過硫酸氫鉀復合物對對蝦養殖底泥硝化作用、氨氧化微生物豐度和群落結構的影響

趙 珍, 王寶杰, 劉 梅, 4, 蔣克勇, 王 雷, 4

過硫酸氫鉀復合物對對蝦養殖底泥硝化作用、氨氧化微生物豐度和群落結構的影響

趙 珍1, 3, 王寶杰1, 2, 劉 梅1, 2, 4, 蔣克勇1, 2, 王 雷1, 2, 4

(1. 中國科學院海洋研究所 中國科學院實驗海洋生物學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學院 海洋大科學中心, 山東 青島 266071; 3. 中國科學院大學, 北京 100049; 4. 青島海洋科學與技術國家實驗室 海洋生物學與生物技術功能實驗室, 山東 青島 266237)

采用在模擬池塘中投放過硫酸氫鉀復合物(KMPS)進行對比實驗的方法, 探究KMPS對養殖底質硝化作用的影響。通過對氨氮和亞硝態氮含量的檢測, 探究對不同時期氮素轉化的影響, 低頻率高劑量投放組中的氨氮和亞硝態氮含量顯著降低, 而高頻率低劑量組中氨氮和亞硝態氮的含量顯著上升。高頻率低劑量KMPS的投放使氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細菌(AOB)豐度降低, 而低頻率高劑量KMPS的投放不會造成豐度降低, 而且還表現出部分時期AOB豐度的上升。進一步對群落結構進行分析發現KMPS的投放使AOA群落中屬相對豐度降低,屬的相對豐度上升, 這種相對豐度的變化與KMPS的投放方式無關; 但AOB群落受到KMPS投放方式的影響, 低頻率高劑量的KMPS投放下AOB群落優勢屬相對豐度顯著提高。以上結果均說明低頻率高劑量KMPS的投放起到了促進底質硝化作用的效果。同時, 可為KMPS用于對蝦養殖池塘底質改良開辟一個新的途徑。

過硫酸氫鉀復合物; 硝化作用;基因豐度; 微生物群落結構

對蝦產業不僅為人類提供優質的蛋白質來源, 而且還是全球水產養殖產值增長的主要推動力。隨著水產養殖業的集約化發展, 越來越多的養殖污染問題隨著而來, 其中一個主要的問題就是養殖過程中含氮化合物的積累。這些含氮化合物包括有機氮和無機氮(氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽), 主要來源于蝦類排泄物和未被食用的飼料[1]。在集約化養殖中被大量使用的肥料和補充飼料都是含氮量很高的有機物質, 但這些物質中只有15%～30% 能夠被蝦吸收利用, 其余未被吸收和利用的部分會沉積在養殖池塘底部的水?泥界面。沉積物中過量的氮不僅會破壞水產養殖環境, 對養殖生物產生毒害, 而且排放還會影響周圍水體[2]。因此去除沉積物中多余的氮是非常重要的。

硝化作用是生態系統氮素循環過程中的一個重要過程, 整個過程包括兩個步驟, 氨氧化和亞硝酸鹽氧化。其中氨氧化是硝化反應的第一步也是限速步驟, 該步驟由氨氧化微生物?氨氧化古菌(AOA)和氨氧化細菌(AOB)共同介導進行。該步驟中起重要作用的酶——氨單加氧酶(ammonia monooxygenase, AMO)由A、B、C三個亞基組成, 其中編碼A亞基的基因具有一定序列保守性, 為所有氨氧化微生物共有的基因, 因此常被作為分子標記應用于氨氧化微生物的研究[3-5]。氮素濃度、溫度、鹽度等環境因子的變化以及施肥和化學物質干擾等都可能引起AOA和AOB的數量和群落結構的變化[6-8]。

長期以來圍繞著氮素污染防治進行了大量的研究, 過硫酸氫鉀復合物2KHSO5·KHSO4·K2SO4(KMPS)溶于水后發生鏈式反應, 產生活性氧, 羥基自由基、硫酸自由基等多種活性成分[9], 廣泛的用作水產中的消毒劑使用。KMPS可以降解多種有機物, 并且可以將NH4+氧化為亞硝酸, 因此可用于降低池塘中氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫等有害物質的濃度, 用于養殖水體的治理和底質改造[10]。目前KMPS在水產養殖中的研究多集中作為消毒劑對水產致病菌的抑菌作用[11], 而其對底質氮素污染防治的研究有所欠缺。本研究通過對表層底泥中氨氮、亞硝態氮水平變化進行檢測, 分析KMPS對氮素含量的影響, 并通過qPCR, 16s高通量測序等分子生物學技術對底泥中AOA和AOB數量和群落結構進行分析, 以期揭示KMPS對硝化作用的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗設計及養殖管理

實驗在中國山東省東營市黃河三角洲海洋科技有限公司研發實驗室進行, 從8月3日至9月14日共進行6周, 為模擬封閉池塘的養殖環境, 準備9個柱形養殖桶(500 L), 桶內鋪設10 cm新鮮底泥, 覆入鹽度為34的海水靜置24 h后使用。實驗所用的凡納濱對蝦養殖至重量0.3 g, 體長1.5 cm后被隨機分配至每桶300只對蝦。暫養1周之后將9個養殖桶分成3個組, 分別為: 處理組A為高頻率低劑量組: 以5 g/m3的劑量, 每2周投放3次KMPS; 處理組B為低頻率高劑量組: 以15 g/m3的劑量, 每2周投放1次KMPS; 對照組C: 除日常養殖管理外不進行其他處理。養殖期間, 每日按體重的8%, 分別于6: 00 am、12: 00 am、6: 00 pm、12: 00 pm投喂商品飼料。每周少量換水10 cm, 本研究使用的KMPS為片劑, 由山東嘉源環保科技有限公司提供, 純度為100%。

1.2 樣品的采集及前處理

使用自制的采集器采集0.5～2 cm的表層底泥[12], 分別于實驗開始時和實驗結束時采集1次, 實驗期間每周采集1次。采集的底泥樣品一部分用于氨氮、亞硝氮檢測, 另一部分迅速置于液氮中保存, 之后送回實驗室保存在?80 ℃冰箱待之后的分子生物學實驗分析使用。

1.3 氨氮、亞硝態氮的測定

取5 g新鮮樣品置于50 mL離心管中, 加入25 mL, 2 mol/L的 KCl溶液, 25 ℃搖床浸提1 h, 之后泥漿經3 000 r離心10 min, 取上清液測定營養鹽含量。按照海洋監測規范的標準采用次溴酸鹽氧化法、萘乙二胺分光光度法分別檢測氨氮和亞硝酸鹽濃度[13]。

1.4 DNA的提取和PCR擴增

采用Fast DNA Spin Kit For soil(MPbio), 美國試劑盒進行底泥樣品中微生物DNA提取, 具體操作步驟按照說明書進行。在下一步分析前將提取的基因組DNA儲存在?20 ℃。提取后的DNA的濃度和質量分別使用NanoDrop ND-1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)和瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。選用引物Arch-amoA26F (5′-GACTACATMTTCTAYACWGAYTGGGC-3′)和Arch-amoA417R(5′-GGKGTCATRTATGGWGGYAAYGTTGG-3′)擴增AOA-基因; 引物amoA1F (5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′)和amoA2R(5′- CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)擴增AOB-基因。PCR反應體系為: 5×反應buffer 5 μL, 5×GC buffer 5 μL, dNTP(2.5mmol·L–1)2 μL, 上游和下游引物各(10 μmol·L–1)1 μL, DNA 模板2 μL, ddH2O 8.75 μL,Q5 DNA 聚合酶0.25 μL; 反應程序: 98 ℃ 2 min, 98 ℃ 15 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 72 ℃ 5 min, 共進行35個循環, 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5 熒光定量PCR

將上述PCR產物回收, 連接至pMD18-T載體, 轉化至大腸桿菌DH5α感受態中, 用含有Amp+的LB瓊脂平板培養基篩選陽性克隆, 并對陽性克隆測序分析, 分別提取含AOA-和AOB-基因的質粒, 用NanoDrop2000(Thermo) 測定質粒濃度, 計算AOA和AOB基因拷貝數, 將標準質粒進行一系列10倍濃度稀釋(標準質粒范圍AOA-102～108, AOA-10～106)用于構建qPCR標準曲線。各標準曲線2均超過0.99, 在本研究使用的濃度范圍內呈良好的線性關系。使用 TransStar Top Green qRT- PCR Supermix(北京全式金生物科技有限公司)試劑盒進行AOA 和AOB基因豐度測定, 具體操作按說明書進行。

1.6 Illumina MiSeq高通量測序及分析

采用Illumina平臺對群落DNA片段進行雙端(paired-end)測序。利用 QIIME(QIIME, v1.8.0)軟件進行DADA2對測序數據進行質量過濾、降噪和去除嵌合體獲得高質量序列[14]。高質量序列通過UCLUST軟件按照97%的序列同源性聚集成操作分類單元(OTUs)[15]。序列數據分析主要使用QIIME和R包(v3.2.0)基于OUT表計算alpha多樣性指數, 以Chao1[16]和Observed species指數表征豐富度, 以Shannon[17]和Simpson[18]指數表征多樣性。通過OUT表計算不同樣本在各分類水平所含有的分類單元的數目, 實現所有樣本在各分類水平上組成分布的可視化, 以堆疊柱狀圖呈現分析結果。

1.7 統計分析

所有數據以“平均值±標準差”表示。用SPSS 25.0(IBM Corp, Armonk, NY, USA)統計軟件中的單因素變量方差分析方法(One-Way ANOVA)對數據進行統計學分析。以<0.05 代表差異顯著。

2 結果與分析

2.1 底泥中氨氮及亞硝態氮含量變化

對照組和實驗組的氨氮及亞硝態氮變化如圖1a和圖1b所示, 整個實驗期間各組的氨氮和亞硝氮均呈現上升的趨勢。處理組B中的氨氮和亞硝氮在整個實驗期間處于較低水平并且低于其他2組。實驗開始的前2周, 對照組C中的氨氮水平高于2個處理組, 隨著實驗的進行, 對照組和實驗組B中的氨氮含量先上升后下降, 而實驗組A中的氨氮含量持續上升。對于亞硝氮, 前2周各組的水平與氨氮相似, 在對照組中最高。從第3周開始處理組A中的亞硝氮濃度快速上升, 迅速超過對照組C和處理組B。

圖1 不同處理組中氨氮(a)亞硝氮(b)濃度變化

注: C: 對照組; A: 高頻率低劑量組; B: 低頻率高劑量組

在實驗剛開始的前兩周, 與對照組相比兩個處理組的氨氮和亞硝氮的含量均下降, 證明KMPS的投放能夠降低底泥中氨氮和亞硝氮的含量, 一方面可能是因為KMPS對含氮有機物的降解, 使進入硝化作用的含氮有機物減少, 從而使氨氮和亞硝氮的含量降低, 另一方面KMPS的強氧化作用改善了底泥中的氧化還原狀態, 并且還能夠釋放氧氣, 進一步促進了硝化作用。但是處理組A以少量多次進行KMPS的持續性的投放, 卻沒有使氨氮和亞硝氮降低, 反而高于對照組中氨氮和亞硝氮的含量。推測持續性的KMPS的投放可能對硝化作用微生物存在持續的抑制。硝化作用無法順利進行, 造成氨氮和亞硝氮的積累。

2.2 AOA和AOB微生物豐度變化

氨單加氧酶基因的豐度可以用來表征環境中氨氧化微生物的數量, AOA-基因拷貝數為2.3×104～3.31×105copies·g–1, AOB-基因拷貝數為1.48×103～2.68×104copies·g–1。同期的AOA-比AOB-基因拷貝數高1～2個數量級, 此時環境中的AOA數量高于AOB。養殖的前2周處理組和對照組之間AOA-基因拷貝數沒有顯著性差異(圖2a)(>0.05), 第3周處理組B和對照組C中拷貝數上升, 顯著高于同期處理組A中該基因的拷貝數(<0.05)。之后各組的AOA-基因拷貝數均持續上升, 且處理組B和對照組C中基因拷貝數顯著高于同期處理組A中基因的拷貝數。除第4周對照組C中AOA-基因拷貝數顯著高于處理組B中外, 其余時期該基因拷貝數在2個組之間沒有顯著差異(>0.05)。各組AOB-基因拷貝數逐漸上升(圖2b), 前四周各組間沒有顯著差異(>0.05); 后兩周處理組B和對照組C中該基因的拷貝數顯著高于處理組A, 實驗結束時的處理組B中基因拷貝數最高, 隨后是對照組C(<0.05)。

2.3 高通量測序結果及AOA和AOB群落Alpha多樣性分析

對實驗結束時的3個組的9個樣品進行高通量測序分析, 平均每個樣品獲得高質量的AOA基因序列78 344條, AOB基因序列52 568條。將以上獲得的序列按照97%的相似度進行聚類, 分別輸出OTU代表序列。從表1的結果可以看出處理組A 的AOA和AOB的OUT數均顯著低于其他2個組(<0.05)。通過alpha多樣性指數對不同處理組的AOA和AOB微生物群落豐富度和多樣性進行評估。對照組C的AOA微生物群落的豐富度指數(Chao1和ACE指數)顯著高于兩個處理組(<0.05), 但各組的多樣性指數(Shannon和Simpson指數)沒有顯著的差異(>0.05)。AOB微生物群落結果顯示處理組A的豐富度指數顯著低于對照組和處理組B, 多樣性指數各組間沒有顯著的差異(>0.05)。

注: 同一列內標有不同字母表示差異顯著(<0.05)

2.4 AOA和AOB群落物種組成分析

為了了解樣本中AOA和AOB群落的具體組成, 對抽平后的ASV/OTU表格進行統計計算之后獲得每個樣本在屬水平組成和豐度分布表, 并以柱狀圖呈現分析結果。AOA群落組成如圖3a所示, 共有3個屬組成該群落, 分別為屬、屬和屬, 其中的優勢屬(相對豐度>1%)是屬和屬, 分別占 AOA基因總序列的64.02%～91.05%和8.1%～27.4%。對照組C中s屬的相對豐度顯著高于處理組A和B (< 0.05), 在兩個處理組之間沒有顯著差異(>0.05)。而對照組C中的屬的相對豐度顯著低于處理組A和B, 同樣在2個處理組中沒有顯著差異。屬占AOA基因總序列的比例較低且在各組的相對豐度沒有顯著差異(>0.05)。AOB微生物群落共由6個屬組成(圖3b), 其中屬和屬為主要優勢屬, 分別占 AOB基因總序列的39.5%～67.6%和10.7%～50.1%。與對照組相比處理組的屬的相對豐度顯著上升, 而處理組A中屬的相對豐度顯著下降(<0.05)。在2個處理組之間處理組B中屬和屬的相對豐度均顯著高于處理組A中(<0.05)。另外的4個屬占AOB基因總序列的比例較低且在各組的相對豐度沒有顯著差異(>0.05)。

注: MC 對照組; MA: 高頻率低劑量組; MB: 低頻率高劑量組

3 討論

養殖水體和底泥中的氨氮和亞硝氮是微生物利用含氮有機物進行硝化作用過程中產生的重要中間產物, 可以作為判斷養殖環境好壞的重要指標[12]。對蝦的排泄物、殘余的餌料等的腐爛性分解會沉積在水-底泥界面, 容易造成界面的缺氧狀態。硝化作用是需氧的氧化還原反應, 一定的氧含量是介導硝化作用的微生物進行硝化作用所必須的[19]。沉積在水?泥界面的對蝦糞便、未利用的餌料等都是高含氮量的有機物, 致使底泥中氨氮和亞硝氮比水中高幾個數量級[20]。隨著養殖的進行各組的氨氮和亞硝氮含量均有不同程度的上升, 其中處理組A中氨氮和亞硝氮含量上升速度最快, 隨后是對照組C; 第3周開始處理組A中的氨氮和亞硝氮含量持續高于對照組C和處理組B, 而且在處理組B中含量最低。這表明單次高劑量KMPS的投放, 可以有效的降低底泥中氨氮和亞硝氮的含量。這可能是因為KMPS片劑在水?泥界面分解釋放氧氣, 促進了硝化作用, 同理于過碳酸鈉的施用下分解釋放氧氣, 溶解氧的增加促進氨氮的硝化作用, 進而促進了氮的循環[21]; 而且研究表明, KMPS可以直接與氨氮發生反應, 生成亞硝酸鹽; 另外KMPS在污泥處理中可以降解多種復雜的有機物[22], 對底泥中的有機物也可能存在同樣的作用。但是高頻率低劑量KMPS的投放反而不利于硝化作用, 可能是連續的投放對硝化作用微生物產生持續性的抑制作用, 導致中間產物氨氮和亞硝氮的積累。

氨氧化微生物介導的有機物氨氧化過程作為限速步驟, 在整個硝化作用中起到決定性的作用。驅動氨氧化作用的微生物AOA和AOB廣泛分布于幾乎所有土壤、淡水、湖泊底泥和海洋環境中; 并且在許多環境中AOA比AOB更加豐富[23-26]。在我們實驗環境中, AOA數量明顯高于AOB, 推測AOA在此環境下的硝化作用中發揮著主導作用。隨著養殖地進行, 介導氨氧化作用的AOA和AOB豐度均增長, 但同期高頻率低劑量KMPS投放組的AOA和AOB豐度顯著低于對照組, 表明高頻率低劑量KMPS的投放對二者存在部分抑制作用。養殖開始的前兩周KMPS的投放沒有對AOA數量造成影響, 從第3周開始至實驗結束時, 期間處理組A中的AOA數量始終低于其他兩組, 表明高頻率低劑量的KMPS投放持續對AOA造成影響。KMPS在水中能夠在短時間內快速分解, 對很多微生物產生抑制作用[11]。除第5周外, 對照組C和處理組B中AOA數量沒有顯著差異, 推測單次高劑量KMPS投放對AOA的抑制作用不持續存在, 隨著抑制的解除AOA可以恢復生長和繁殖。與AOA相比AOB在養殖的前中期的較長時間內對KMPS的投放并不敏感, 但從第4周開始在投放頻率與投放量積累的雙重作用下, 處理組A中AOB數量顯著低于其余兩組。

與基因豐度檢測結果相似, alpha分析結果顯示, 處理組A中的AOA和AOB相對豐度顯著低于對照組C和處理組B, 表明高頻率低劑量的KMPS投放對AOA和AOB起到抑制的作用。AOA和AOB的多樣性在各組間沒有顯著差異, 表明KMPS投放與否以及投放的方式對氨氧化微生物的多樣性不產生影響。KMPS對不同種微生物可產生不同作用, 可對某些微生物產生抑制而對其他一些微生物無影響[27]。當前的養殖環境中檢測到AOA的種類較少, 優勢屬分別為屬、屬, 這與之前的研究中表明屬和屬是組成AOA群落主要的屬一致[28-30]。本研究結果顯示KMPS對二者的影響不同, 與對照組相比KMPS的投放降低了底泥中屬的豐度, 提升了屬的豐度; 但在2個處理組之間2個優勢屬的相對豐度沒有顯著差異, 表明KMPS對AOA的影響與投放的方式關系不大。AOB微生物群落共由6個屬組成, 其中屬和屬為主要優勢屬, 與之前對水產養殖池塘沉積物[31]和淡水湖沉積物[32]的研究類似。與對照組相比, KMPS的投放提升了屬的相對豐度, 降低了處理組A中屬的相對豐度。在2個處理組中, 處理組B中屬和屬的相對豐度均顯著高于處理組A中, 表明不僅是KMPS的投放與否, 投放的方式也會對AOB產生不同的影響, 低頻率高劑量KMPS投放對AOB具有促進的作用。

4 結論

本實驗首次探究了KMPS投放對養殖底泥中氮素循環及氨氧化作用的影響。實驗結果表明, 不同的投放方式產生的影響有明顯的差別, 高頻率低劑量KMPS投放對底泥中AOA和AOB的生長產生部分抑制作用, 使其不能夠滿足氮素轉化的需求, 而低頻率高劑量KMPS投放對AOA豐度沒有明顯影響, 對AOB群落生長表現出積極的作用, 因此促進硝化作用順利進行。以上結果為KMPS可作用于底質中氮素的降解提供了理論依據, 同時為蝦類養殖環境改善提供了更多的可選擇辦法。

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Effects of potassium monopersulfate on the nitrification, abundance, and community structure of ammonia-oxidizing microorganisms in shrimp culture sediments

ZHAO Zhen1, 3, WANG Bao-jie1, 2, LIU Mei1, 2, 4, JIANG Ke-yong1, 2, WANG Lei1, 2, 4

(1. CAS Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China)

The effects of potassium monopersulfate (KMPS) on the nitrification of aquaculture substrates were investigated by adding KMPS into a simulated pond. To investigate the effects of KMPS on nitrogen conversion, ammonia nitrogen and nitrite nitrogen contents were measured. The contents of ammonia nitrogen and nitrite nitrogen in the low-frequency and high-dose groups were significantly decreased, whereas those in the high-frequency and low-dose groups were significantly increased. The application of high-frequency and low-dose KMPS reduced the abundance of ammonia-oxidizing archaea (AOA) and ammonia-oxidizing bacteria (AOB), whereas the application of low-frequency and high-dose KMPS increased the abundance of AOB in some periods. Further analysis of community structures showed that the relative abundance ofdecreased, whereas that ofincreased in AOA due to the application of KMPS; this change was independent of the application mode of KMPS. However, the AOB community was affected by the application mode of KMPS, and the relative abundance of dominant genera in AOB significantly increased under low-frequency and high-dose KMPS. These results indicate that the application of low-frequency and high-dose KMPS can promote sediment nitrification. This study can also open a new possibility for KMPS to be used for aquaculture sediment improvement.

Potassium monopersultate; nitrification;gene abundance; microbial community structure

Feb. 28, 2021

S968.22

A

1000-3096(2021)11-0054-08

10.11759/hykx20210228002

2021-02-28;

2021-03-23

國家重點研發計劃課題(2019YFD0900401); 中國科學院科技支撐項目(2019T3035)

[Supported by National Key R&D Program of China, No. 2019YFD0900401; STS program supporting project of Chinese Aca-demy of Sciences of China, No. 2019T3035]

趙珍(1996—), 女, 黑龍江人, 碩士研究生, 主要從事水產養殖病害防控的研究, E-mail: 15232168709@163.com; 王雷(1966—),通信作者, E-mail: leiwang@qdio.ac.cn

(本文編輯: 趙衛紅)