牡丹皮提取物抑菌性能及其在漱口水中的應(yīng)用研究

胡永志 黃柳云 李江平 韋玉金 梁瑩瑩

(柳州兩面針股份有限公司，545001)

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)人群口腔患病率達(dá)80%以上，并已威脅到各個(gè)年齡的人群，口腔護(hù)理迫在眉睫。常見(jiàn)的口腔問(wèn)題包括齲病、牙周炎等。具相關(guān)研究顯示，口腔菌屬的分類也較細(xì), 以厭氧菌為多。其中，齲病的主要致病菌為變形鏈球菌，是造成齲齒的主要原因；牙周炎的主要致病菌為牙齦卟啉單胞菌，其可能作為內(nèi)源性致病菌在特定條件下過(guò)度生長(zhǎng)而導(dǎo)致牙周破壞，同時(shí)也是口臭主要致病厭氧菌，甚至是成人失牙的主要原因。這些口腔問(wèn)題的存在，會(huì)進(jìn)一步破壞牙齒硬組織和牙齒周圍支持組織，除影響咀嚼、言語(yǔ)、美觀等功能外，還會(huì)引起社會(huì)交往困難和心理障礙；甚至有些微生物長(zhǎng)期存在于口腔中，可導(dǎo)致或加劇某些全身疾病如冠心病、糖尿病、胃病等，危害全身健康，影響生命質(zhì)量。

要預(yù)防口腔疾病最簡(jiǎn)單有效的方法是注意口腔衛(wèi)生。選擇合適的口腔護(hù)理產(chǎn)品可以有效地控制口腔有害細(xì)菌增長(zhǎng)，使我們?cè)谌粘Ｉ钪休p松地預(yù)防口腔疾病的發(fā)生。植物是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的天然藥物的重要來(lái)源，來(lái)源于植物的抗菌物質(zhì)受到了廣泛關(guān)注。例如，由植物牡丹皮提取的丹皮酚，相比之下更安全，毒副作用和刺激性更小，不易引起人體微生態(tài)系統(tǒng)失調(diào)的狀況。

當(dāng)前，人們?cè)谌粘Ｉ钪星鍧嵖谇粫r(shí)使用頻率最高的即為牙膏和漱口水，且漱口水近年來(lái)在人群中的消費(fèi)勢(shì)頭越來(lái)越高，使用頻率也逐年增加。故本實(shí)驗(yàn)選用漱口水作為配方基底，添加植物牡丹皮提取的丹皮酚，通過(guò)分析其對(duì)變性鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌的MIC值，以及對(duì)細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線抑制性能的研究，結(jié)合漱口水中保濕劑、增溶劑、香精等基底配方研究，開(kāi)發(fā)出具有抑菌性能的植物漱口水。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

丹皮酚：本實(shí)施例采用的牡丹皮提取物，是牡丹皮原藥經(jīng)水蒸氣蒸餾提取后，抽濾后得到粗結(jié)晶，再按照粗結(jié)晶∶95%乙醇∶純化水=1∶4∶15的比例，對(duì)粗結(jié)晶進(jìn)行純化，0℃冷卻靜置48h，析出針尖狀結(jié)晶且含量>90%的丹皮酚成分。

菌種：牙齦卟啉單胞菌(ATCC 33277)、變形鏈球菌(ATCC 25175)標(biāo)準(zhǔn)菌種，由廣東省微生物分析檢測(cè)中心提供。

培養(yǎng)基：BHI液體培養(yǎng)基、BHI固體培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液體培養(yǎng)基除氧

在培養(yǎng)基配置時(shí)，添加厭氧指示劑刃天青，液體培養(yǎng)基含氧時(shí)指示劑變粉紅色，低氧至無(wú)氧時(shí)無(wú)色；使用99.99%純度氮?dú)膺M(jìn)行培養(yǎng)基充氮除氧，以0.1～0.15L/min，30min的流速和時(shí)間進(jìn)行充氮處理，經(jīng)過(guò)高溫滅菌后所得低含氧或無(wú)氧的BHI液體培養(yǎng)基。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)

菌懸液的制備：將試驗(yàn)菌48h BHI液體培養(yǎng)物用除氧液體培養(yǎng)基稀釋，制成所需菌懸液(要求的濃度為：用加樣器取1μL～2μL菌懸液點(diǎn)種于固體培養(yǎng)基的表面，接種后所形成的菌液圈直徑約為5mm～8mm，每點(diǎn)菌液圈回收菌數(shù)為1×104～9×104cfu/mL)。

采用瓊脂稀釋法以及點(diǎn)種法，進(jìn)行對(duì)倍稀釋，測(cè)試5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.3125mg/ml、濃度下丹皮酚的最小抑菌濃度。以不含丹皮酚成分的BHI固體培養(yǎng)基平板作為對(duì)照組，最后將點(diǎn)種有菌液的平板放置于厭氧袋中，37℃下厭氧培養(yǎng)18～24h，菌落生長(zhǎng)被完全抑制的最低抵抗菌液濃度為該樣品的對(duì)受試菌的MIC值。

1.2.3 抑菌實(shí)驗(yàn)

采用細(xì)胞生長(zhǎng)曲線監(jiān)測(cè)法進(jìn)行抑菌效果測(cè)試。以漱口水中丹皮酚有效含量值配制成細(xì)菌培養(yǎng)液，作為試驗(yàn)組；以不含丹皮酚的細(xì)菌培養(yǎng)液，作為對(duì)照組，35℃～37℃培養(yǎng)，厭氧條件下，每間隔1小時(shí)，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定一次OD值，代表測(cè)試細(xì)菌濃度及生長(zhǎng)情況。其中，牙齦卟啉單胞菌(ATCC 33277)測(cè)定波長(zhǎng)為450nm，變形鏈球菌(ATCC 25175)測(cè)定波長(zhǎng)為600nm。樣品組生物生長(zhǎng)曲線低于對(duì)照組生物生長(zhǎng)曲線，標(biāo)識(shí)為在該濃度下對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)起到抑制作用，具有抑菌效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 最小抑菌濃度(MIC)試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹皮酚不能完全溶解于培養(yǎng)基中，會(huì)有晶體析出。故在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前先用一定濃度的乙醇對(duì)丹皮酚進(jìn)行溶解、稀釋。首先測(cè)定乙醇對(duì)牙齦卟啉單胞、變形鏈球菌的MIC值，再確定該濃度下丹皮酚的溶解度，最后使用低于其MIC值并能完全溶解丹皮酚的乙醇濃度作為溶劑，以消除乙醇對(duì)丹皮酚抑菌效果的影響。

由表1可知，乙醇濃度<5%時(shí)，對(duì)牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌無(wú)抑菌作用；濃度為4%～5%時(shí)，能完全溶解相應(yīng)濃度丹皮酚。故選擇4%～5%濃度的乙醇作為丹皮酚在固體培養(yǎng)基的溶解劑進(jìn)行丹皮酚MIC實(shí)驗(yàn)。由表2可知，丹皮酚對(duì)供試菌牙齦卟啉單胞菌的抑菌MIC值范圍為0.625～1.25mg/ml，對(duì)供試菌變形鏈球菌的抑菌MIC值范圍為1.25～2.5mg/ml。

表1 不同濃度乙醇對(duì)牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌的MIC值

表2 不同濃度丹皮酚對(duì)牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌的MIC值

2.2 抑菌漱口水配伍研究及抑菌效果

2.2.1 抑菌漱口水配伍研究

甘油、泊洛沙姆、薄荷腦等原料在口腔護(hù)理產(chǎn)品中已經(jīng)廣泛運(yùn)用，并且類似于甘油等保濕劑顯示出一定的抑菌活性[1]?，F(xiàn)將丹皮酚與漱口水基底配方進(jìn)行配伍性能研究，在保證抑菌活性的同時(shí)，可保證漱口水自身的穩(wěn)定性。

將丹皮酚與漱口水基底配方進(jìn)行不同梯度配伍，在不引起漱口水理化指標(biāo)改變的同時(shí)，從成本、口感等方面考慮，確定丹皮酚添加比例為0.05% ～0.25%，配制成植物抑菌漱口水。

表3 丹皮酚抑菌漱口水配方組成

2.2.2 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

鑒于所提取的丹皮酚對(duì)受試菌的MIC值測(cè)試結(jié)果，所制得植物抑菌漱口水的抑菌效果分別如圖1和圖2所示。可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)施例1中，所含丹皮酚有效含量值，對(duì)牙齦卟啉單胞菌的生物細(xì)胞生長(zhǎng)曲線具有明顯的抑制效果；對(duì)變形鏈球菌的生物細(xì)胞生長(zhǎng)曲線有抑制效果，能降低其繁殖速率及生長(zhǎng)時(shí)間。實(shí)施例4中，所含丹皮酚有效含量值，均對(duì)牙齦卟啉單胞菌以及變形鏈球菌的生物細(xì)胞生長(zhǎng)曲線具有明顯的抑制效果。

圖1 丹皮酚對(duì)的牙齦卟啉單胞菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果

圖2 丹皮酚對(duì)的變形鏈球菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本研究對(duì)由植物牡丹皮提取的含量>90%的丹皮酚進(jìn)行了MIC值測(cè)試，以及與漱口水基底復(fù)配后有效含量值的抑菌效果分析。結(jié)果顯示：牡丹皮提取物丹皮酚，對(duì)牙齦卟啉單胞菌、變形鏈球菌顯示出具有一定的抑菌活性，對(duì)牙齦卟啉單胞菌的抑菌作用優(yōu)于對(duì)變形鏈球菌的抑菌效果；其中：丹皮酚對(duì)供試菌牙齦卟啉單胞菌的抑菌MIC值范圍為0.625～1.25mg/ml，對(duì)供試菌變形鏈球菌的抑菌MIC值范圍為1.25～2.5mg/ml。將丹皮酚按0.05%～0.2%的比例添加到漱口水基底配方中，發(fā)現(xiàn)抑菌效果隨丹皮酚含量的增加而增高，顯現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌性能，得到具有有效抑菌效果的抑菌漱口水。

植物抑菌漱口水，是性能安全、有效的含植物抑菌物的口腔護(hù)理產(chǎn)品，其在發(fā)揮抑制口腔有害菌的同時(shí)，減少耐藥性的產(chǎn)生，能降低化學(xué)劑用量及刺激性，達(dá)到保障口腔清潔衛(wèi)生健康、維護(hù)口腔微生態(tài)平衡的目的，符合并滿足廣大人民群眾日常的迫切需求，該技術(shù)的市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊，必會(huì)受到廣大消費(fèi)者青睞。