接ELISA方法具有很好的特異性。

表1 特異性試驗結果

2.5 敏感性試驗結果

結果如表2所示，陽性血清按1∶6400稀釋后結果仍為陽性，說明本試驗建立的間接ELISA方法具有很好的敏感性。

表2 敏感性試驗結果

2.6 批內與批間重復性試驗結果

用建立的ELISA方法對5份FAdV-4陽性血清和2份FAdV-4陰性血清進行檢測，結果（表3）表明，批內和批間變異系數均小于5%，表明本試驗建立的間接ELISA方法具有很好的重復性。

表3 重復性試驗結果

2.7 臨床樣品檢測結果

用建立的間接ELISA方法對30份疑似感染FAdV-4雞的血清進行檢測，結果顯示28份血清陽性，2份血清陰性，與PCR鑒定結果完全一致，說明本試劑盒準確性高，結果可靠。

2.8 穩定性結果

在與PCR結果100%符合的條件下，4℃保存12個月的試劑盒結果仍可靠，證明其穩定性好，保質期長。

3 討論與結論

新型FAdV-4自2015年在我國暴發以來，給禽養殖業帶來了嚴重的危害，病雞主要表現為心包內有積液，肝臟出血，虎斑腎。目前預防該疾病的疫苗是FAdV-4滅活苗，但是免疫效果不明顯，還需要開發新型有效、成本低廉的疫苗［9］。檢測雞體內特異性抗體水平是評估疫苗免疫有效性的一個重要指標，酶聯免疫吸附試驗具有通量大、操作簡便、結果易于判定的優點，并且高效的ELISA試劑盒可快速診斷疾病，凈化種群。研制出準確度高的ELISA試劑盒是當前養雞業和科學研究領域的迫切需求［10，11］。

桿狀病毒表達系統表達的蛋白雖然具有最接近病毒的天然蛋白結構的優點，但操作程序繁瑣，成本也較高［12］。大腸桿菌表達系統表達周期短、易于培養和操作，為了降低ELISA試劑盒的成本，需要用便宜、產量高的大腸桿菌表達系統表達目的蛋白［13，14］。

ELISA一般以全病毒或病毒相關蛋白、病原特異性抗體作為包被抗原或抗體，對血清抗體及抗原進行檢測［15］。有文章指出，可用FAdV-4病毒作為包被抗原建立間接ELISA方法，但用全病毒包被增加了散毒的危險，不利于生物安全［16］。謝泉［17］利用Hexon蛋白作為包被抗原建立了間接ELISA方法，但陽性血清檢出率不高，可能是Hexon蛋白對機體刺激性不夠，未能產生相應抗原［18］。FAdV-4的短纖維蛋白是一種保護性抗原，具有誘導機體產生中和抗體的能力［19］。唐秋霞［5］比較了腺病毒4種免疫原蛋白的免疫原性，表明Fiber-2蛋白的免疫原性更高，和劉建勛等［20］的研究結果一致。

TMB作為底物與HPR作用后顯藍色，對人體安全，對光照條件的要求不高，故選TMB作為本方法的顯色底物［21］。間接法ELISA檢測方法使得信號放大，靈敏度高，而且對試劑要求小。本研究以原核表達的Fiber-2蛋白為包被抗原，建立了檢測抗體的間接ELISA方法。該方法特異性強，可重復性好，保質期長，具有良好的穩定性和準確性，可用作商品化ELISA試劑盒應用于臨床檢測、診斷和科研中。