食管癌長非編碼RNA與腫瘤干細胞的研究進展

龔小林綜述 謝宇杰，王茂生審校

1.廣東醫科大學，廣東 湛江 524000；2.高州市人民醫院胸外科，廣東 茂名 525200

食管癌是世界上發病率第七、癌癥死亡率第六的一種常見惡性腫瘤，每20例癌癥患者死亡，就有一例死于食管癌，它主要集中在東亞與南非的高發病的國家中[1]。食管癌在我國的發病率及死亡率明顯升高，我國的食管癌患者占全球一半以上，其中發病率居第六，癌癥死亡率居第四[2]。我國食管癌與西方國家的病理類型差異較大，西方國家以食管腺癌為主，而在我國食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)占據食管癌發病率的90%以上。食管癌的5年生存率僅為15%～20%，它的預后與腫瘤的分期相關[3]。早期食管癌以手術治療為主，但多數食管癌發現時多為局部晚期患者，首選治療方法是新輔助放化療(nCRT)，然后是根治性手術。遺憾的是，大約20%的患者根本不會有病理反應，超過50%的患者沒有充分的病理反應，甚至大多數患者發生病理完全反應后，會出現早期復發和遠處轉移[4]。而導致腫瘤復發轉移的重要原因是存在于腫瘤內的極少數細胞，這些細胞具有無限增殖、自我更新及多向分化潛能，它們是腫瘤無限增殖、復發和轉移的根源。此概念的提出為研究食管癌的發生與發展提供了一個新的視野，因此，研究具有更高治療抗性和轉移潛能的細胞亞群更為重要，即所謂的腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)。

近年來，長非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)被普遍定義為超過200個核苷酸的非蛋白編碼RNA分子，在世界各地得到了廣泛的研究[5]。lncRNA是一組新的非編碼RNA，位于細胞核或胞漿組分中，被發現是機體生理和病理過程的重要調節因子，特別是在癌癥中。到目前為止，已經通過高通量技術鑒定了5 000多個人類lncRNA[6]。lncRNA被報道參與了惡性腫瘤的多種生物學行為，包括促進細胞增殖、細胞遷移與轉移[7]、細胞凋亡[8]、細胞周期及化療耐藥性等[9]。LncRNA已被報道與食管癌的多種惡性生物學行為相關，其中也包括與食管腫瘤干細胞的相關行為。

1 與食管癌相關的腫瘤干細胞惡性生物學行為

目前已知食管癌腫瘤干細胞參與了食管癌的多種惡性生物學行為，總體而言，腫瘤干細胞被認為是腫瘤中的小部分細胞，但它們主要是負責腫瘤的自我更新、轉移能力和治療耐藥性等，由于其特定的形態學和生物學特征，它們往往對治療產生耐藥性，進而導致腫瘤的轉移和復發。另一方面，多項研究表明上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EΜT)與腫瘤干細胞間存在多種聯系。當EΜT在癌癥中異常激活時，細胞獲得了有助于自我更新能力的干細胞屬性，并且能夠分化為腫瘤中的所有細胞類型。由此產生的即癌癥干細胞具有癌癥的各種惡性生物學特征，包括永生性復制、抵抗凋亡、侵襲性增加等[10]。此外，腫瘤干細胞模式認為化療后剩余的腫瘤細胞具有更強的再生能力，放化療被認為是一個富集腫瘤干細胞的過程。腫瘤干細胞通過多種分子機制，如藥物外排泵的上調，或增強對ROS93-97的保護等，進而采取一種靜止狀態成為放化療抵抗的重要原因[11]。

2 lncRNA調節食管癌的EMT與轉移

上皮細胞-間充質轉化是指上皮向間充質狀態的轉變，在這個過程中，細胞表達的黏附分子改變，進而增加了遷移和侵襲能力。目前已有研究表明，靶向lncRNA抑制EΜT有望抑制惡性腫瘤的發生、發展；lncRNA LBX2-AS1高表達于食管癌組織中，并通過促進腫瘤EΜT增加食管癌的惡性生物學特征[12]。另外，lncRNA NΜR高表達于ESCC組織中，作為ESCC腫瘤轉移和耐藥性的關鍵調節因子，它的上調與腫瘤轉移有關，并與ESCC患者的整體生存率較差相關。在體外功能實驗方面，NΜR能促進腫瘤細胞的遷移和侵襲，抑制順鉑誘導的細胞凋亡，提高ESCC細胞的耐藥性[13]。有研究表明通過沉默LncRNA-ECΜ的表達能夠顯著降低食管癌細胞系TE-1和Eca109細胞的侵襲和轉移，而LncRNA-ECΜ的過度表達促進了兩種細胞系的侵襲和轉移[14]。敲除FTH1P3可顯著降低ESCC細胞的增殖、遷移和侵襲能力，沉默FTH1P3可降低食管癌細胞系EC9706和EC1中特異性蛋白1(SP1)和NF-κB(P65)的表達[15]。ESCC的另一抗癌基因，lncRNA LINC00675通過抑制Wnt/β-catenin信號抑制腫瘤的啟動發生和EΜT[16]。另一項研究中，研究者發現lncRNA RP11-766N7.4在ESCC組織和細胞系中表達下調，與淋巴結轉移、腫瘤的分期和患者生存等相關。功能實驗研究也表明，lncRNA RP11-766N7.4通過抑制EΜT的過程從而抑制食管癌細胞遷移和轉移[17]。

研究表明lncRNA SOX2OT在腫瘤的發生和進展以及調節干細胞的多能性狀態起著重要作用[18]。高lncRNA-HOTAIR表達與食管癌患者的整體生存顯著相關，體外實驗表明lncRNA-HOTAI增加了食管癌細胞增殖、侵襲和遷移，并促進了EΜT。分子機制相關的研究顯示lncRNA-HOTAIR與mir-148構成海綿結構，從而調節Snail2的表達，最終促進EΜT[19]。

3 lncRNA調節食管癌的放化療耐性

目前有研究表明lncRNA TUSC7的過度表達，調控miR-224的低表達從而抑制了ESCC細胞的增殖、克隆形成和化療耐藥，最終促進了癌細胞凋亡。另外，該研究也證實了miR-224與DESC1特異結合，與DESC1的表達呈負相關。TUSC7通過抑制miR-224增加DESC1的表達，從而抑制ESCC細胞的增殖和化療耐藥，信號通路的研究也表明了DESC1通過EGFR/AKT信號通路抑制了ESCC細胞的化療耐藥[20]。

此外，WISP1已被證明與ESCC腫瘤細胞中的EΜT表型密切相關，并作為食管鱗狀細胞癌放射治療的獨立預后因素。該研究表明WISP1是逆轉食管鱗狀細胞癌EΜT相關的放射治療抵抗的一個關鍵治療靶點，可以作為食管癌放療患者的獨立預后因子[21]。

lncRNAAFAP1-AS1的高表達預測了經放化療治療的ESCC患者的放化療耐性和不良預后[22]，因此可作為放化療的食管鱗癌預測標志物。

此外，一項研究使用Kaplan-Μeier生存分析顯示，lncRNA LOC285194低表達患者的無病生存率(DFS)(P＜0.001)和總生存率(OS)降低(P＜0.001)。進一步的多變量分析確定該分子為多變量獨立預后風險因子(P=0.001)。它的表達降低與食管鱗狀細胞癌放化療耐藥及預后不良的密切相關[23]。

食管癌細胞中lncRNA linc-VLDLR和ABCG2基因的高表達影響食管癌耐藥的形成，研究表明耐藥細胞釋放的細胞外囊泡可上調食管癌細胞ABCG2的表達，從而調節食管癌細胞的耐藥性，這與細胞外囊泡攜帶的linc-VLDLR有關[24]。

4 食管癌lncRNA與腫瘤干細胞研究相關的實驗技術

鑒定ESCC組織中lncRNA的異常表達對于研究lncRNA在ESCC中的作用具有重要意義。定量實時PCR(Q-PCR)是檢測ESCC組織中異常lncRNA表達的經典方法[25]。近年來，現有的下一代測序(NGS)技術為研究人員提供了更完整的ESCC腫瘤與正常組織之間的lncRNA表達譜。例如，WANG等[26]用NGS技術檢測ESCC患者腫瘤及鄰近正常組織中402個上調和741個下調的lncRNA。

此外，在腫瘤基因組圖譜(TCGA)的分析中，發現了食管癌兩種主要組織學類型之間存在顯著不同分子變化的多種遺傳改變模式。在食管腺癌中，ERBB2、VEGFA、GATA4和GATA6的表達失常可能比ESCC更頻繁。相反，在ESCC中，mTOR信號通路基因PIK3ca/AKT和PTEN、TP63/SOX2擴增和Notch1突變的改變更頻繁[27]。TCGA分析可用于ECCS的表達鑒定和驗證其潛在的新的生物標志物。

成球能力鑒定是腫瘤干細胞體外鑒定的一個重要方法，其測定的是腫瘤細胞在合適的條件培養基中自我更新的能力，一般使用低黏附的培養板防止細胞貼壁，結合使用無血清的培養基(加入B27和合適濃度的生長因子等添加劑，各種腫瘤報道的不盡相同，需要參考相關文獻)，以及使用1%濃度的甲基纖維素抑制細胞聚集，以確保一個細胞球來源于單個細胞等。目前該方法已經在多種腫瘤干細胞的研究中得到應用[28]。

通過移植特定的細胞群，裸鼠腫瘤細胞移植，是檢測腫瘤干細胞的啟動能力的體內實驗，也是檢測腫瘤干性的重要實驗[29]。

機制研究方面，有關調節lncRNA可以通過堿基配對相互作用來調節miRNA的活性，這種lncRNA是一種稱為競爭性內源RNA(competing endogenouse RNAceRNA)的調節模式[30]，有研究表明長非編碼RNAPCAT1是一種新的基于血清的生物標志物，通過海綿狀mir-326在食管鱗狀細胞癌中促進細胞生長[22]。

另一方面，與mRNA相結合的通路研究也見報道。信號通路研究表明，FΜR1-AS1可與TLR7相結合，從而維持ESCC干細胞的特性，并激活下游TLR7/NF-κB信號，促進c-myc的表達，從而誘導ESCC細胞增殖、抗凋亡和侵襲能力。外顯子孵育和共移植試驗表明，FΜR1-AS1外顯子可能從ESCC中分泌，在腫瘤微環境中將干細胞表型轉移到非腫瘤干細胞中[31]。

5 小結

人類目前對于lncRNA的理解還只是冰山一角，隨著高通量測序等技術的成熟，越來越多的lncRNA被發現與研究，包括與食管癌的發生、發展、耐藥性等，其中重要的一點便是食管腫瘤干細胞相關性研究。腫瘤干細胞(CSC)的概念是在四十年前提出的，并指出腫瘤生長類似于健康組織的更新，是由少量的特指干細胞推動的。腫瘤干細胞理論對腫瘤發生與發展過程提出新的理論，這一點已逐漸證實了許多腫瘤都藏匿著干細胞，然而腫瘤干細胞的鑒定和針對腫瘤干細胞的治療方法等方面還沒有得到證實。本文總結了lncRNA在食管癌腫瘤干細胞相關的發生、發展及相關研究方法，闡述了它們在其中的潛在分子機制。目前，越來越多的lncRNA被確定為包括食管癌在內的各種腫瘤的生物標志物或潛在治療生物靶點，但人類對于lncRNA與腫瘤干細胞的相關調控還不清晰，未來應當加深對lncRNA在腫瘤干細胞領域潛在機制的研究，這將有助于發現食管癌的新型診斷和治療方法。