嚙齒類動物局灶性腦缺血模型研究進展

沈亞亭 白秀 王明威 張旭龍 謝西梅

腦卒中是一組急性腦循環障礙所致的局限或全面性腦功能缺損綜合征，常由腦血管阻塞或出血所誘發。其中，缺血性卒中約占總數的87%，且又以局灶性腦缺血更為多見[1,2]。因此制備更有效可靠的局灶性腦缺血動物模型對研究人類缺血性卒中發生、發展的病理生理學機制及其防治意義重大。在對臨床卒中的異質性進行建模時，存在多種不同的局灶性腦缺血模型，每種模型都有其優勢和局限性。因鼠類腦血管結構和生理學特征與人類相似，是實驗中最常選用的動物。故本文將目前最常用的嚙齒類動物局灶性腦缺血模型及其改良方法加以介紹，并討論各種模型的優缺點。

1 線栓法

線栓法是一種近端大血管閉塞的模型，類似于卒中患者的大腦中動脈M1段(即從頸內動脈分叉延伸至側裂)閉塞[3]。Koizum等[4]最早對該模型進行研究和描述，不久Longa等[5]對其加以改進后更為經典。具體制備方法如下：首先將大鼠麻醉后仰臥位固定在手術臺上，頸部常規備皮消毒，然后沿頸部正中做一2～3 cm長的切口，注意避免刺激氣管和迷走神經，分離一側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，并電凝切斷頸外動脈的分支甲狀腺上動脈和枕動脈。線栓的插入位置，有2種方式：(1)自頸外動脈插入線栓：先用動脈夾夾閉頸總動脈和頸內動脈近心端，用縫合線扎緊頸外動脈遠心端，而在近心端打個松散的活結，并在兩縫線間剪開一個微小切口，選擇合適的線栓由此進入，稍系緊頸外動脈近心端的結，以穩定線栓。松開頸內動脈上的動脈夾，線栓沿此前進，直至有輕微阻力即到大腦中動脈起始端為止，此時再一次將頸外動脈近心端的結系緊，松開頸總動脈的動脈夾。 (2)自頸總動脈插入線栓：結扎頸總動脈和頸外動脈近心端，動脈夾夾閉頸總動脈遠心端，在動脈夾近端置一打好松結的縫線備用，再在縫線近端剪一小口將線栓送入頸總動脈過縫線后，系緊縫線以保證線栓能通過，又不見動脈切口滲血，松開動脈夾。若制備永久性缺血模型，則直接剪短血管外的線栓，消毒，縫合頸部切口即可；若要研究缺血性再灌注損傷，則需在特定的阻塞時間后拔栓。經頸外動脈插入的線栓拔栓時，先將頸總動脈近心端用動脈夾夾閉，再解開頸外動脈近心端的縫線將線栓拔出，之后再將縫線扎緊，松開動脈夾，消毒縫合皮膚，放回籠中飼養；經頸總動脈插入的線栓拔栓時，動脈夾夾閉頸總動脈近心端，不必完全退出線栓，以免動脈切口出血，剪去多余線栓，消毒，縫合皮膚，放回籠中飼養，完成造模。

研究表明用來誘導大腦中動脈閉塞的線栓的選擇、處理和再灌注時間與梗死體積、可重復性及死亡率都有很好的相關性[6]。實驗動物麻醉常選用10%水合氯醛(350 mg/kg或0.35 ml/100 g)腹腔內注射，且線栓的長度和粗細與實驗大鼠的體重呈正相關[7]。大多實驗常選用體重為250～300 g的雄性大鼠，這需使用直徑為0.22～0.26 mm的且栓頭涂覆有硅酮、石蠟等的魚線效果最好，線栓的插入深度一般是(18.5±0.5) mm[8-10]。此外，也有Hamberg等[11]開發出球囊導管法被認為是線栓法的改進術式，通過從股動脈放置導絲引導球囊導管經過升主動脈、頸總動脈，然后從頸內動脈入顱，經由改變球囊的大小以實現血流的中斷與再通。又有Jungreis等[12]用導絲永久性阻斷大腦中動脈并用球囊可逆性阻斷頸內動脈，形成腦缺血模型。這種技術，損傷小，重復性好，能夠精確控制缺血灌注時間，但是對技術手法的要求較高，且要在影像學的指引下進行，不如線栓法使用廣泛。

臨床研究中還發現，人類缺血性中風常常不是血管的完全閉塞，且大多數患者在中風后的48 h內會發生由于血栓連續消退而引起的部分自發性灌注，而在動物模型中去除線栓后會出現迅速的再灌注量激增，這與臨床現象存在偏差[13]。此外，該模型也會發生一種在人類中很少見的現象，即大鼠大腦中動脈閉塞120 min或更久后會導致下丘腦自發性高熱，這也成為了此模型的主要缺點[14,15]。

2 光栓法

光栓法即通過向動物血液注入光敏染料，然后使用特定光照射動物腦組織表面激活光敏誘導劑，發生光化學反應后釋放活性氧自由基，導致血管內皮過氧化損傷以及血栓形成，從而造成熒光照射區域缺血性腦損傷[16]。這一模型最初由Watson等[17]于1985年首次介紹。首先將小鼠麻醉后，俯臥固定于立體定位儀上，剃除頭頂部毛發并消毒，矢正中線縱向剪開頭頂皮膚剝離周圍結締組織，暴露顱骨以bregma點為基準原點，于矢狀縫左側2.0 mm，冠狀縫后2.0 mm處為卒中模型窗口，即大腦中動脈遠端額支和頂支的Y形交界處，在解剖鏡下用高速顱骨鉆打磨暴露的顱骨至50 μm左右厚度，保持硬膜完整，直到皮層血管清晰可見。然后通常在尾靜脈注射孟加拉玫瑰紅染料溶液，隨后用定波冷光源 (560 nm)照射卒中窗口，形成實驗動物缺血性腦損傷模型。

有學者對該模型進行了不同的改良，如已經開發出使用圓形激光束及調整照明參數等方式照射卒中窗口，模仿人類腦缺血后所產生的半影帶[18]；也有以單個血管為靶點進行造模，并盡量減少對靶血管周圍組織的不必要的光激活損傷，從而極大限度地提高了動物模型與人類中風的相關性[19]；另有研究者利用立體定向植入光學纖維束以誘導大鼠紋狀體或內囊的梗死[20,21]；此外，Lu等[22,23]在自由活動的大鼠和小鼠中成功誘發了光血栓性中風，由此可以在沒有麻醉干擾的情況下，實時分析急性中風的相關參數，以及研究運動皮層缺血和運動缺陷之間的聯系；Sunil等[24]則充分結合了之前技術的優點，創建了在清醒小鼠中誘導靶向單個血管的光血栓模型，并通過激光散斑對比成像(LSCI)和行為評估，證實了該方法能夠形成可靠的功能缺陷性卒中，可以用于研究卒中后的恢復機制或測試潛在療法對恢復過程的影響。

光栓法模型是一種高度可重復的缺血模型，易于操作，侵入性小，穩定性好，它可產生精確的梗死位置和大小，且具有死亡率低的優點。其梗死灶大小與光敏誘導劑種類、劑量及特定光源的強度、時長相關。目前廣泛應用于缺血后神經行為評估，并且可能對研究自由基清除機制的干預特別有用。該模型誘導的中風，細胞毒性和血管源性的水腫幾乎同時出現，這可能與缺血性損傷和內皮損傷的同時發生有關，而人類卒中的主要特征是細胞毒性水腫，且半影帶是人卒中后保護和治療的主要目標，這便又引出了該模型的另一不足，即缺乏側支血流和幾乎沒有半影帶。

3 開顱手術模型

Robinson等[25]首次制備并描述了該模型，而后Tamura等[26]對實驗動物行開顱手術后，通過電凝閉塞大腦中動脈近端導致皮質和紋狀體梗死的模型也較為常用。具體操作：將大鼠麻醉后側臥于手術臺上，剪去一側外耳道至眼外眥之間的毛發并消毒，在這兩點連線的中點作一長約2 cm的切口。用止血鉗將切口充分暴露，分離肌肉，切斷顳肌，暴露顱骨，并將顴弓離斷除去，暴露卵圓窗，用骨鉆在卵圓窗前3 mm下1 mm處鉆孔，在顯微鏡下可透過硬腦膜看見大腦中動脈，垂直于嗅束上行。挑破硬腦膜，分離大腦中動脈周圍的蛛網膜，暴露大腦中動脈。然后將大腦中動脈挑起后用電凝器凝閉，電凝位置在其分支豆紋動脈之前或靠近頸內動脈處，從而制成腦缺血模型。

除電凝阻斷外，有學者還通過直接離斷和結扎制成永久性缺血模型，或者是通過微動脈夾子、微小金屬鉤等將大腦中動脈從腦表面抬起直至血流中斷，制成暫時性缺血模型[27]。此外，也有研究者通過相對簡單的開顱結扎術閉塞位于淺表大腦皮層的大腦中動脈遠端主干制備模型[28]。張穎等[29]對此模型進一步改進，即先通過顱骨鉆孔電凝大腦中動脈，再中斷雙側頸總動脈血流15 min以建立模型，這會減少側支血流，從而鞏固缺血性損傷，可實現皮質區清晰梗死灶。

該模型的主要特點是能夠在可視化下操作，可直接控制血管閉塞的部位和程度，如果在大腦中動脈近端進行閉塞，將導致影響皮質和紋狀體的聯合梗死，而遠端大腦中動脈的閉塞，結合兩個頸總動脈的短暫閉塞，只會導致皮質損傷[30]。此模型具有成功率高，可重復性好，梗死面積變異性較小，且梗死灶周圍有清晰的半影帶的優點。因此，被廣泛用于評估急性缺血后的神經修復及促進神經可塑性等方面的研究。

4 栓塞中風模型

栓塞性中風模型可分為微球或大球所誘發的栓塞和血栓栓塞性模型兩大類。所有種類的栓塞模型都是Kudo等[31]描述的大鼠血栓栓塞后腦卒中模型的變體。其中微球/大球誘發的栓塞中風模型，通常使用的球體材質有硅樹脂，膠原蛋白，二氧化鈦和葡聚糖等，微球直徑一般是20～50 μm，其誘導過程包括使用微導管經頸外動脈將微球注入頸內動脈或大腦中動脈，并隨血液流動進入腦循環，進而引起多個血管的微栓塞，最終導致多灶性和異質性梗塞。大球模型常選用直徑300～400 μm的球體，與微球操作基本相似。

血栓栓塞性中風模型最常見的是經由頸外動脈向頸內動脈和大腦中動脈注射基于自體血液自發形成的或由凝血酶，纖維蛋白原誘導的具有特定直徑和長度的血塊。具體操作如下：大鼠麻醉后仰臥于手術臺上，經頸部正中切口暴露分離一側頸總動脈，頸外動脈及其甲狀腺上動脈、枕動脈分支，頸內動脈及其分支翼腭動脈。永久性電凝甲狀腺上動脈、頸外動脈遠端、枕動脈，臨時夾閉其他動脈。將PE導管置入頸外動脈腔內，頸內動脈上的夾子松開后，血栓以短暫的爆發力快速注入血管內。然后拔出導管，松開頸總動脈和翼腭動脈上的夾子，縫合皮膚切口。此外，還有通過顯微注射凝血酶來制備小鼠原位血栓栓塞性中風模型，即通過開顱手術，暴露大腦中動脈遠端分支，并用微管將純化的凝血酶注射到血管腔內，注射部位立即形成血纖維蛋白凝塊，從而導致該區域灌注迅速減少，形成梗死體積穩定、可重復性高，且死亡率低的卒中模型[32]。也有學者是將氯化鐵(FeCl3)誘導劑浸泡過的濾紙條直接貼附于覆蓋大腦中動脈主干的硬腦膜上或將其直接貼附于頸總動脈然后在機械刺激下促進氯化鐵觸發的血栓栓塞到大腦中動脈[33,34]。

有研究表明，在人類缺血性中風中，約50%的病例是由于大血管動脈粥樣硬化和動脈粥樣硬化斑塊破裂所致[35]，且血栓栓塞性中風動物模型病理學進程與人類相似，包括細胞毒性水腫，隨后的血管源性水腫，血腦屏障的破壞，半暗帶的出現及炎性反應等，因此血栓栓塞模型與臨床情況更具相似性[36]。其中血塊的大小、成分、位置對于精確地在大腦中動脈附近形成栓塞至關重要，只有當血塊滯留在靠近大腦中動脈分叉處的顱內頸內動脈段和大腦中動脈段時，才能在大腦中動脈區域實現可復制的缺血性損害。此外，實驗制備的血塊成分主要由纖維蛋白組成與人類有很大不同，且梗死的位置和梗死體積變異性較大，故根據其特性該模型常用于評估溶栓治療(rt-PA)的效果或測試新的溶栓劑。而由FeCl3化學誘導所制模型，則特別適用于使用激光散斑流量計或雙光子顯微鏡對大腦皮質進行活體實時研究。

5 內皮素-1模型

該模型是基于內皮素-1的應用，它是持久有效的血管收縮肽，根據其注射的濃度不同，可以改變缺血的嚴重程度和持續時間以及所引起梗塞面積的不同。通常內皮素-1給藥后，腦血流量迅速降低70%～90%，隨著注射時間的延長，內皮素-1的濃度隨之降低，血流便會逐漸恢復，因此該模型常用來模擬短暫性腦缺血的情況[37]。其操作是將內皮素-1直接應用于暴露的大腦中動脈、腦表面或立體定向注射到腦實質通過其收縮血管的特性來誘發梗塞。腦內注射內皮素-1會造成外側紋狀體和皮質聯合梗死，而硬膜下靶血管給藥可導致僅局部皮質缺血性損傷。此外，也有學者是將引導套管預先植入所要梗塞的部位，從而可將內皮素直接注入到有意識的動物體內，這便能夠消除麻醉所產生的不良影響，并在ET-1誘導卒中的同時動態觀察其引起的組織學損傷和神經功能缺損的程度，適用于評價神經保護藥物的療效[38,39]。

內皮素-1模型較以往手術方法機械損傷輕微，死亡率較低，且可在淺表或深部腦區直接誘發缺血；而缺點則是應用此法誘導的缺血發展緩慢，僅伴有輕微的水腫，且組織再灌注會根據離給藥部位的遠近而產生不可控的變化，因此梗塞體積變異性高[40]，從而無法準確模擬人類大多數中風，可能僅對于模擬腔隙性中風和長期恢復機制的研究更有用。此外，有研究表明內皮素-1受體和內皮素-1轉化酶也在神經元和星形膠質細胞表達，并且內皮素-1的應用可以誘導星形膠質細胞的增殖、促進軸突的萌動，這可能會對腦卒中后恢復機制的研究產生干擾[41-43]。

6 自發性卒中模型

高血壓是中風初期和復發的主要危險因素，其在腦卒中患者中的破壞性影響促使我們有必要將動脈性高血壓動物模型納入腦卒中的研究中。中風研究中代表性的高血壓動物模型有中風易發性自發性高血壓大鼠(SHRSP)和中風易發性腎血管性高血壓大鼠(RHRSP)，兩者都有較高的自發性中風發生率。1963年岡本和青木開發的中風易發性自發性高血壓大鼠(spSHR)，類似于人類的原發性高血壓[44,45]。spSHR在出生6周后通過高鹽飲食形成高血壓，12周后迅速加重為惡性高血壓(>240 mm Hg)，從而可導致在紋狀體和皮層下白質中出現小的皮層下梗死，梗死灶的形成是由高血壓性小血管疾病引起的，伴隨小動脈壁增厚、纖維蛋白樣壞死和血管周圍間隙增大，與人類病理類似，可以很好地模擬人類腔隙性中風[46-48]。此外，中風易發腎血管性高血壓大鼠(RHRSP)于1998年引進，是一種獨立于遺傳缺陷的獲得性高血壓動物模型，屬于繼發性高血壓[49,50]。在這個模型中，當大鼠年輕時(80～100 g)，暴露雙腎動脈的根部并用直徑0.3 mm的環狀夾子夾緊，血壓在雙側腎動脈收縮后的第一周開始升高，并在第3個月左右持續升高至180～220 mm Hg，約6個月后逐漸達到并穩定在200～240 mm Hg。由于腦動脈的形態和生理變化與高血壓患者相似，大鼠的自發性腦卒中發生率高于60%。但由于自然卒中的發生時間不確定，且基于腦卒中發病率隨季節變化而波動的事實，Liu等[51]首次提出了利用環境控制室，在RHRSP中產生可重復的快速降溫來誘發自發性腦卒中，該方法的優點是建立了與人類氣象條件相關的自然卒中動物模型，使研究者不必等待很長時間。

該動物模型具有以下優點:腦血管病理生理學與人類高血壓高度相似、造模技術簡單；但也存在造模周期長，卒中發生類型不確定的局限。因此也可使用RHRSP聯合以上各種造模方法制備腦缺血模型，以更好地模擬人類高血壓動脈硬化腦卒中模型。

7 不足與展望

造模時，所選動物的年齡、性別和動物品系等都會對卒中模型性能和結果產生影響，有研究表明年齡是腦卒中動物模型臨床前研究的關鍵因素[52]。缺血性卒中主要發生在老年人，但是目前大多數實驗性中風的活體動物模型幾乎普遍選用年輕的成年嚙齒動物來完成。眾所周知，老年動物卒中后通常神經功能損害更嚴重，且恢復能力遠低于年輕動物,因此使用年輕動物造模與臨床實際存在偏差[53]。性別可能是影響中風結局的另一個因素。許多研究也表明，雌性激素在年輕成年動物中具有神經保護作用,這可能會對卒中后神經保護機制的研究產生干擾[54]。此外，即使采用相同的缺血模型制備方法，不同的菌種和同一菌種的不同菌株也可能產生不同的結果。例如，Sugimori等[55]發現，使用氪(Kr)激光誘導光血栓閉塞MCA,BALB小鼠和比C57BL/6小鼠相比，所產生的梗死灶面積更大且可重復性更高。因此，根據研究目的選擇合適的動物品系是很重要的。除上述因素外，考慮到卒中患者往往伴有一種或多種并發癥,實驗中可應用高血壓品系或糖尿病品系等的實驗動物以模擬人類病情的復雜性。另外，在動物建模過程中,注意對多種生理性變量的優化和把控,如血流量[56]、體溫[57]、麻醉[58]等，也可增進動物模型與人類臨床實際的相關性。

人類腦卒中的相關認識研究大都是通過動物實驗獲得的，且基于動物模型的研究也開發測試了許多新的藥物和療法。但是由于腦血管疾病的復雜性和患者自身狀況的多樣性，試驗過程中發現的許多神經保護策略未能在人類身上成功轉化，想要建立通用型動物模型顯然也是不切實際的。因此在不斷規范和量化實驗模型相關操作、改進技術的同時，研究者也要根據具體情況做綜合立體化的考量，選擇合適的造模方法，以便從動物組織中獲取更接近人類腦卒中疾病變化真實情況的結果，從而提高實驗中有效療法轉化為臨床治療的潛力。