樺褶孔菌揮發油的化學成分及2種活性研究

郭 磊 田 野 高 然 孔德仙 王軍民 華 燕

（1. 西南林業大學云南森林資源培育與利用協同創新中心，云南 昆明 650233；2. 西南林業大學生命科學學院，云南 昆明 650233）

植物揮發油是植物體內的次生代謝物，由相對分子質量較小的簡單化合物組成，具有一定的消炎、抗氧化及抑制病蟲害等多種生物活性[1-2]，具有極大的開發和應用價值，也是藥品、食品、化妝品等領域的研究熱點。

樺褶孔菌（Lenzites betulina）是屬于擔子菌門（Basidiomycete）、傘菌綱（Agaricomycetes）、多孔菌目（Aphyllophorales）、多孔菌科（Polyporaceae）、褶孔菌屬（Lenzites）的一種大型真菌，通常生在樺樹倒木上，在中國有著廣泛分布[3-4]。樺褶孔菌含有多種生理活性物質，比如多糖、吡喃酮、甾醇等[5-7]，已被用于臀部和股骨疼痛、肩高病、中風和感冒疾病的治療[8]。目前，對樺褶孔菌的研究較少，只是在子實體中多糖的分離純化及化合物的分離鑒定方面有較少的報道，對其揮發油化學成分及其生物活性研究還處于空白階段。因此，本研究以樺褶孔菌子實體為原料，通過超臨界CO2萃取技術并結合GC?MS對揮發油的化學組成進行鑒定；同時，測定揮發油對DPPH·、O2?·、·OH和ABTS+·的清除能力及抑菌活性，以期為樺褶孔菌資源的綜合利用和深度開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褶孔菌子實體購自深圳悅云商貿有限公司，由西南林業大學張穎博士鑒定為樺褶孔菌，標本保存于西南林業大學林學院植物資源利用系。菌種由西南林業大學生物多樣性保護與利用學院和西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室提供，分別為大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、四聯球菌（Micrococcus tetragenus）、變形桿菌（Proteus vulgaris）、金黃色葡萄球菌金黃亞種（Staphylococcus aureus subsp. aureus）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

1,1?二苯基?2?三硝基苯肼（DPPH）、2,2'?聯氮?雙?3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸（ABTS），正己烷、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、鹽酸、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、焦性沒食子酸、抗壞血酸、二甲基亞砜（DMSO），均為分析純；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂，氯化鈉，均為試劑純。

1.2 儀器與設備

Speed SFE超臨界萃取儀（ASI，美國）；7890A?5975C氣相色譜質譜聯用儀（Agilent，美國）；UV?VIS 300紫外分光光度計（Thermo Fisher，美國）；BAS2245電子天平（Strtorius，德國，精度0.1 mg）；HH?2數顯電子恒溫水浴鍋（金壇市丹瑞電器廠，中國）；恒溫恒濕培養箱（上海秋佐科學儀器有限公司，中國）。

1.3 實驗方法

1.3.1 超臨界CO2萃取樺褶孔菌揮發油

稱取30 g樺褶孔菌干燥粉末裝入超臨界CO2萃取儀萃取釜內，設置萃取壓力25 MPa，萃取溫度40 ℃，萃取時間2 h；靜態萃取后在CO2流量10 L/h條件下連續萃取0.5 h，用正己烷收集得到有特殊香味的黃色油狀物。

1.3.2 樺褶孔菌揮發油GC-MS分析

GC條件：DB?5 MS 毛細管色譜柱（30 m ×0.25 mm × 0.25 μm）；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min；采用程序升溫，進樣口溫度250 ℃，初始溫度80 ℃，保持1 min，以20 ℃/min速率升至260 ℃，保持1 min，以5 ℃/min 速率升至280 ℃，保持6 min；再以5 ℃/min速率升至310 ℃，保持10 min；采用無分流進樣，進樣量為1.0 μL。MS條件：EI離子源；離子源溫度240 ℃；接口溫度280 ℃; 電子能量70 eV；溶劑延時4.5 min；掃描方式：全譜圖掃描; 質量掃描范圍50～600 amu。

1.3.3 樺褶孔菌揮發油抗氧化活能力測定

1）清除DPPH·能力參照曾昭成等[9]的方法并略作修改，將樺褶孔菌揮發油溶于DMSO配成6.25、12.5、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL濃度的溶液，量取2.0 mL樣液加入2.0 mL DPPH?乙醇溶液（0.2 m moL）搖勻后靜置30 min，在517 nm處測定吸光值（A1）。以等體積無水乙醇代替DPPH?乙醇溶液測吸光值（A2），以等體積無水乙醇代替樣液測吸光值（A0），以維生素C為對照， 每個樣品進行3次平行實驗。按公式（1）計算樺褶孔菌揮發油清除DPPH·清除率。

2）清除O2?·能力的測定采用鄰苯三酚法[10]，取3.0 mL Tris?HCl緩沖液（pH 8.2）加入1 mL 6.25、12.5、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL濃度的樺褶孔菌揮發油溶液和0.4 mL鄰苯三酚溶液（5.0 mmol/L）搖勻，在25 ℃水浴中放置4 min后，立即加入0.1 mL HCl溶液（8.0 mol/L）終止反應，在320 nm處測定吸光度（As），以等體積蒸餾水代替樣液測吸光值（Ac），以等體積蒸餾水代替鄰苯三酚測定吸光值（Ab），以維生素C為對照， 每個樣品進行3次平行實驗，按公式（2）計算O2?·清除率。

3）清除·OH能力參照Wannes等[11]的方法并略作修改，取不同濃度的樺褶孔菌揮發油（6.25、12.5、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL）2.0 mL，依次加入3 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L水楊酸?乙醇溶液和4 mmol/L H2O2溶液各0.2 mL，搖勻靜置60 min后在510 nm下測吸光值（Aα）。以等體積蒸餾水代替水楊酸測吸光值（Aβ），以等體積蒸餾水代替樣液測吸光值（Aγ）。以維生素C為對照，每個樣品進行3次平行實驗，按公式（3）計算·OH清除率。

4）清除ABTS+·能力的測定參照文獻[12]并適 當 修 改，將2.45 mmol·L?1過 硫 酸 鉀 溶 液 與7 mmol/L ABTS溶液混合（體積比為1∶1）并避光放置12 h后，用無水乙醇將其稀釋，使其吸光值在734 nm 處為0.68 ～ 0.72之間，取3.0 mL混合液與0.3 mL揮發油樣液于室溫下反應6 min后，迅速在734 nm處測定吸光度值（Ai） ，以等體積蒸餾水代替儲備液測吸光值（Aii），以等體積蒸餾水代替樣液測定吸光值（Aiii）。以維生素C為對照，每個樣品進行3次平行實驗，按公式（4）計算ABTS+·清除率。

1.3.4 樺褶孔菌揮發油抑菌活性測定

1）菌種培養 抗菌試驗菌株為3種革蘭氏陰性菌如大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomanas aeruginosa）和變形桿菌（Proteus vuigaris），3種革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌金黃亞種（Staphylococcus aureussubsp. aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和四聯球菌（Micrococcus tetragenus）。菌種培養采用馮小飛等[13]方法并略作修改，將固體瓊脂培養基在121 ℃高壓滅菌20 min后平鋪于培養皿，用劃線法接種這6種細菌，將培養皿置于28 ℃恒溫培養箱中培養24 h，所有操作均在無菌條件下操作。

2）最低抑菌濃度（MIC）的測定參照李肖等[14]方法并略作修改。精確稱量樺褶孔菌揮發油并用DMSO配制成不同濃度的初始液，并用二倍稀釋法再進行配制。具體操作如下：在無菌96孔板中，第1列至第6列為樣品孔，第7列為空白對照孔，第8列為陽性對照孔，每孔加入100 μL液體培養基，實驗組加入50 μL的樣品溶液，利用二倍稀釋法使第1至6列的濃度梯度為100、50、25、12.5、6.25、3.125 mg/mL，空白對照加入50 μL DMSO，陽性對照組加入50 μL鏈霉素溶液（0.1 g/L）。在每孔中加入50 μL菌液置于28 ℃培養箱中培養24 h，平行測定3次，加入40 μL碘硝基四唑紫溶液（0.2 g/L），觀察微孔中是否出現紫色來檢查有無細菌生長，以不出現紫色的微孔濃度為MIC。

1.4 數據處理

每個實驗均平行測定3次，使用Origin Pro 2017 C對試驗中得到的數據進行處理，利用SPSS Statistics 20對數據進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 揮發油化學成分分析

由表1可知，從樺褶孔菌揮發油中鑒定出31種化合物，主要化學成分有亞油酸（12.9%）、三十四烷（9.4%）、二十四烷（6.4%）、抗壞血酸二棕櫚酸酯（4.5%）、9（11）?脫氫麥角甾醇苯甲酸酯（3.2%）、二十烷（2.3%）、二十一烷（2.3%）、2,4?二叔丁基苯酚（2.2%）、二（6?甲基庚基）鄰苯二甲酸酯（1.8%）、3,6?二羥基膽烷酸（1.7%）、4?硝基苯基壬醚（1.6%）、2,6,10,14?四甲基十八烷（1.5%）、5?（2?甲基丙基）壬烷（1.4%）、5?丁基?壬烷（1.4%）、四十四烷（1.4%）、2?甲基十七烷（1.4%）、2,2?二甲基癸烷（1.3%）和2?苯?2?丁烯（1.2%）。

表1 樺褶孔菌揮發油的化學成分分析Table 1 The chemical constituents of volatile oil from L. betulina

2.2 樺褶孔菌揮發油抗氧化活性

2.2.1 樺褶孔菌揮發油對DPPH·的清除作用

由圖1可知，樺褶孔菌揮發油對DPPH·的清除能力在濃度為6.25～500 μg/mL的范圍內呈現較好的量效關系。當濃度為500 μg/mL時，樺褶孔菌揮發油和維生素C對DPPH·的清除率分別達到了（81.11 ± 0.15）%和（95.44 ± 0.15）%。相同濃度條件下，樺褶孔菌揮發油對DPPH·的清除能力低于維生素C。表2是用Probit函數進行回歸計算樺褶孔菌揮發油和維生素C抗氧化活性的EC50值，從表中可以看出樺褶孔菌揮發油清除DPPH·的EC50值為（115.81 ± 4.75）μg/mL，低于維生素C清除DPPH·的EC50值（16.74 ± 2.82）μg/mL。

表 2 樺褶孔菌揮發油抗氧化活性的EC50值Table 2 EC50 of volatile oils from L. betulina μg/mL

圖1 樺褶孔菌揮發油濃度對DPPH·的清除效果影響Fig. 1 DPPH· free radical scavenging capacity of volatile oils from L. betulina

2.2.2 樺褶孔菌揮發油對O2?·的清除作用

由圖2可知，樺褶孔菌揮發油和維生素C清除O2?·能力的強弱，樺褶孔菌揮發油對O2?·的清除能力在實驗范圍內與濃度呈現良好的量效關系。相同濃度下，樺褶孔菌揮發油清除O2?·的能力低于維生素C。樺褶孔菌揮發油對O2?·的清除率在濃度為100～500 μg/mL范圍迅速上升，當濃度達到500 μg/mL時，樺褶孔菌揮發油對O2?·的清除能力達到（87.97 ± 1.84）%，此時維生素C的清除能力為（98.28 ± 1.29）%。由表2可知，樺褶孔菌揮發油清除O2?·的EC50值為（40.72 ±3.71）μg/mL，略高于維生素C（5.39 ± 1.69）μg/mL。

圖2 樺褶孔菌揮發油濃度對O2?·清除效果的影響Fig. 2 Superoxide anion free radical scavenging capacity of volatile oils from L. betulina

2.2.3 樺褶孔菌揮發油對·OH的清除作用

由圖3可知，在濃度為6.25～50 μg/mL之間，樺褶孔菌揮發油對·OH的清除能力遠高于維生素C，當濃度為50 μg/mL時，樺褶孔菌揮發油對·OH的清除率為（42.98 ± 2.79）%，而此時維生素C的清除率僅有（7.33 ± 0.90）%。隨著樣品濃度的增加，樺褶孔菌揮發油對·OH的清除率明顯低于維生素C。當濃度為500 μg/mL時，樺褶孔菌揮發油的清除率為（65.58 ± 4.84）%，低于相同濃度的維生素C（99.59 ± 0.20%）。由表2可知，樺褶孔菌揮發油清除·OH的EC50值為（185.26 ± 5.22）μg/mL，高于維生素C的EC50（71.96 ± 4.28）μg/mL。

圖3 樺褶孔菌揮發油對·OH的清除效果影響Fig. 3 Hydroxyl radical scavenging capacity of volatile oils from L. betulina

2.2.4 樺褶孔菌揮發油對ABTS+·的清除作用

由圖4可知，樺褶孔菌揮發油對ABTS+·的清除率為2.94%～47.70%，且清除能力隨濃度的增加而增大。在6.25～25 μg/mL范圍內，樺褶孔菌揮發油和維生素C對ABTS+·的清除率相差不大，但濃度在50～500 μg/mL的增長過程中，維生素C對ABTS+·的清除率明顯高于樺褶孔菌揮發油。從對ABTS+·的EC50值來看，樺褶孔菌揮發油的EC50為（687.63 ± 6.53）μg/mL，遠高于Vc的EC50值（45.93 ± 3.83）μg/mL。

圖4 樺褶孔菌揮發油對ABTS+·的清除作用Fig. 4 ABTS+· free radical scavenging capacity of volatile oils from L. betulina

2.3 樺褶孔菌揮發油的抑菌活性

由表3可知，樺褶孔菌揮發油對6種細菌均具有一定的抑菌效果，尤其對枯草芽孢桿菌的MIC值達到3.91 μg/mL。樺褶孔菌揮發油對6種細菌的抑制強度大小為 枯草芽孢桿菌>變形桿菌=大腸桿菌>四聯球菌>銅綠假單胞菌=金黃色葡萄球菌金黃亞種。

表3 樺褶孔菌揮發油抑菌實驗結果Table 3 Antibacterial test results of volatile oil from L. betulina

3 結論與討論

本研究首次用GC?MS從樺褶孔菌揮發油中鑒定出31種化合物，包括19種烴類化合物、5種酯類化合物、2種脂肪酸類化合物、2種芳香族化合物、1種酚類化合物、1種烯烴類化合物和1種醚類化合物。亞油酸是揮發油中含量最高的，達到12.9%，其余含量較多的化合物為二十四烷（6.4%）、抗壞血酸二棕櫚酸酯（4.5%）、9（11）?脫氫麥角甾醇苯甲酸酯（3.2%）、二十烷（2.3%）、二十一烷（2.3%）、2,4?二叔丁基苯酚（2.2%）、二（6?甲基庚基）鄰苯二甲酸酯（1.8%）、3,6?二羥基膽烷酸（1.7%）、4?硝基苯基壬醚（1.6%）、2,6,10,14?四甲基十八烷（1.5%）、5?（2?甲基丙基）壬烷（1.4%）、5?丁基?壬烷（1.4%）、四十四烷（1.4%）、2?甲基十七烷（1.4%）、2,2?二甲基癸烷（1.3%）和2?苯?2?丁烯（1.2%）。

樺褶孔菌揮發油的抗氧化實驗結果證明，其對DPPH·、O2?·、·OH和ABTS+·均具有較強的清除能力，且清除率與揮發油濃度間較好呈量效關系；樺褶孔菌揮發油對4種自由基清除率的EC50值分別為（115.81 ± 4.75）、（40.72 ± 3.71）、（185.26 ±5.22）、（687.63 ± 6.53）μg/mL，其中樺褶孔菌揮發油和維生素C對O2?·清除率的EC50值（5.39 ±1.69）μg/mL接近，遠低于瞿麥揮發油和馬尾松松針揮發油的EC50值。此外，抑菌實驗結果也表明樺褶孔菌揮發油對多種細菌均具有較好的抑制效果，尤其對枯草芽孢桿菌的抑菌效果最佳（MIC僅為3.91 μg/mL）。研究結果表明樺褶孔菌揮發油具有作為天然抗氧化劑和抑菌劑的潛力，同時也為樺褶孔菌資源的綜合開發與利用提供了數據支持。