4種野生百合對鹽堿脅迫生理響應的初步研究

張 婷 徐 捷 李名揚 劉道鳳 石凌銘 陳 鐵

（西南大學園藝園林學院，重慶 400715）

百合（Lilium brownii）是多年生鱗莖植物，其花色艷麗，是重要的觀賞花類[1]，適宜在微酸性土壤中生長，是對鹽堿比較敏感的一類植物。土壤鹽堿度是關系到百合能否正常生長的重要因素，而中國土壤的鹽化和堿化常常同時發生，成分復雜且程度各不相同[2]。土壤鹽分引起植物的滲透脅迫和毒性脅迫，導致生長抑制、發育變化、代謝適應和離子隔離或排斥[3]。

鹽堿逆境的研究在當今農業生產制約因素中是熱點問題之一，許多研究表明，鹽堿脅迫不是單一的鹽、堿2種脅迫的疊加，植物不僅僅會受到鹽脅迫產生的滲透傷害和離子傷害，還受堿脅迫引起的高pH影響，為2種脅迫的協同效應[4]。左志銳[5]研究了東方系百合‘Sorbonne’和亞洲系‘Prato’在不同濃度鹽脅迫和不同生長發育階段下形態指標和生理生化指標的變化，結果表明‘Prato’在耐鹽能力方面較‘Sorbonne’強。高胡靜[6]在同一鹽濃度下對百合不同品種或種的組培苗進行脅迫根據綜合評價，按耐鹽性強弱排序為‘耀眼黃’>‘伯尼尼’>‘真情’>‘元帥’>‘辛普隆’>云南野生百合>麝香百合>‘西伯利亞’。劉衛衛等[7]用不同濃度的NaCl處理百合外植體，發現百合對鹽脅迫特別敏感，隨著鹽濃度的增加，百合不定芽的脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）含量均不斷升高。周葉玲等[8]以采自秦巴山區的5種野生百合為試驗材料，‘Prato’為對照，通過不同鹽濃度處理，在組織培養條件下對各野生百合材料的耐鹽性進行了初步評價，得出耐鹽性強弱排序為‘Prato’>宜昌百合>野百合>山丹百合>寶興百合。綜上所述，關于百合的耐鹽堿性研究一般都集中于單一鹽性物質的耐鹽機理方面，進行耐鹽性的差異排序，且已有一定的研究基礎，但在百合耐復合鹽堿的差異研究，在國內外都少見報道。

野生百合資源在我國分布較廣，部分具有較高觀賞價值和較強抗性，西南和東北地區是我國野生百合集中分布區域之一，其中西南地區最為集中。此區域的野生百合中，宜昌百合是我國的特有野生種，其花清香怡人，具有極高的觀賞價值，抗病能力強，是百合優良親本材料[9]。通江百合強健耐寒、花大芳香，甚是美麗[10]。淡黃花百合植株健壯、花型奇特，耐陰、耐熱性強，是育種的優質種源[11]。毛百合花朵直立，向上開放，是培育直立花品種的重要親本材料[12]。目前，對這4種百合的研究多集中在資源調查、繁殖技術、栽培等方面，尚未發現有學者進行耐鹽堿性研究。本研究通過對4種野生百合鹽堿脅迫下多項生理指標的測定、分析和評價，綜合各項指標及采用隸屬函數分析4種野生百合耐鹽堿性強弱，探討百合耐鹽堿的生理機制，為選育優良親本體系，培育出新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以通江百合（Lilium sargentiae）、毛百合（Lilium dauricum）、淡黃花百合（Lilium sulphureum）、宜昌百合（Lilium leucanthum）4種野生百合為研究對象，采用鱗莖扦插法，選取長勢基本一致的扦插苗作為實驗材料。于2019年11月上旬將百合扦插苗移栽于外口徑12 cm，高10.8 cm的塑料花盆中，盆土為草炭和珍珠巖按體積比為1∶1混合配制，并在盆底部和表層放入1層陶粒，每盆基質量保持一致。實驗于西南大學33教7樓溫室進行，溫室溫度保持在22～25 ℃，進行正常養護管理，度過緩苗期。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹽堿復合處理

于2019年11月19日，對每種百合隨機選取25～30株生長健康，葉片數近似的植株進行脅迫處理。共設置5個處理梯度，分別為0（CK）、40、80、120、160 mmol/L，每個實驗組3個生物學重復，每組處理5～6盆。CK澆Hogland營養液，處理組澆營養液+混合鹽堿（以中性鹽NaCl和堿性鹽NaHCO3按照摩爾比例1∶1混合）[4]，為避免鹽沖擊效應，處理濃度按照40 mmol/L每天遞增，直至最大設計濃度后，開始計算脅迫時間。此后每隔5d的9：00—10：00定期按各處理濃度澆混合液，進行2次后，于脅迫的第11天拍照采樣。

1.2.2 形態表現觀察

參照肖涵等[13]對植物形態評價體系（表1），以植株和葉片形態以及色澤方面為依據，劃分鹽堿脅迫對百合苗影響的程度，以便觀察。

表1 植物生長狀況等級評價Table 1 The grade evaluation of plant growth condition

1.2.3 生理指標測定

于12月2日9：00—11：00采用，使用分析天平秤（精確到0.01 mg）稱取0.5 g葉片樣本，除必須現用葉片外，其余使用錫箔紙包好后及時放入液氮中，待樣本取完后放入?80 ℃冰箱保存，以便使用。使用DDS?309+電導率儀（成都市方舟科技開發公司，中國）測定相對電導率（REC）；葉綠素含量采用丙酮浸提法測定；MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定；Pro含量采用酸性茚三酮法測定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍四唑光還原法測定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定。具體操作均參考李合生[14]實驗方法。

1.3 數據處理

采用隸屬函數法對4種百合的耐鹽堿性進行綜合評價[15]，如果指標與耐鹽堿性成正相關，則按公式（1）計算，如果指標與耐鹽堿性成負相關則按公式（2）計算。使用Microsoft Excel2013制表和作圖，利用SPSS22.0進行標準差分析和顯著性分析。

式中：X(i)為隸屬函數值，X為某一指標平均測定值，Xmax、Xmin分別為參試材料某一指標測定值內的最小值和最大值。

2 結果與分析

2.1 鹽堿脅迫對4種百合形態的影響

通江百合和淡黃花百合形態受鹽堿脅迫影響程度小于毛百合和宜昌百合，宜昌百合受影響程度最重。鹽堿脅迫對植物生長狀況評價結果見表2。

信貸扶貧資金管理方面主要的創新有：第一，借款主體的創新，先后嘗試了直接貸款到戶、扶持經濟實體、支持地方主導產業和龍頭企業，以及直接貸款到戶與委托幫扶貸款相結合等方式；第二，貸款方式創新，1986年以來嘗試了政府信用下的經濟實體貸款、依托社會信用的小額貸款、抵押和擔保為基礎的企業或政府貸款等；第三，貼息方式創新，嘗試了貼息給承貸銀行、貼息給借款人等方式；第四，承貸機構選擇，先后嘗試了商業銀行承貸、政策銀行承貸、地方政府選擇等方式。

表2 鹽堿脅迫對植物生長狀況等級結果Table 2 The evaluation result of plant growth on saline-alkali stress

由表2可知，鹽堿脅迫濃度在40 mmol/L，通江百合和淡黃花百合生長較旺盛，葉質鮮亮、飽滿，和未受脅迫時的生長狀況相近；毛百合和宜昌百合生長良好，葉片較飽滿、略微變淡。脅迫濃度在80 mmol/L，宜昌百合較正常，未出現大面積萎蔫，僅葉色變淡、皺縮，其他3種百合均生長良好，葉片略微變淡、葉質較飽滿。脅迫濃度在120 mmol/L，通江百合和淡黃花百合保持正常生長的狀態，有葉片皺縮、葉片變淡的現象，毛百合和宜昌百合則生長受到了抑制，出現萎蔫皺縮，葉片萎蔫下垂、暗淡失綠的趨勢。脅迫濃度在160 mmol/L，宜昌百合生長受到了嚴重抑制，出現萎蔫失水，葉片皺縮嚴重、失綠變黃，其余3種百合生長也受到了一定程度的抑制，出現非常明顯的葉質萎蔫，葉片失綠。

2.2 鹽堿脅迫對4種百合生理生化指標的影響

2.2.1 鹽堿復合脅迫對光合色素的影響

由圖1可知，隨著鹽堿脅迫濃度的增大，4種百合的葉綠素含量均呈下降趨勢，除通江百合外，其他3種百合的類胡蘿卜素含量均有增有降。

圖1 鹽堿脅迫對4種百合葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響Fig. 1 Effects of saline-alkali stress on chlorophyll and carotenoid contents of 4 lily species

當脅迫濃度為160 mmol/L，4種百合的葉綠素含量降幅較CK均達到最大，其中，毛百合的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素含量的降幅最大，分別為47.83%、59.06%、52.29%；而宜昌百合的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素含量的降幅最小，分別為23.35%、19.92%、21.61%；通江百合的類胡蘿卜素含量降幅最大，為58.43%。當脅迫為40 mmol/L時，毛百合與通江百合、淡黃花百合的葉綠素含量差異顯著（P<0.05）；鹽堿脅迫160 mmol/L時，通江百合與其他3種百合的葉綠素a和葉綠素含量差異顯著（P<0.05）。

2.2.2 鹽堿脅迫對滲透調節物質含量的影響

鹽堿脅迫對4種百合滲透調節物質的影響見表3，鹽堿脅迫下4種百合滲透調節物質含量相對變化量見表4。

表4 鹽堿復合脅迫對4種百合質膜穩定性的影響Table 4 Effects of saline-alkali stress on membrance permeability of 4 lily species

由表3、圖2可知，宜昌百合可溶性蛋白含量隨著鹽堿脅迫濃度增加呈現持續上升的趨勢，而其他3種百合均先升高后降低，且幅度均不明顯。通江百合在脅迫濃度80 mmol/L處到達峰值，為CK的1.07倍；毛百合和淡黃花百合峰值出現在脅迫濃度120 mmol/L，分別為CK的1.18倍、1.06倍；宜昌百合的峰值在脅迫濃度160 mmol/L，為CK的1.15倍。在CK中，毛百合與其他3種百合差異顯著（P<0.05）；脅迫濃度為160 mmol/L，宜昌百合與其他3種百合差異顯著（P<0.05）。

圖2 鹽堿脅迫下4種百合滲透調節物質含量相對變化量Fig. 2 The relative variation of osmotic adjustment substance of 4 lily species under saline-alkali stress

表3 鹽堿脅迫對4種百合滲透調節物質的影響Table 3 Effects of saline-alkali stress on osmotic adjustment substance of 4 lily species

隨著鹽堿脅迫濃度不斷增加，通江百合、毛變百合、宜昌百合的可溶性糖含量變化趨勢均是先增后減，且含量峰值均出現在80 mmol/L時，3種百合可溶性糖含量上升的總幅度最大的是毛百合，為223.89%，其次是通江百合和宜昌百合，分別為115.30%、106.79%。淡黃花百合的可溶性糖含量則小幅持續上升，脅迫濃度為160 mmol/L，較CK增加了42.53%。當脅迫濃度在40、160 mmol/L時，淡黃花百合與其他3種百合差異顯著（P<0.05）；在其余2種濃度下，毛百合與宜昌百合、淡黃花百合差異顯著（P<0.05）。

4種百合的Pro含量隨鹽堿脅迫濃度增加呈升高趨勢，但幅度和增長動態有所不同。通江百合和淡黃花百合上升速度較緩慢；宜昌百合在4種百合中Pro含量積累最多，在脅迫濃度120 mmol/L后，增幅較大，在脅迫濃度為160 mmol/L時的Pro含量為CK的129.96%；其次是毛百合，為85.97%，。CK組通江百合Pro含量高于其他3種，淡黃花百合與其他3種百合差異顯著（P<0.05）；其余脅迫濃度下，宜昌百合與毛百合、淡黃花百合差異顯著（P<0.05）。

2.2.3 鹽堿脅迫對質膜穩定性的影響

結合表4和圖3可知，隨著鹽堿脅迫濃度的增加，4種百合REC均呈緩慢上升趨勢，種間增幅差異不明顯，當脅迫到最高濃度160 mmol/L時，4種百合REC分別是CK的1.41倍、1.49倍、1.35倍、1.46倍。淡黃花百合的REC在脅迫前后均高于其他3種百合，脅迫濃度在120 mmol/L之前，淡黃花百合與其他3種百合差異顯著（P<0.05），當脅迫濃度達到160 mmol/L時，宜昌百合與毛百合、通江百合差異顯著（P<0.05）。

圖3 鹽堿脅迫下4種百合質膜調節物質相對變化量Fig. 3 The relative variation of plasma membrane regulators of 4 lily species under saline-alkali stress

4種百合隨著鹽堿脅迫濃度的增加MDA含量均先增后減，且變化量差異較明顯。4種百合與CK增量的峰值均出現在脅迫濃度80 mmol/L，MDA含量上升的總幅度最大是淡黃花百合，為125.32%；其次是宜昌百合、毛百合，分別為80.85%、68.41%；最小的是通江百合，為39.94%。4種百合中，淡黃花百合的MDA含量在受到鹽堿脅迫后均高于其他3種。CK中毛百合與其他3種百合差異顯著（P<0.05）；受脅迫后，淡黃花百合與宜昌百合、通江百合差異顯著（P<0.05）。

2.2.4 鹽堿脅迫對活性氧代謝的影響

鹽堿脅迫對4種百合SOD活性的影響見表5，鹽堿脅迫下4種百合SOD活性相對變化量見圖4。結合表5和圖4可知，隨著鹽堿脅迫濃度的增加4種百合的S0D活性均先升高后降低，至脅迫濃度80 mmol/L時SOD活性達最大值，說明SOD活性隨著鹽堿脅迫程度的增加受到了抑制。

圖4 鹽堿脅迫下4種百合SOD活性相對變化量Fig. 4 The relative variation of superoxide dismutase activity of 4 lily species under saline-alkali stress

表 5 鹽堿脅迫對4種百合SOD活性的影響Table 5 Effects of saline-alkali stress on superoxide dismutase activity of 4 lily species

脅迫濃度160 mmol/L，通江百合、宜昌百合分別比CK下降36.30%、19.38%；脅迫濃度80 mmol/L，毛百合、淡黃花百合分別比CK增加11.03%、19.07%。CK組4種百合中，通江百合與其他3種百合差異顯著（P<0.05）；脅迫濃度至120 mmol/L之后，毛百合與淡黃花百合差異顯著（P<0.05）。

2.3 鹽堿耐性綜合評價

以4種百合各項生理指標的平均隸屬函數值作為百合耐鹽堿性的綜合評價標準，數值越大說明其耐鹽堿性越強。由表6可知，4種百合耐鹽堿性能力從大到小為淡黃花百合>通江百合>毛百合>宜昌百合。

表6 種百合耐鹽堿性生理指標平均隸屬函數值Table 6 Average subordinate function on saline-alkali resistance index of 4 lily species

3 結論與討論

植物在生長過程中往往會遭受到各種逆境的傷害，而植物的鹽堿耐性研究一直是逆境研究中的一個重要研究方向。在鹽堿濃度過高的條件下會導致細胞受傷害或死亡，往往有通過一些外觀形態體現，經形態評價表等級評定得出。在本研究中，當脅迫濃度達到160 mmol/L，宜昌百合生長受到嚴重抑制，葉片黃化、萎蔫下垂，枯葉較多，其他3種百合受抑制程度小于宜昌百合，呈現葉片失綠變淡，表明其耐鹽堿性強于宜昌百合。通江百合與淡黃花百合在受到低濃度鹽堿脅迫時，其外觀形態表現較對照無明顯差別，這也體現植物外部形態變化相對于生理變化會相對滯后[16]。

葉綠素是一種重要的光合色素，植物光吸收中起核心作用。其含量的高低能一定程度上衡量植株的抗逆性[17]。類胡蘿卜素不僅直接參與光吸收也能防止前體細胞發生光氧化，保護葉綠素免受破壞。在研究中，4種百合的葉綠素含量呈下降趨勢，說明鹽堿脅迫抑制了葉綠素的合成，其光合產量減少，這與魏祎等[18]關于東方系百合‘ 羅迪納’的研究相一致。除通江百合外的3種百合的類胡蘿卜素含量略有增減，可能與類胡蘿卜素可以作為植物體內的內源抗氧化劑有關，白文波等[19]指出在短期鹽堿脅迫下，一些植物的類胡蘿卜素反而上升的推論。可見，鹽堿脅迫下類胡蘿卜素含量變化因植物不同而異。

植物的滲透調節物質主要分為兩大類，無機滲透調節物質和有機滲透調節物質等[20]。Pro、可溶性糖、可溶性蛋白是百合體內重要的有機滲透調節物質，在鹽堿脅迫條件下百合可以通過大量累積Pro和可溶性糖來加強滲透調節，緩解鹽害，表現出含量增加，直至細胞膜受損嚴重，達到細胞耐鹽堿閾值后開始下降。本研究結果顯示，隨鹽堿脅迫濃度的增大，首先快速積累的滲透調節物質是可溶性糖，說明百合可通過積累糖類物質來抵抗鹽堿脅迫，當脅迫濃度超過80 mmol/L后，通江百合、毛百合、宜昌百合可溶性糖的含量開始逐漸下降，說明百合的滲透物質代謝系統受到破壞，可能是鹽堿脅迫后期高pH影響，對百合的滲透代謝系統造成了損害，與劉鐸等[21]的研究中類似。而3種百合的Pro含量開始快速積累，表明Pro原是脅迫程度的產物，而不是滲透脅迫的產物。這可能是百合對鹽堿脅迫有一定的耐受性，當超過耐受范圍時大量積累Pro，以此緩解鹽堿脅迫帶來的傷害，直至承受不住高鹽堿脅迫作用而失效，在垂絲海棠（Malus halliana）[4]的耐鹽堿性試驗中也有相似的結果。研究結果一致。可溶性蛋白在植物體內主要包括一些代謝過程的酶類和滲透調節蛋白等物質，維持著細胞內較低滲透壓[22]。通江百合、毛百合、淡黃花百合在鹽堿脅迫后體內的可溶性蛋白含量先上升后下降，這與劉鳳岐等[23]在對4種燕麥（Avena sativa）的耐鹽性評價中結果類似。但4種百合的可溶性蛋白含量變化不明顯，且有出現下降趨勢的原因究竟是代謝出現異常，合成受到阻礙，還是在機制調節過程中可溶蛋白被降解，還需要做深入研究。由此推測出可溶性蛋白對百合滲透壓的調節不起主要作用。

另外，Pro是一種理想的滲透調節物質；Pro和其他一些可溶性物質的累積可以降低細胞的水勢,進而驅使水分進入細胞或降低水分從細胞中流出，幫助細胞抵抗鹽堿脅迫，是植物抵抗高鹽環境的重要物質[24]。4種百合的Pro含量均表現為不斷增加，說明百合的耐鹽堿性與體內Pro的積累有一定關系，這與于爽等[25]對龍葵（Solanum nigrum）和董靜等[26]對馬齒莧（Portula caoleracea）的鹽堿脅迫研究結果相一致。

植物受到鹽離子的毒害時，細胞膜系統是主要受害部位，鹽堿脅迫會破壞質膜透性，造成細胞膜過氧化，選擇性降低或喪失，細胞內的電解質外滲，而使組織浸出液的REC升高[27]。MDA是由于活性氧攻擊細胞膜上的膜脂產生的，是反應細胞膜脂過氧化程度的重要指標，可以間接反應細胞的受損程度。本研究表明，4種百合隨著鹽堿脅迫濃度的增加，REC升高，說明百合的細胞膜透性遭受破壞，大量離子外滲，這與劉曉涵等[28]關于煙草（Nicotiana tabacum）的研究結果相似。MDA含量隨鹽堿濃度的增加呈現先上升后下降現象，說明百合體內的活性氧隨著增加，造成膜質過氧化傷害，這與李瑩瑩等[29]對猴樟（Cinnamomun bodinieri）幼苗的探究結果一致。在脅迫濃度到達80 mmol/L之后，MDA含量開始下降，這表明百合可能是在一定的脅迫濃度范圍內，隨著MDA含量積累到一定值后會觸發植物體內的清除MDA的酶促機制，相關酶的快速合成導致MDA的分解下降。

SOD是一種極其重要的并且在各種生物體內普遍存在的防止活性氧化物毒害的抗氧化酶，在植物應激反應中發揮了重要的作用，并在整個活性氧清除機制中扮演最重要的角色。因此可以根據保護酶活性的強弱來判斷植物抗鹽堿能力的強弱[30]。本研究中4種百合的SOD活性以80 mmol/L為峰值先升高后減低，這與劉榮等[31]在研究百合對鹽脅迫的生理反應中得出的SOD活性隨著鹽脅迫時間的延長先升后降的結果相一致。并且在蒙古柳（Salix linearistioularis）[32]和菊花（Dendranthema morifolium）[33]等植物的耐鹽性研究結果中，也有相似的變化。通過研究機理發現，百合在低鹽堿脅迫濃度下，主要依靠提高SOD的活性來清除活性氧、自由基，從而使百合對鹽堿脅迫有一定的耐受能力，當脅迫濃度超過一定值后，植物體的新陳代謝紊亂，致使活性氧清除機制遭到破壞，使其酶活性下降，SOD不足以清除植物體內產生的活性氧、自由基等[34]，導致百合對鹽堿傷害的防御力降低。

植物受到鹽堿脅迫后其生理機能和結構較為復雜，決定了不能從單項機理研究去準確地評價某一植物的耐鹽堿性[35]。在本研究中，隨著濃度增加，受脅迫表現逐漸明顯。百合的光合作用下降，有機物積累量降低；細胞膜膜脂氧化程度加劇，完整性被破壞；細胞的活性氧清除，酶活性升高；細胞滲透壓增大。在鹽堿脅迫濃度≤160 mmol/L的情況下，利用隸屬函數分析得出耐鹽堿性排序為淡黃花百合>通江百合>毛百合>宜昌百合。由此得出淡黃花百合和通江百合對鹽堿生境具有較強耐性，為野生百合的耐堿性篩選奠定了基礎，以期為更好地利用野生百合資源，提高百合的耐鹽堿性提供理論性支持。