INRA717-1B4雜交楊TAC基因CRISPR/Cas9敲除載體的構建及編輯效率檢測

郝璞，薄高峰，劉璐，白鶴鳴，吳鳳霞，周星雨，楊海峰

（內蒙古農(nóng)業(yè)大學林學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為近年來被廣泛開發(fā)應用的基因編輯工具，主要由核酸內切酶Cas9和一個單分子向導RNA（single guide RNA，sgRNA）組成，通過RNA與目標DNA的互補配對，Cas9蛋白在目標序列進行特異切割，造成DNA雙鏈斷裂，通過激活細胞自身修復機制——非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HR）來實現(xiàn)基因敲除、插入以及染色體重組等，最終導致隨機突變的產(chǎn)生［1］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)最早應用于動物和微生物中，后證實在水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、煙草（Nicotiana benthamiana）、高粱（Sorghum bicolor）、玉米（Zea mays）等植物中也能實現(xiàn)定點編輯［2-8］；之后宋時奎等［9］整理了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在單子葉和雙子葉植物中基因組定點編輯的案例，得出該系統(tǒng)在植物基因組進行定點編輯的可行性，特別是由于嵌合sgRNA的成功設計，使其應用更加簡單方便。此后CRISPR/Cas9被應用于各個領域，在動植物基因功能驗證、農(nóng)作物性狀改良以及人類疾病治療方面展現(xiàn)出了巨大的發(fā)展前景［10，11］。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)是分子育種學上革命性的技術突破，也是現(xiàn)代基因組學靶向修飾工作的巨大進步［12］。

INRA717-1B4雜交楊（Populus tremula L.×P.alba L.），屬白楊派落葉喬木，具有基因組小、實驗特性優(yōu)良、易轉化、生長繁殖迅速等特點［13］。作為木本植物的模式物種，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在楊樹中實現(xiàn)了廣泛應用。Fan等［14］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)完成了楊樹內源基因定點突變，成功敲除毛白楊（P.tomentosa Carr.）PDS基因（phytoene desaturase gene），導致楊樹葉片白化。Zhou等［15］利用CRISPR/Cas9技術成功編輯717-1B4楊的4CL1和4CL2基因（4-coumarate：CoA ligase gene）。Bruegmann等［16］針對717-1B4楊選取了12個基因，包括調控開花時間基因SOC1、FUL及其同源基因、4個NFP基因和TOZ19基因，轉化獲得15個抗性株系，經(jīng)PCR鑒定均為陽性植株。本研究利用CRSPR/Cas9系統(tǒng)對TAC基因進行敲除，以期為TAC在717-1B4楊的基因功能驗證提供研究依據(jù)，并為其他作物TAC同源基因的功能驗證提供材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

INRA717-1B4雜交楊（Populus tremula L.×P.alba L.，簡稱717-1B4楊），取自內蒙古農(nóng)業(yè)大學林學院教研室；717-1B4楊全基因組數(shù)據(jù)信息源于717-1B4楊基因組數(shù)據(jù)庫（aspendb.uga.edu/databases/spta-717-genome）；入 門 載體pEn-Chimera、表達載體pDE-CAS9-NPTⅡ，均由美國農(nóng)業(yè)部林務局西南太平洋工作站林木遺傳所贈送；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、DB3.1感受態(tài)細胞，購自北京全式金生物技術有限公司；農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，購自北京博邁德生物技術有限公司。

1.2 入門載體的構建

1.2.1 717-1B4楊TAC基因靶位點序列的設計 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的切割過程主要憑借核糖核蛋白復合物crRNA和Cas蛋白，掃描外源序列的protospacer以及PAM，PAM序列不顯現(xiàn)在靶點序列里。選擇靶點時要盡量保證其特異性，從而降低脫靶概率。靶點要求長度為20 bp，靶位點特異性高，不要出現(xiàn)連續(xù)多個A或者T，3′端要有PAM序列，引物不顯示PAM序列。在717-1B4楊中TAC基因的第一個旁系同源基因（Potri.002G175300）和第二個旁系同源基因（Potri.014G102600）篩選外顯子序列，評估靶點的脫靶效應及GC含量，GC含量保證在40%～70%之間，設計兩個靶位點sgRNA，分別命名為pDe-TAC1-1和pDe-TAC2-1。利用717-1B4楊基因組數(shù)據(jù)庫及推薦的靶位點（spta717grnas.csv）結合毛果楊等相關基因組進行靶點比對，確保靶點的特異性。根據(jù)靶點合成相應引物（表1），由中美泰和生物技術（北京）有限公司合成，純化級別為PAGE。

表1 本研究所用引物

1.2.2 pEn-Chimera入門載體的構建及轉化利用限制性內切酶BbsⅠ將pEn-Chimera載體質粒進行酶切，酶切體系（20μL）：pEn-Chimera 10μL、10×NEB buffer 2μL、NEB BbsⅠ1μL、ddH2O 7μL。37℃孵育1 h，孵育后的產(chǎn)物70℃反應15 min，使BbsⅠ失活。線性化后采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測反應產(chǎn)物，使用試劑盒（EasyPure?Quick Gel Extraction Kit）對產(chǎn)物進行膠回收，得到線性化pEn-Chimera入門載體。取上下游靶位點引物TAC1-1-F/R或TAC2-1-F/R各2 μL、ddH2O 46μL于離心管中混勻，95℃處理5 min后取出，室溫冷卻20 min，制備靶點互補雙鏈。取pEn-Chimera入門載體2μL、互補帶有靶點序列的產(chǎn)物3μL、T4連接酶1μL、T4 Buffer 5μL于200μL PCR管中混勻，25℃反應1 h，之后65℃反應15 min，進行載體與靶點序列T4酶的連接反應，最后采用電擊法進行DH5α感受態(tài)轉化，并過夜培養(yǎng)。挑選單菌落，以M13F為上游引物、TAC1-1-R或TAC2-1-R為下游引物，上下游引物各1μL，Premix rTaq 10μL，ddH2O 8 μL，進行序列擴增。擴增程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存，1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，篩選陽性菌落，測序。

1.3 表達載體的構建

取pEn-Chimera入門載體2μL、pDE-CAS9-NPTⅡ表達載體3μL、TE buffer 4μL、LR clonaseⅡ1μL于PCR管中，25℃反應6 h，構建LR反應。取50μL DH5α感受態(tài)細胞，加入LR反應產(chǎn)物，混勻，冰浴30 min，42℃熱激45 s，再次冰浴2 min，加入500μL無菌LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)1 h，實現(xiàn)感受態(tài)細胞的轉化。將已轉化的感受態(tài)細胞在LB固體培養(yǎng)基上均勻涂開，37℃過夜培養(yǎng)。以TAC1-1-F或TAC2-1-F為上游引物、SS102為下游引物，上下游引物各1 μL，Premix rTaq 10μL，ddH2O 8μL，進行PCR擴增。擴增程序為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存，1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，陽性菌落進行測序。

1.4 農(nóng)桿菌的轉化

取農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞100μL加入0.01～1.00μg表達載體質粒，混勻，冰上靜置5 min，液氮冷凍5 min，37℃水浴5 min，冰浴5 min，加入700μL LB液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2～3 h。6 000r/min離心1 min，取100μL上清重懸菌塊，在LB固體培養(yǎng)基上均勻涂開，28℃倒置培養(yǎng)2～3 d。取SS61和靶點反向序列TAC1-1-R或TAC2-1-R各1μL，Premix rTaq 10μL，ddH2O 8μL于PCR管中混勻，使用槍頭蘸取單菌落于離心管中，PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃恒溫保存。1%瓊脂糖凝膠電泳進行農(nóng)桿菌轉化檢測。

1.5 717-1B4楊的轉化

利用葉盤法進行717-1B4楊的轉化。①預培養(yǎng)：取生長良好、無病害的717-1B4楊組培苗自上而下第三片到第五片葉，使用打孔器沿葉脈方向進行打孔取材，置于CIM愈傷誘導（無抗生素）培養(yǎng)基中28℃暗培養(yǎng)。②菌種活化與培養(yǎng)：取農(nóng)桿菌于含Rif和Spec的LB培養(yǎng)基上進行劃線，28℃倒置培養(yǎng)，篩選單菌落進行搖菌活化，180 r/min、28℃暗培養(yǎng)至OD600為0.3～0.5。③侵染：將培養(yǎng)好的菌液進行離心，重懸，重懸OD600值為0.3～0.5，振蕩侵染葉片10 min，50～100 r/min離心，過濾菌體，取出葉片。④共培養(yǎng)：將葉片于CIM愈傷誘導培養(yǎng)基（無抗生素）上，28℃暗培養(yǎng)2～3 d，直至葉片背面出現(xiàn)環(huán)形菌斑，但無大面積形成。⑤選擇培養(yǎng)：取出共培養(yǎng)的葉片，ddH2O洗滌3次，每次5 min，清洗液洗滌1次，轉移至抗Kana的CIM愈傷誘導培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)2周后，更換新的抗Kana的CIM愈傷誘導培養(yǎng)基，轉為28℃光下培養(yǎng)1周，促進愈傷的形成。⑥使用Kana抗性的SIM芽誘導培養(yǎng)基進行不定芽誘導，直到不定芽生長至1～2 cm，切下置于Kana抗性SEM芽伸長培養(yǎng)基組培瓶中進行光下伸長培養(yǎng)，直到獲得抗性植株。

1.6 轉基因植株鑒定

使用CTAB法提取轉基因植株幼嫩葉片DNA，以序列TAC1-1-F或TAC2-1-F為上游引物、SS102為下游引物，PCR擴增體系（20 μL）：上、下游引物各1μL、DNA 1μL、2×Easy Taq PCR Super Mix 10μL、ddH2O 7μL。PCR擴增程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃恒溫保存，取10μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，篩選陽性植株。

1.7 T4載體連接及測序

以轉基因植株DNA為模板，使用引物TLZF和TLZ-R進行PCR擴增。擴增體系（20μL）：上、下游引物TLZ-F、TLZ-R各1μL，模板DNA 1μL，2×Easy Taq PCR Super Mix 10μL，ddH2O 7μL。擴增程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。4℃恒溫保存。PCR擴增產(chǎn)物純化后與pMD19-T載體連接，取5μL連接產(chǎn)物轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞，在AMP抗性的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)12～16 h，挑選完整、圓潤的20個單菌落進行菌落檢測，取陽性菌斑進行活化、測序，利用DNAMAN（Version 7.0）對測序結果與靶點序列進行比對，計算編輯效率。

2 結果與分析

2.1 TAC基因的靶點設計

利用717-1B4楊基因組數(shù)據(jù)庫及推薦的靶位點，結合已知的水稻、擬南芥基因序列，將717-1B4楊和毛果楊基因組序列進行對比，在毛果楊中確定2個TAC同源基因Potri.002G175300、Potri.014G102600，將其與717-1B4楊中的2個TAC同源基因進行比對，序列相似度分別高達97.65%和98.01%（圖1）。表明717-1B4楊TAC基因組序列為TAC-like基因的旁系同源基因。根據(jù)基因編輯靶點設計原則，設計了717-1B4楊中2個TAC同源基因的2個單基因編輯靶點，其中第一個同源基因的基因編輯位點位于外顯子第323個核苷酸處，第二個同源基因的基因編輯位點位于外顯子第58個核苷酸處。靶點均位于基因的前中端。

圖1 TAC基因家族系統(tǒng)進化樹

2.2 TAC基因的入門載體構建

電泳檢測結果（圖2）表明，目標條帶約369 bp，與預期目標片段一致。經(jīng)測序比對，TAC1-1、TAC2-1基因靶點已成功進入pEn-Chimera載體，表明TAC1-1、TAC2-1入門載體連接成功。

圖2 入門載體的PCR鑒定

2.3 TAC基因的表達載體構建

將攜帶靶點序列的入門載體pEn-Chimera通過同源置換反應構建pDE-CAS9-NPTⅡ表達載體。電泳檢測結果（圖3）表明，目標條帶約933 bp，與預期目標片段一致，且無明顯非特異性擴增。經(jīng)測序分析，TAC1-1、TAC2-1入門載體已成功置換pDE-CAS9-NPTⅡ表達載體中，表明pDE-CAS9-NPTⅡ：：TAC1-1、pDE-CAS9-NPTⅡ：：TAC2-1表達載體構建成功。

圖3 表達載體的PCR鑒定

2.4 轉基因植株的獲得

將構建成功的基因編輯載體pDE-CAS9-NPTⅡ：：TAC1-1、pDE-CAS9-NPTⅡ：：TAC2-1通過農(nóng)桿菌介導法轉化717-1B4楊。經(jīng)外植體葉片預培養(yǎng)、抗性愈傷誘導培養(yǎng)、抗性芽的分化和伸長培養(yǎng)、生根與增殖培養(yǎng)，pDE-CAS9-NPTⅡ：：TAC2-1載體成功獲得抗性苗（圖4）。

圖4 轉基因植株獲得過程

2.5 轉基因植株的PCR鑒定

對獲得的20株抗性苗進行鑒定，以攜帶靶點的質粒為陽性對照，野生型717-1B4楊為陰性對照，進行PCR檢測。檢測結果（圖5）表明，1、2、4、6、8、11、12、15、16、18、19、20號共12個株系檢測為陽性，PCR陽性鑒定轉化率為60%。

圖5 轉基因陽性苗鑒定

2.6 轉基因植株靶點序列突變分析

在獲得的12株轉基因植株中，基因靶標序列位點在8號、15號株系中均發(fā)生堿基缺失，其中8號株系靶點的第11、12個堿基發(fā)生缺失，15號株系靶點的第5～9個堿基發(fā)生缺失，靶點編輯效率16.7%，均為雜合突變體。其余株系均如株系1、2、4號未發(fā)生基因缺失或插入（圖6）。

圖6 靶點基因突變類型

3 討論

TAC基因作為IGT基因家族的一員，主要參與植物地上部的分枝角度以及側枝生長方向的調控。在水稻、玉米、桃樹、擬南芥等植物中，TAC1通過調控枝條的向地性，影響植物的分枝角度［17］；在水稻中，TAC2突變體表型與TAC1接近。因此，本試驗以TAC基因為例設計了兩個基因靶點，構建入門載體和表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法轉化717-1B4楊，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得抗性植株，并對抗性植株進行鑒定、靶點編輯檢測及靶點編輯效率分析，旨在為后續(xù)717-1B4楊IGT基因家族TAC基因功能的研究提供數(shù)據(jù)參考。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為新興基因編輯技術，具有廣泛的應用前景，僅需設計1～2個目標靶向序列就可以引導Cas9蛋白對目的基因進行特異性的結合修飾，最終導致基因突變或敲除，極大地推動了基因基礎研究的發(fā)展［18］。研究顯示，利用CRISPR/Cas9技術編輯植物基因組DNA，產(chǎn)生的突變類型多為堿基缺失和插入，且堿基缺失突變頻率遠高于堿基插入突變頻率［19，20］。本試驗利用CRISPR/Cas9技術進行編輯，從陽性植株中篩選獲得2株雜合突變體，且均為堿基缺失，基因編輯效率16.7%，說明717-1B4楊TAC基因產(chǎn)生的堿基缺失突變頻率較高，與前人研究結論一致。

本研究構建的兩個表達載體為單靶點基因編輯載體，TAC基因的靶位點符合設計要求，GC堿基含量為40%，但靶位點編輯效率較低。有研究指出，通常情況下單個sgRNA只能靶向1個基因位點，編輯效率低且不穩(wěn)定，而多個sgRNA靶向同一基因的不同位點，不僅可以提高基因編輯頻率，還可能造成大片段的堿基突變［21］。胡春華等［22］利用改良的CRISPR/Cas9多靶點載體系統(tǒng)，以香蕉MaPDS基因為例，成功實現(xiàn)了對香蕉內源基因的定點敲除，獲得白化突變體株系。汪秉琨等［23］構建了Wx基因雙靶點CRISPR/Cas9表達載體，也獲得多個位點突變的個體。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中的編輯效率受其他多種因素的影響，如Cas9蛋白活性［24］、靶標數(shù)量、sgRNA啟動子［25］、靶點序列GC含量［26］及載體的sgRNA表達量［27］等，甚至還會出現(xiàn)脫靶情況［28］。Slaymaker等［29］對Cas9蛋白結構進行了完善，提高了表達載體的突變效率，減少了脫靶情況。Ma等［30］在水稻研究中發(fā)現(xiàn)靶位點序列的GC含量較高（50%～70%）時編輯效率相對更高。Dang等［31］在原有sgRNA長度的基礎上增加了10個堿基，完善了sgRNA骨架序列，結果表明完善后的基因編輯效率提高約50%。Fu等［32］探討了突變效率與sgRNA長度的關系，發(fā)現(xiàn)其自身活性不受影響的前提下，控制sgRNA長度在17～18 nt可以明顯降低脫靶效應。以本試驗結果為基礎，在運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對物種進行編輯時，可以嘗試對該物種所用的sgRNA長度、Cas9載體、GC含量、蛋白結構等進行優(yōu)化，從而獲得更高的編輯效率。

本試驗pDE-CAS9-NPTⅡ：：TAC2-1載體成功獲得抗性苗，pDE-CAS9-NPTⅡ：：TAC1-1載體未獲得抗性苗，植株遺傳轉化的方法、品種等因素可能是原因之一；717-1B4楊作為試驗材料，在遺傳轉化預培養(yǎng)浸染時發(fā)現(xiàn)植株外植體容易發(fā)生褐化死亡、農(nóng)桿菌過度污染導致死亡等問題，對抗性植株的獲得造成了極大阻礙，在參考劉閔豪［33］、蘇文龍［34］等對預培養(yǎng)時間、菌液侵染濃度以及農(nóng)桿菌侵染時間等一系列優(yōu)化調整后，農(nóng)桿菌過度污染等問題得到緩解。本試驗基于CRISPR/Cas9技術，成功構建了717-1B4楊TAC基因敲除表達載體，并獲得了基因突變植株，后續(xù)將移入土中繼續(xù)進行觀察與分析，為深入研究TAC基因的生物學功能及分子機制提供良好的數(shù)據(jù)參考。

4 結論

本研究利用717-1B4楊基因組數(shù)據(jù)構建了TAC基因敲除表達載體，并對717-1B4楊進行了遺傳轉化，共獲得12個株系抗性苗，基因編輯效率為16.7%，為CRISPR/Cas9技術在717-1B4楊中的應用做了初步探索，同時為TAC基因功能的研究和分子育種提供理論依據(jù)。