miR-493-5p抑制人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3增殖和遷移

李少儒，秦海霞，劉珊珊，侯瑞杰

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 新鄉(xiāng) 453100)

卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，研究表明miRNA與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[1]。miR-493-5p的過表達(dá)通過下調(diào)類Kruppel因子5(Kruppel-like factor 5，KLF5)并使磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3 kinese/protein kinase B，PI3K/AKT)信號通路失活而抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[2]。高表達(dá)miR-493-5p通過調(diào)控囊泡相關(guān)膜蛋白2(vesicle-associated membrane protein-2，VAMP2)抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)其衰老凋亡[3]。然而miR-493-5p對卵巢癌的影響及機(jī)制尚不清楚。G蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用因子1(G-protein-coupled receptor kinase interactor-1，GIT1)是介導(dǎo)各種腫瘤進(jìn)展的多功能支架蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，GIT1可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖[4]。miR-149-5p可通過靶向GIT1抑制甲狀腺髓樣癌中的細(xì)胞增殖和侵襲[5]。而GIT1對卵巢癌的影響也尚不清楚。本實驗通過在線生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-493-5p與GIT1有結(jié)合位點，因此，本實驗旨在研究miR-493-5p/GIT1對卵巢癌細(xì)胞系增殖和遷移的影響以及miR-493-5p是否通過調(diào)控GIT1影響卵巢癌細(xì)胞系的增殖和遷移。

1 材料與方法

1.1 材料

人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、SKOV3及OVCAR3和人卵巢上皮細(xì)胞系IOSE80(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫)；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基(上海谷研實業(yè)有限公司)；胰蛋白酶(廣州威佳科技有限公司)；Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；熒光定量PCR試劑盒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；MTT試劑盒(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；BCA試劑盒(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)；雙熒光素酶報告實驗試劑盒(GeneCopoeia公司)；Transwell小室、Matrigel(上海代軒生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：常規(guī)培養(yǎng)卵巢癌A2780、SKOV3、OVCAR3細(xì)胞和人卵巢上皮IOSE80細(xì)胞，取對數(shù)增殖期卵巢癌SKOV3細(xì)胞，將miR-con、miR-493-5p mimics、anti-miR-con、anti-miR-493-5p轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞中，記為miR-con組、miR-493-5p組、anti-miR-con組、anti-miR-493-5p組；將miR-493-5p mimics分別與pcDNA、pcDNA-GIT1共轉(zhuǎn)染至SKOV3細(xì)胞中，記為miR-493-5p+pcDNA組、miR-493-5p+pcDNA-GIT1組。

1.2.2 RT-qPCR檢測miR-493-5p和GIT1 mRNA表達(dá)水平：提取各組細(xì)胞的總RNA，合成cDNA，按試劑盒說明進(jìn)行PCR，以β-actin為內(nèi)參，2-△△Ct法計算相對表達(dá)量。miR-493-5p上游引物序列：5′-TTGT ACATGGTAGGCTTTCATT-3′，下游引物序列：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′；GIT1上游引物序列：5′-GCCGACAGTGACTATGAGAA-3′，下游引物序列：5′-AGTTCCTGAATGTTCTTGGT-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3′，下游引物序列：5′-CTCCACGACGTACTCAGCG-3′。

1.2.3 Western blot檢測蛋白的表達(dá)：提取各組細(xì)胞的總蛋白，BCA定量，經(jīng)SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉；加入一抗4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，曝光、顯影、定影，Quantity One分析蛋白條帶，以β-actin為內(nèi)參計算目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖：培養(yǎng)各組細(xì)胞至24、48 和72 h時，按試劑盒說明操作，先加入MTT溶液20 μL，孵育4 h后加入DMSO 150 μL，振蕩反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度(A)值。

1.2.5 Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移和侵襲：Transwell上室和下室分別加入200 μL細(xì)胞懸液和500 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，在顯微鏡下觀察并計算遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實驗：用Matrigel包被Transwell上室，按照細(xì)胞遷移實驗步驟操作。

1.2.6 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測miR-493-5p對GIT1的靶向調(diào)控：合成含miR-493-5p結(jié)合位點的GIT1的3′UTR序列片段，插入至熒光素酶表達(dá)載體中，獲得GIT1野生型載體(WT-GIT1)，將GIT1序列 CUGUCAAGACGUGUCAUGUACAU突變?yōu)镃UGUCAAGACGUGUGUGUACAUGUU，獲得GIT1突變型載體(MUT-GIT1)，將WT-GIT1、MUT-GIT1分別與miR-NC、miR-493-5p共轉(zhuǎn)染至卵巢癌SKOV3細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-493-5p和GIT1在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)

與IOSE80細(xì)胞相比，A2780、SKOV3、OVCAR3細(xì)胞中miR-493-5p表達(dá)水平降低，GIT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖1)。因miR-493-5p和GIT1 在SKOV3細(xì)胞中表達(dá)差異顯著，故后續(xù)試驗均在SKOV3細(xì)胞中進(jìn)行。

A.qRT-PCR to detect the expression level of miR-493-5p;B.qRT-PCR to detect the expression level of GIT1;C.Western blot to detect the expressions of GIT1;*P<0.05 compared with IOSE80 group圖1 miR-493-5p和GIT1在卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig 1 miR-493-5p and GIT1 protein expression in ovarian cancer cell lines(n=9)

2.2 過表達(dá)miR-493-5p對卵巢癌細(xì)胞增殖和遷移的功能性影響

與miR-con組相比，miR-493-5p組卵巢癌細(xì)胞中miR-493-5p表達(dá)水平升高(P<0.05)，細(xì)胞活性降低(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量降低(P<0.05)(圖2)。

A.qRT-PCR to detect the transfection efficiency of miR-493-5p;B.MTT to detect cell proliferation;C,D.Transwell test to detect the migration and invasion of SKOV3 cells;E,F.Western blot to detect the expressions of cyclinD1 and MMP-2;*P<0.05 compared with miR-con group圖2 過表達(dá)miR-493-5p對SKOV3細(xì)胞增殖和遷移及cyclin D1、MMP-2的表達(dá)量的影響Fig 2 Effect of over-expression of miR-493-5p on the proliferation and metastasis of SKOV3 cells and the expression of cyclin D1 and MMP-2

2.3 miR-493-5p靶向GIT1并抑制GIT1蛋白質(zhì)的表達(dá)

TargetScan預(yù)測顯示GIT1的3′UTR與miR-493-5p具有互補(bǔ)的核苷酸序列(圖3A)。相較于miR-con組，miR-493-5p組轉(zhuǎn)染野生型GIT1載體的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)(圖3B)。相較于miR-con組，miR-493-5p組GIT1表達(dá)水平降低；相較于anti-miR-con組，anti-miR-493-5p組GIT1表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖3C)。

A.TargetScan database predicts the presence of binding sites between GIT1 and miR-493-5p;B.dual luciferase activity detection;C.Western blot detection of GIT1 expression in SKOV3 cells transfected with miR-493-5p or anti-miR-493-5p;*P<0.05 compared with miR-con group;#P<0.05 compared with anti-miR-con group圖3 miR-493-5p靶向GIT1并抑制其蛋白表達(dá)Fig 3 miR-493-5p targets and inhibits expression of GIT1

2.4 過表達(dá)GIT1部分逆轉(zhuǎn)miR-493-5p對卵巢癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移的功能性影響

與miR-con組相比，miR-493-5p組細(xì)胞活性降低，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量降低(P<0.05)；與miR-493-5p+pcDNA組相比，miR-493-5p+pcDNA-GIT1組miR-493-5p表達(dá)水平降低(P<0.05)，細(xì)胞活性升高(P<0.05)，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量升高(P<0.05)(圖4)。

A.Western blot to detect the transfection efficiency of GIT1;B.MTT to detect the proliferation of SKOV3 cells;C,D.Transwell experiment to detect the migration and invasion of SKOV3 cells;E.Western blot to detect cyclinD1 and MMP-2 expression in SKOV3 cells;*P<0.05 compared with miR-con group;#P<0.05 compared with miR-493-5p+pcDNA group圖4 過表達(dá)GIT1減弱miR-493-5p對SKOV3細(xì)胞增殖和遷移及cyclin D1、MMP-2的表達(dá)量的影響Fig 4 Over-expression of GIT1 attenuates the effect of miR-493-5p on the expression of GIT1,cyclin D1 and MMP-2 in SKOV3 cells

2.5 miR-493-5p靶向GIT1基因?qū)EK1/2-ERK1/2信號通路的影響

與miR-con組相比，miR-493-5p組卵巢癌細(xì)胞中p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-c-Jun、p-c-Fos 表達(dá)水平降低；與miR-493-5p+pcDNA組相比，miR-493-5p+pcDNA-GIT1組卵巢癌細(xì)胞中p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-c-Jun、p-c-Fos表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with miR-con group;#P<0.05 compared with miR-493-5p+pcDNA group圖5 Western blot檢測miR-493-5p靶向GIT1基因?qū)EK1/2-ERK1/2信號通路的影響Fig 5 Western blot detection of the effect of miR-493-5p targeting GIT1 gene on MEK1/2-ERK1/2 signaling pathway

3 討論

分子靶向治療在惡性腫瘤的治療中占據(jù)重要地位，更多的研究篩查了與卵巢癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的分子靶點，開發(fā)特異性靶向藥物，有利于卵巢癌的治療[6]。miRNA的異常表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為卵巢癌早期診斷與預(yù)后判斷的新靶點[7]。miR-493-5p通過靶向FUT4減弱人乳腺癌的侵襲性和致瘤性[8]；miR-493-5p過表達(dá)通過負(fù)調(diào)節(jié)VAMP的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移[9]。本實驗結(jié)果表明，miR-493-5p在多種卵巢癌細(xì)胞系中低表達(dá)，過表達(dá)miR-493-5p抑制了卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖、遷移和侵襲；表明miR-493-5p在卵巢癌中起抑癌作用。

GIT1參與細(xì)胞運(yùn)動激活，這是組織發(fā)育和癌進(jìn)展過程中的基本過程，GIT1高表達(dá)通過調(diào)節(jié)Rac1/Cdc42活性促進(jìn)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，且與肺癌患者預(yù)后不良有關(guān)[10]。抑制GIT1可減少骨肉瘤的增殖，侵襲[11]。本實驗結(jié)果顯示，GIT1在卵巢癌細(xì)胞高表達(dá)，過表達(dá)GIT1促進(jìn)了細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本實驗還發(fā)現(xiàn)miR-493-5p可靶向調(diào)控，且過表達(dá)GIT1減弱了miR-493-5p對卵巢癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響，說明miR-493-5p可能通過調(diào)控GIT1影響卵巢癌進(jìn)展。

MEK1/2-ERK1/2是惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展中有重要作用的一條信號通路[12]。ERK12參與了從G1期到S期的細(xì)胞周期進(jìn)程，其增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的存活率和對順鉑耐藥性[13]。miR-638的靶標(biāo)MeCP2通過上調(diào)GIT1激活MEK12-ERK12信號通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)程[14]。本實驗中過表達(dá)miR-493-5p抑制了MEK1/2-ERK1/2信號通路的激活，而過表達(dá)GIT1減弱了這一作用，以上結(jié)果表明，miR-493-5p對SKOV3卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響可能與調(diào)控GIT1進(jìn)而調(diào)節(jié)MEK1/2-ERK1/2信號通路相關(guān)。

綜上所述，miR-493-5p可抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與靶向調(diào)控GIT1以及MEK1/2-ERK1/2信號通路有關(guān)。