鏈格孢菌產(chǎn)細(xì)交鏈孢菌酮酸條件的優(yōu)化研究

許雁祥 唐 敏 李云仙 楊發(fā)忠

（1. 西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，云南 昆明 650233；2. 西南林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明 650233）

近年來，國內(nèi)外對鏈格孢菌（Alternariaalternata）及其毒素的研究日漸深入。已有的研究表明，鏈格孢菌能產(chǎn)生多種毒素，已報道的就已超過30種。這些毒素（包括細(xì)交鏈孢菌酮酸（TeA）、鏈格孢醇（AOH），騰毒素（Ten）等）種類繁多、活性多樣，統(tǒng)稱為鏈格孢霉毒素。目前研究比較多的是TeA，TeA主要來自鏈格孢屬（Alternariaspp.），如柑橘鏈格孢（A.citri）、蘿卜鏈格孢（A. japonica）、擬稻瘟交鏈孢（A. oryzae）、細(xì)交鏈格孢（A. tenuissima）等多種鏈格孢菌均能產(chǎn)TeA。該毒素是鏈格孢菌毒素中唯一的含氮代謝物，是公認(rèn)最重要、活性最強的鏈格孢霉毒素[1]，其在自然界中有一套完整的講解途徑，活性強弱隨濃度增加而增強，存在顯著的濃度效應(yīng)[2-4]。TeA屬于非寄主專化性毒素，作用譜廣，能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性，使植株抗病性或抗蟲性增強。研究表明，鏈格孢菌毒素細(xì)交鏈孢菌酮酸不僅會影響寄主葉片等組織器官的結(jié)構(gòu)，還會對寄主植物質(zhì)膜透性、光合作用、呼吸作用、酶活性、激素平衡等生理代謝過程產(chǎn)生嚴(yán)重影響[5-7]。

楊發(fā)忠曾采用鏈格孢菌粗毒素處理中國月季（Rosa chinensis）植株，能夠十分明顯地抑制月季長管蚜的生長繁殖[8]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，鏈格孢菌毒素中能誘導(dǎo)植株對月季長管蚜產(chǎn)生抗性的活性成分主要是TeA，用一定濃度的TeA處理月季植株，并未對植株產(chǎn)生明顯傷害作用但是對月季長管蚜卻產(chǎn)生了明顯的驅(qū)避效應(yīng)，鏈格孢菌毒素TeA用于防治月季長管蚜有很好的效果[8-16]。Patriaca 等[17]對分離得到的123株鏈格孢菌株研究發(fā)現(xiàn)，有72%的菌株產(chǎn)TeA，其中細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）、鏈格孢（Alternariaalternata）、長柄鏈格孢（Alternarialongipes）、梨黑斑鏈格孢（Alternaria gaisen）和蘋果鏈格孢（Alternariamali）均能產(chǎn)TeA。何麗[18]對分離得到的10株交鏈格孢菌（Alternaria alternata）分析檢測4種鏈格孢菌毒素，檢測結(jié)果表明10株菌均產(chǎn)生TeA，且TeA檢出含量最高。TeA產(chǎn)毒菌株的產(chǎn)毒能力受外界物理因素的影響較大，在研究產(chǎn)毒條件的培養(yǎng)時，大多是用PDA作為培養(yǎng)進(jìn)行研究，且對培養(yǎng)時間和光照條件的研究較少。TeA可以通過人工合成，但由于該物質(zhì)同分異構(gòu)體較多，人工合成的化合物活性低于生物提取[19]。本研究對獲得的一株鏈格孢屬真菌產(chǎn)TeA的培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選，分析了通過真菌培養(yǎng)方式獲得鏈格孢菌毒素細(xì)交鏈孢菌酮酸的方法，為以后把TeA作為一種綠色生物防治劑用于植物蟲害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

1.2 主要儀器及試劑

HPLC檢測設(shè)備為大連依利特公司的高效液相色譜儀，紫外－可見檢測器為UV230II，高壓恒流泵為P230II，7725i手動進(jìn)樣器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA RV8）；細(xì)交鏈孢菌酮酸（TeA，purity>97% Sigma?Aldrich）；甲醇（Sigma?Aldrich，色譜純）；乙腈（Sigma?Aldrich，色譜純）； 氨基柱（TSKgel Amide?80）.

1.3 菌株培養(yǎng)

從斜面保存的供試菌株邊緣挑取一塊大小5 mm左右的菌塊接種在PDA培養(yǎng)基[20]上，25 ℃黑暗倒置培養(yǎng)至菌落長至一定大小時，挑取邊緣菌絲再次轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，并在相同條件下擴(kuò)大培養(yǎng)至鋪滿平板20 d后，待用。

1.4 毒素粗提取物的制備

按1.3的方法培養(yǎng)供試菌株，每組設(shè)3個平板。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)基和菌落一同切成約1 cm×1 cm的小塊置于錐形瓶中，加入一定體積（以剛好沒過被提取材料為準(zhǔn)）的有機萃取液（V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）∶V（冰醋酸）=80∶15∶5），提取 3次，至萃取液無色，將萃取液合并采用濾紙過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干。用4 mL甲醇溶解固體萃取物，即得毒素粗提物，于4 ℃下保存，備用。每組實驗設(shè)5個重復(fù)。

1.5 毒素TeA的檢測

采用HPLC測定粗毒素中的細(xì)交鏈孢菌酮酸含量，檢測條件為流動相：100%乙腈；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：280 nm；色 譜 柱 為：TSKgel Amide?80 氨 基 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）。配制系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用上述條件上機測試，根據(jù)濃度?峰面積建立回歸方程。相同條件下測試供試菌株毒素粗提物中的TeA，并利用回歸方程計算其含量。

1.6 供試菌株產(chǎn)毒素（TeA）單因素條件篩選

1.6.1 培養(yǎng)基的影響

分別采用PDA、PSKA、改良Fries、查彼（Czapek）、理查（Richard）和改良M?1?D等6種培養(yǎng)基[19]接種供試菌株，并按照上述方法（見1.3、1.4）培養(yǎng)菌株、制備毒素粗提物和測定TeA的含量，每種培養(yǎng)基設(shè)5個重復(fù)。

1.6.2 溫度、培養(yǎng)時間、光照條件

小米通過互聯(lián)網(wǎng)實現(xiàn)了在線直銷產(chǎn)品，完全依托小米網(wǎng)站，舍棄了傳統(tǒng)手機銷售依靠線下出售的方式，這樣的最大好處就是去掉了層層代理環(huán)節(jié)，省下了大量銷售費用，既降低了小米手機的成本，同時又支撐起了小米采取的低價格、高性價比策略。

分別設(shè)置15、20、25、30、35 ℃ 5個溫度梯度，10、15、20、30、35 d 5個培養(yǎng)時間和黑暗、12 h光照12 h黑暗交替、24 h持續(xù)光照3個光照條件，按1.2的方法分別在所設(shè)置的不同條件下，選用實驗篩選出的最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，然后按1.4的方法制備毒素粗提物和進(jìn)行TeA的含量測定，所有實驗每個條件下均設(shè)5個重復(fù)。

1.7 產(chǎn)毒條件的響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用最佳培養(yǎng)基對產(chǎn)毒培養(yǎng)條件（培養(yǎng)時間、溫度和光照）做進(jìn)一步優(yōu)化，以確定最優(yōu)的實驗條件。根據(jù)中心響應(yīng)面試驗原則建立3因素3水平的響應(yīng)面實驗，并采用Design?Expert 10.0.3軟件進(jìn)行優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜法測定細(xì)交鏈孢菌酮酸

圖1為標(biāo)準(zhǔn)品細(xì)交鏈孢菌酮酸（TeA）的HPLC分析結(jié)果。利用TSKgel Amide?80氨基柱在洗脫體系為100%乙腈下對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行洗脫時效果最好，峰規(guī)整單一。圖2為菌株粗毒素在相同條件下測得的HPLC圖譜，圖2中7號峰保留時間與TeA標(biāo)樣保留時間非常接近可認(rèn)為是同一種物質(zhì)產(chǎn)生的色譜峰。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品TeA的HPLC分析Fig. 1 HPLC analysis for standard TeA

圖2 菌株5390粗毒素HPLC圖譜Fig. 2 HPLC map of crude toxin of strain 5390

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 不同培養(yǎng)基對供試菌株產(chǎn)TeA的影響

培養(yǎng)基種類對5390菌株產(chǎn)TeA的影響很大，存在明顯差異，結(jié)果見表1。由表1可以看出，菌株在改良M?1?D培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，提取的粗毒素中未檢出TeA，而在理查和查彼培養(yǎng)基上，其含量較高，可分別達(dá)到13.31 μg/g和12.24 μg/g，與其余4種培養(yǎng)基（PSKA、改良M?1?D、PDA、改良Fries）相比，差異達(dá)到極顯著水平。

表1 不同培養(yǎng)基對TeA含量的影響Table 1 Effects of different media on TeA content

2.2.2 培養(yǎng)溫度對TeA含量的影響

培養(yǎng)溫度對5390菌株產(chǎn)TeA的含量影響較大，結(jié)果見表2。由表2可知，菌株產(chǎn)TeA量較高的溫度為25 ℃和30 ℃，分別為13.31μg/g和12.90 μg/g，在這2個溫度下產(chǎn)毒量沒有顯著差異，當(dāng)溫度為15 ℃和35 ℃時TeA含量顯著下降，與25 ℃和30 ℃時的TeA含量存在極顯著差異。

表2 不同溫度對TeA含量的影響（μg/g）Table 2 Effects of different temperature on TeA content

2.2.3 培養(yǎng)時間對TeA含量的影響

培養(yǎng)時間對菌株5390產(chǎn)毒素TeA也有一定的影響。由表3可知，培養(yǎng)時間為10 d時，粗毒素提取物中未檢出TeA，隨著培養(yǎng)時間的增加，TeA含量也有所增加，培養(yǎng)25 d時，TeA含量最高，達(dá)到13.99 μg/g，之后再延長培養(yǎng)時間，TeA含量雖有所下降，但沒有顯著差異。

表3 不同培養(yǎng)時間對TeA含量的影響Table 3 Effects of different time on TeA content

2.2.4 光照條件對TeA含量的影響

改變光照條件，菌株5390產(chǎn)TeA含量也隨之改變，結(jié)果見表4。由表4可知，菌株在黑暗條件下培養(yǎng)，粗毒素中TeA含量較高，達(dá)到13.31 μg/g，12 h光照12 h黑暗交替培養(yǎng)，粗毒素中TeA含量明顯降低，下降幅度達(dá)到25.5%，24 h光照培養(yǎng)，TeA含量最低，只有6.44 μg/g。黑暗條件培養(yǎng)與12 h光照12 h黑暗交替培養(yǎng)，以及24 h光照培養(yǎng)相比，TeA含量差異達(dá)到極顯著水平。

表4 不同光照條件對TeA含量的影響Table 4 Effects of different illumination condition on TeA content

在以上培養(yǎng)條件下，菌株5390使用理查培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度在25～30 ℃之間，黑暗培養(yǎng)20～30 d時產(chǎn)TeA含量較高，因此擇理查培養(yǎng)基對菌株5390進(jìn)行深入研究，用響應(yīng)面法對其培養(yǎng)條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3 產(chǎn)毒條件的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)以上試驗結(jié)果，進(jìn)行響應(yīng)面培養(yǎng)條件的優(yōu)化，用HPLC法測定TeA含量作為響應(yīng)值，參考上述單因素試驗結(jié)果所確定反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心響應(yīng)面試驗原則，以光照條件、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間3因素設(shè)計了3因素3水平的響應(yīng)面試驗，試驗因素水平設(shè)計見表5。其中“0”為3水平單因素試驗最優(yōu)條件，“?1”為低水平，“1”為高水平，考查的響應(yīng)值y為TeA含量。

表5 響應(yīng)面分析因素與水平Table 5 Analytical factors and levels for RSA

采用Design?Expert 10.0.3統(tǒng)計軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，實驗設(shè)計方案及TeA含量響應(yīng)值見表6。

表6 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 6 Experimental design and results of response surface

建立5390菌株最佳產(chǎn)毒素（TeA）條件參數(shù)的回歸模型，獲得評價指標(biāo)響應(yīng)值對自變量A、B、C二次多項式回歸方程：

對該模型進(jìn)行方差分析及模型系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗，以TeA含量為評價指標(biāo)，結(jié)果表明回歸模型（P<0.000 1<0.01）達(dá)到極顯著水平，證明模型有意義；失擬值不顯著（P=0.84>0.05），說明模型擬合度好；模型的校正決定系數(shù)R=0.984 5，說明此模型能解釋98.45%響應(yīng)值的變化，實驗誤差小。

通過分析回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果并作出響應(yīng)的曲面圖，見圖3，4，5，在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對響應(yīng)值的影響順序為：光照條件>培養(yǎng)時間>培養(yǎng)溫度，其中光照條件對TeA含量的影響極顯著。光照條件與培養(yǎng)溫度交互作用響應(yīng)面圖坡度較陡（圖3），對TeA含量的影響顯著（P= 0.018 8 < 0.05），光照條件與培養(yǎng)時間交互作用響應(yīng)面圖坡度也較陡（圖4），說明對TeA含量的影響也較大，P=0.075 4接近顯著水平。培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時間之間相互作用的響應(yīng)面圖坡度比較平緩（圖5），對TeA含量的影響不顯著（P=0.776>0.05）。

圖3 培養(yǎng)溫度與光照條交互作用對TeA含量的影響Fig. 3 Effect of interaction between temperature and light on TeA content

圖4 培養(yǎng)時間與光照條交互作用對TeA含量的影響Fig. 4 Effect of interaction between time and ligh ton TeA content

圖5 培養(yǎng)時間與培養(yǎng)溫度交互作用對TeA含量的影響Fig. 5 Effect of interaction between temperature and time on TeA content

3 結(jié)論與討論

鏈格孢菌產(chǎn)毒能力受外界物理因素的影響較大，在不同培養(yǎng)基、不同培養(yǎng)溫度、不同培養(yǎng)時間和光照條件下，鏈格孢菌產(chǎn)毒素TeA的量有所差別甚至達(dá)到極顯著差異。本研究對影響鏈格孢菌產(chǎn)毒的培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間及光照）進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基種類對5390菌株產(chǎn)TeA的影響很大，在理查和查彼培養(yǎng)基上，其含量較高；培養(yǎng)溫度對TeA含量有較大影響，菌株在25 ℃和30 ℃ TeA產(chǎn)量較高，當(dāng)溫度為15 ℃和35 ℃時TeA含量顯著下降，與25 ℃和30 ℃時的TeA含量存在極顯著差異。隨著培養(yǎng)時間的增加，TeA含量也有所增加，培養(yǎng)25 d時，TeA含量最高，之后再延長培養(yǎng)時間，TeA含量雖有所下降，但沒有顯著差異。黑暗條件培養(yǎng)與12 h光照12 h黑暗交替培養(yǎng)，以及24 h光照培養(yǎng)相比，TeA含量差異達(dá)到極顯著水平，菌株在黑暗條件下培養(yǎng)，粗毒素中TeA含量較高。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選擇理查培養(yǎng)基，用響應(yīng)面法對培養(yǎng)條件作進(jìn)一步優(yōu)化，以光照條件、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間3因素設(shè)計了3因素3水平的響應(yīng)面試驗，得到最優(yōu)條件為：黑暗培養(yǎng)，溫度30 ℃，培養(yǎng)時間29 d。在此條件下作驗證試驗，TeA含量為14.99 μg/g與模型預(yù)測接近。

HPLC是檢測TeA的主要方法之一，它具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定等特點，因此被廣泛應(yīng)用于TeA的檢測[21]。目前文獻(xiàn)記載的高效液相色譜法測定TeA所用的色譜柱均為C18反相柱，本實驗發(fā)現(xiàn)使用氨基柱分析測定TeA，粗毒素中其他毒素與TeA能很好的分離，與使用C18反相柱相比分離效果更好。

TeA對中國月季上的月季長管蚜有驅(qū)避效應(yīng)，對其他害蟲是否有活性還需要進(jìn)一步研究。TeA是由鏈格孢菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，在自然界中有一套完整的降解途徑，對環(huán)境無污染，是一種綠色無公害的生物防治劑。優(yōu)化鏈格孢菌產(chǎn)TeA的培養(yǎng)條件，找到鏈格孢菌產(chǎn)TeA的最佳條件，可為TeA的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論保障，也為綠色環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的現(xiàn)代植物保護(hù)理念添磚加瓦。