霉菌酵母快速檢測(cè)測(cè)試片的優(yōu)化

賈倩倩 李宏鐸 白福軍 于宏雙 張靜 周琦 賈晨

摘 要：本文以霉菌酵母測(cè)試片為基礎(chǔ)，探究添加不同濃度的抑制劑對(duì)霉菌和酵母菌菌落的影響。實(shí)驗(yàn)中抑制劑的添加量為1 μL/L、2 μL/L、3 μL/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)濃度在2 μL/L時(shí)，抑制劑能夠有效抑制霉菌菌絲的蔓延，提高霉菌的計(jì)數(shù)范圍，且不影響霉菌和酵母菌菌落的生長(zhǎng)率。同時(shí)使用霉菌酵母菌測(cè)試片對(duì)6種食品樣品加標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果表明添加2 μL/L抑制劑的測(cè)試片的霉菌菌落邊緣清晰，更易計(jì)數(shù)，因此，優(yōu)化后的霉酵測(cè)試片能夠滿足樣品中的霉菌酵母計(jì)數(shù)的快速檢測(cè)需求。

關(guān)鍵詞：霉菌;酵母;測(cè)試片;抑制劑;食品

Optimization of the Count Plate for Rapid Detection of Mold and Yeast

JIA Qianqian1， LI Hongduo2， BAI Fujun3， YU Hongshuang1， ZHANG Jing4， ZHOU Qi1， JIA Chen1*

（1.Beijing Meizheng Biotechnology Co.， Ltd.， Beijing， 102200，China; 2.Xi'an Institute for Food and Drug Control， Xi'an， 710054 China;3. Chengde Grain and Oil Quality Supervision Center Co.， Ltd.， Hebei， 067000 China;4.Yurun Group Ma'anshan Yuber Food Co.， Ltd.， Anhui， 243100 China）

Abstract： The effects of different concentrations of inhibitor on mold and yeast colonies were studied on the Mold & Yeast count plate. The amount of inhibitor was 1μL/L， 2μL/L， 3μL/L. The results showed when the concentration is 2μL/L， the inhibitor can effectively inhibit the spread of mold hyphae， increase the count range of mold， does not affect the growth rate. At the same time， 6 food samples inoculated strains were tested on the count plate. The results showed the mold colonies of the count plate with 2 μL/L inhibitor was clear and easier to count. Therefore， the optimized Mold & Yeast count plate can meet the need for rapid detection in the samples.

Keywords： mold; yeast; count plate; inhibitor; food

霉菌和酵母使用廣泛，與人們?nèi)粘Ｉ盥?lián)系十分密切。霉菌不僅應(yīng)用于傳統(tǒng)的釀酒制醬和發(fā)酵食品中，在農(nóng)業(yè)、紡織、食品、醫(yī)藥和皮革制造等領(lǐng)域都有極為重要的作用[1-3]。霉菌和酵母菌的污染會(huì)導(dǎo)致食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值下降，甚至腐敗變質(zhì)。若食用被霉菌、酵母菌污染的食品，會(huì)造成腸胃不適，引發(fā)疾病[4]。因此，人們愈來(lái)愈重視食品中霉菌和酵母菌污染對(duì)人體造成的危害[5-6]。

霉菌和酵母菌的數(shù)量表明食品被污染的程度，是評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量必不可少的指標(biāo)[7]。在我國(guó)飲料、堅(jiān)果制品、米面制品、糕點(diǎn)類等食品中，把霉菌和酵母菌作為食品污染的指示菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)，被列入國(guó)標(biāo)GB 4789系列食品安全微生物常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目之一[8]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)霉菌的檢查方法主要有平板計(jì)數(shù)法、顯色培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法、WKJ-Ⅱ型微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法和測(cè)試片法[9-10]。其中，測(cè)試片法是一項(xiàng)微生物快速的檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，極大地提高了檢測(cè)效率。而霉菌和酵母菌落在上呈不同形態(tài)，容易判斷觀察和直接計(jì)數(shù)。戴昌芳[11]、余淑冰[12]、王明[13]和趙紅陽(yáng)[14]等將測(cè)試片與國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，研究結(jié)果表明兩種方法的檢出結(jié)果無(wú)顯著性差異。

測(cè)試片法雖然成本低、檢測(cè)性能好，但也存在霉菌菌絲的蔓延和顯色效果的不穩(wěn)定影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性等問(wèn)題。因此，本研究同過(guò)添加不同濃度的抑制劑，探究其對(duì)霉菌和酵母菌落形態(tài)和顏色的影響，以此優(yōu)化霉酵測(cè)試片檢測(cè)效果。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

霉菌酵母測(cè)試片：北京美正生物科技有限公司;抑制劑與其他試劑均為國(guó)藥分析純?cè)噭?shí)驗(yàn)中選取不同品牌和口味的糕點(diǎn)、面包、堅(jiān)果樣品共5種，均購(gòu)自超市。標(biāo)準(zhǔn)菌株：1株酵母菌（10231）和11株霉菌（M-1至M-11）。

1.2 儀器與設(shè)備

SHP-80型生化培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)廠;SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化臺(tái)，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌液制備

從甘油管中活化酵母至馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2 d，平板計(jì)數(shù)備用。

1.3.2 測(cè)試片培養(yǎng)基單因素實(shí)驗(yàn)

將3株霉菌與酵母分別用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋，配置成一定濃度的菌懸液，振蕩器混勻，制成最終濃度為10～100 CFU/mL的稀釋液。分別添加霉菌抑制劑的濃度為1 μL/L、2 μL/L、3 μL/L，每個(gè)稀釋梯度設(shè)置兩個(gè)平行，分別吸取菌液1.0 mL接種于霉酵測(cè)試片上，培養(yǎng)測(cè)定酵母菌和霉菌的菌落總數(shù)，考察抑制劑濃度對(duì)霉菌和酵母菌落總數(shù)的影響。

1.3.3 測(cè)試片培養(yǎng)基驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

（1）最佳計(jì)數(shù)范圍的測(cè)定。選用12株菌株，用無(wú)菌水稀釋成1×10-7、2×10-7、4×10-7和8×10-7 CFU/mL

的4個(gè)濃度梯度，進(jìn)行試驗(yàn)，分別吸取各個(gè)濃度梯度的菌懸液1.0 mL接種測(cè)試片，每個(gè)梯度設(shè)置2個(gè)平行，培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

（2）食品樣品的檢測(cè)。從市場(chǎng)上采購(gòu)不同品牌和口味的糕點(diǎn)、面包、堅(jiān)果和蜂蜜樣品共5份。稱取25 g/mL樣品放入盛有225 mL無(wú)菌水的無(wú)菌均質(zhì)袋內(nèi)，均質(zhì)器混勻，制成1∶10的樣品勻液。選取一株霉菌，做加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。將霉菌進(jìn)行梯度稀釋，配置成一定濃度的菌懸液，向樣品勻液中添加菌懸液，混勻，制成最終濃度為10～100 CFU/mL的加標(biāo)樣品，吸取的樣品菌懸液1.0 mL接種測(cè)試片，每個(gè)梯度設(shè)置2個(gè)平行，培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

1.3.4 霉菌和酵母計(jì)數(shù)

培養(yǎng)后，酵母菌落較小，邊界清晰，顏色均一，菌落顯示紫紅色。霉菌菌落較大，邊緣模糊，呈淺粉色到紫紅色，顏色不均一。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)用SPSS、excel對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制劑對(duì)酵母與霉菌的生長(zhǎng)率與形態(tài)的影響

由表1可知，隨著抑制劑濃度的升高，霉菌的菌落的生長(zhǎng)率沒(méi)有顯著性差異，但霉菌菌落大小具有顯著差異，具體見(jiàn)圖1。與對(duì)照相比，添加抑制劑后霉菌菌落變小;當(dāng)抑制劑的濃度≥3 μL/L時(shí)，霉菌菌落的大小沒(méi)有顯著變化。同時(shí)，添加抑制劑對(duì)酵母的生長(zhǎng)率和形態(tài)沒(méi)有顯著影響。因此，測(cè)試片添加抑制劑的濃度在2 μL/L時(shí)效果最佳。

2.2 測(cè)試片培養(yǎng)基準(zhǔn)確度測(cè)試結(jié)果

為了測(cè)定優(yōu)化后測(cè)試片的最佳計(jì)數(shù)范圍，使用12株菌株，濃度依次遞增，設(shè)置了4個(gè)梯度。由表2可知，優(yōu)化后的測(cè)試片，大部分霉菌的計(jì)數(shù)范圍在0～80 CFU，與對(duì)照霉菌計(jì)數(shù)范圍相比（計(jì)數(shù)范圍<30 CFU），提高了50 CFU。當(dāng)菌落數(shù)大于86 CFU時(shí)，測(cè)試片結(jié)果顯示均不可計(jì)數(shù)。

2.3 食品樣品檢測(cè)結(jié)果

表3為檢測(cè)6種食品樣品的測(cè)試結(jié)果。其中，所有樣品原樣中均未檢出霉菌。加標(biāo)樣品檢測(cè)的結(jié)果表明，有5種食品樣品中檢出霉菌并計(jì)數(shù)，1個(gè)核桃樣品使測(cè)試片整體變色，不能計(jì)數(shù)。優(yōu)化后測(cè)試片霉菌的計(jì)數(shù)范圍明顯大于對(duì)照組，不同食品樣品的基質(zhì)會(huì)影響測(cè)試片霉酵的計(jì)數(shù)結(jié)果，但影響較小。因此，優(yōu)化后的測(cè)試片可以用于部分食品中霉菌菌落計(jì)數(shù)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以霉菌酵母測(cè)試片為基礎(chǔ)，通過(guò)添加抑制劑探究對(duì)霉菌酵母生長(zhǎng)率和形態(tài)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制劑能夠抑制霉菌菌絲蔓延，減小霉菌菌落，從而提高了霉酵測(cè)試片的計(jì)數(shù)范圍。在檢測(cè)面包、蜜餞和堅(jiān)果等食品樣品時(shí)，優(yōu)化后的測(cè)試片霉菌計(jì)數(shù)范圍明顯大于對(duì)照組。因此，優(yōu)化后的霉酵測(cè)試片能夠滿足食品樣品中的霉菌酵母計(jì)數(shù)的快速檢測(cè)需求。

參考文獻(xiàn)

[1]沈源.糧食中霉菌分離與鑒定方法的初步研究[J].彭城大學(xué)學(xué)報(bào)，1997（3）：62-65.

[2]周玉庭，任佳麗，張紫鶯.糧食中霉菌污染檢測(cè)方法現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2016，7（1）：252-258.

[3]王定昌.酵母菌與食品[J].糧油食品科技，2012（4）：64-65.

[4]陳忠杰，李存法，王璐.引起罐藏食品腐敗變質(zhì)的微生物探討[J].鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2012，32（1）：19-21.

[5]BOUAKLINE A，LACROIX C，ROUX N，et al.Fungal Contamination of Food in Hematology Units[J].Journal of Clinical Microbiology，2000，38（11）：4272.

[6]柴竹林，王巖，王慶峰，等.食品中常見(jiàn)霉菌毒素的污染及其檢測(cè)技術(shù)[J].食品安全導(dǎo)刊，2015（27）：109.

[7]雷玲鈺.食品中霉菌、酵母菌檢測(cè)分析[J].生物技術(shù)世界，2013（7）：50-51.

[8]梁美丹，肖劍，易云婷，等.食品微生物能力驗(yàn)證霉菌酵母菌計(jì)數(shù)：檢驗(yàn)方法比較[J].輕工科技，2015（7）：5-6

[9]劉桐，劉爽，司南，等.霉菌和酵母菌檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2018（6）：73-75.

[10]MANAFI M.Fluorogenic and chromogenic enzyme substrates in culture media and identification tests[J].International Journal of Food Microbiology，1996，31（1）：45-58.

[11]戴昌芳，鄧峰，李玉偉，等.霉菌快速檢測(cè)紙片法的研究[J].中國(guó)公共衛(wèi)生，1998，14（11）：674-675.

[12]余淑冰，梁景濤，周強(qiáng)忠.食品中霉菌和酵母菌紙片法與培養(yǎng)法檢驗(yàn)結(jié)果的比較[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，1998（3）：138-140.

[13]王偉，李琴，趙紅陽(yáng)，等.PetrifilmTM快速霉菌酵母測(cè)試片法與GB 4789.15—2016在酸奶檢測(cè)中的比較[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2018（3）：253-256.

[14]趙紅陽(yáng)，王鳴雨，宋嬌嬌，等.快速霉菌酵母測(cè)試片法與GB 4789.15—2016在3種類型食品中霉菌計(jì)數(shù)比較[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2020，32（4）：397-400.