TGF-β3誘導牙源性干細胞修復牙槽骨缺損的研究進展

唐青霞 綜述 趙月萍 審校

暨南大學口腔醫學院，廣東 廣州 510632

如何促進牙槽骨缺損的修復是臨床上關注的熱點。目前，臨床上針對牙槽骨的修復再生主要是通過骨移植、引導性骨再生等方法，但這些方法因手術適應證不同、手術技術的復雜程度不同而表現出其固有的局限性[1]。以組織工程學為基礎的治療策略，為當前的研究熱點，包括生長因子、種子細胞、生物支架，為牙槽骨修復提供新的治療策略[2-3]。轉化生長因子-β3(transforming growth factor-β3，TGF-β3)是轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員之一，已有實驗證據表明，TGF-β3不僅僅是軟骨組織工程的理想細胞因子之一，其可以通過軟骨內骨化途徑促進骨內修復[4]。本文對TGF-β3在誘導牙源性干細胞成骨分化和相關信號通路方面的最新研究做一綜述。

1 TGF-β3生物學功能和應用

外源性生長因子在骨組織再生過程中發揮著重要作用。TGF-β作為一種重要的骨生長調控因子，同時促進成骨細胞的生長和抑制破骨細胞的形成。轉化生長因子是一種具有多種生物學功能的多肽生長因子超家族，它在各種生理病理中起著重要作用，例如細胞生長和分化、基質形成、機體免疫、損傷修復、軟骨和骨的形成、免疫調節等。TGF-β家族可分為許多亞家族，其中TGF-β亞家族包括了TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，三種TGF-β之間的核酸序列具有高度的同源性[5]。實驗研究表明，TGF-β3與骨形態蛋白聯合后在誘導成骨細胞分化時的雙向調控作用更加持久[6]。

TGF-β3已在體內用于軟骨修復、組織再生和傷口愈合[7-9]，并促進基質形成、免疫和維持干細胞特性[10]。TGF-β3能促進MSCs向增殖和早期分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌腱細胞[5]。TGF-β3能誘導軟骨內骨形成[11]，并完成骨重建[12]，也可招募內源性MSCs啟動骨再生[13]。近幾年來，TGF-β3逐漸被用于誘導牙源性間充質干細胞的實驗研究，因此，TGF-β3可被認為是修復牙槽骨缺損的選擇性生物活性分子。

2 TGF-β3誘導牙源性干細胞成骨分化的作用

牙源性干細胞包括了牙周來源的間充質干細胞和牙髓來源的間充質干細胞，被認為是骨再生過程中的關鍵細胞。牙源性干細胞在牙槽骨損傷修復中表現突出，是優于其他體細胞來源的干細胞[14]。牙源性干細胞被定義為具有自我更新能力和多向分化潛能。其中，牙髓干細胞和牙周膜干細胞因臨床潛力大而被廣泛用于骨再生的體內外實驗研究。在適宜的誘導條件下可以分化成為多種組織細胞，包括成牙本質細胞、成軟骨細胞、成骨細胞、血管內皮細胞和心肌細胞等，是口腔組織工程及再生醫學領域中最重要的種子細胞[15]。TGF-β3對牙源性干細胞的誘導作用主要以成軟骨向和成骨向兩個方向為主[16]。

麥麥提依明·哈力克等[17]研究表明，TGF-β3與肝素聯合作用，可在無支架材料環境中可促進牙髓干細胞成骨方向的分化，并可以防止TGF-β3受蛋白酶水解及化學性失活，從而保護其活性，并能發揮更好的生物學作用。并發現在恒定磁場(static magneticfield，SMF)作用下，能提高牙髓干細胞氧代謝水平，形成了高濃度氧代謝環境，從而增強了TGF-β3對牙髓干細胞的體外誘導分化能力[18]。王騰等[19]將牙髓干細胞聯合外源性TGF-β3置于兔骨缺損區，增強了成骨細胞的生長分化和增殖效率，并能加速新骨形成。一項體外實驗研究表明，TGF-β3在實驗濃度范圍內對牙周膜干細胞增殖沒有影響，但能促進其成骨分化。將其負載與殼聚糖海綿上可以有效的促進牙周膜干細胞成骨向分化[4]，其相關治療機制及在構建牙槽骨骨修復材料方面仍在深入研究中。

3 TGF-β3誘導牙槽骨修復的成骨方式

骨損傷的修復方式包括膜內成骨和軟骨內成骨。膜內成骨方式是先由間充質分化成為胚性結締組織膜，然后在該膜中骨化。在整個骨修復過程中沒有軟骨骨痂的生成，而是直接由干細胞分化成熟為成骨細胞，成骨細胞分泌骨基質將缺損修復。軟骨內成骨的骨修復過程如下，首先由軟骨細胞增生肥大，軟骨基質鈣化，致使軟骨細胞退化死亡，隨著軟骨和骨細胞的侵入，新生血管長入，骨祖細胞形成成骨細胞并分泌鈣化的軟骨基質，從而最終完成骨的修復過程。

UGO RIPAMONTI教授團隊開展TGF-β3在牙骨質和骨發育形成中的功能研究已有將近20年的歷史，從2006年至今在《Biomaterials》等發表了多篇高水平的研究論文[20-21]，而且一直在持續更新進展。除此，在靈長類動物狒狒下頜第一、第二磨牙牙周骨缺損模型也證實TGF-β3顯著誘導了骨的形成[22]。但相關理論和機制并沒有得到清楚的解釋和闡述，從動物實驗到人的應用還有許多待解決的科學問題。在對異位骨化(HO)疾病的研究中發現，TGF-β3可能是HO的誘因，而HO是通過軟骨內骨化發生發展起來的。其可能機制是：首先免疫細胞在受損部位聚焦釋放TGF-β3，然后軟骨細胞增殖、肥大并礦化；此后活性的TGF-β3招募MSPCs與Nestin+的H型血管共同促進了新生骨的形成[23]。2020年新發表在Nature的文章對血管缺乏涉及的脂質代謝和骨骼祖細胞的命運進行了深入探討，指出微小血管的形成及營養運輸對軟骨內成骨非常重要，該文章為軟骨內成骨的機制研究提供了新的證據[24]。這些研究表明，TGF-β3誘導軟骨內骨化途徑可能刺激體內骨的形成。現有技術手段和理論認為牙槽骨主要通過膜內成骨的方式進行成骨，TGF-β3誘導骨再生機制屬于“軟骨內成骨”，應用TGF-β3進行牙槽骨再生修復將是一種新的研究策略。

4 TGF-β3誘導牙槽骨修復的信號通路

轉化生長因子-β超家族信號在多種生物系統中調控細胞生長、分化和發育中發揮重要作用。在成骨分化和骨再生過程中，TGF-β3介導的信號轉導特異性通過典型的Smad依賴通路(TGF-β配體、受體和Smad)和非典型的Smad獨立信號通路(如p38 MAPK通路)發生[25]。

4.1 TGF-β3受體與信號轉導 目前已明確TGF-β3的特異性受體有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅰ型受體和Ⅱ型受體都屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，Ⅱ型受體決定受體的反應特異性。在無Ⅰ型受體的情況下，Ⅱ型受體主要與TGF-β1和TGF-β3高親和力結合，而不與TGF-β2結合[26]。Ⅲ型受體本身不參與信號傳導，作為一種輔助受體，間接調節TGF-β1與受體結合的過程。近期報道中，評估了可溶性轉化生長因子β受體3(TgfβR3)在誘導人骨源性成骨細胞樣細胞增加礦化中的作用，證實了TgfβR3信號可誘導骨前體成骨[27]。Smad蛋白是TGF-β家族受體下游的信號轉導分子。根據在TGF-β信號轉導中的功能差異，其被分為三類：包括受體調控型或通路限制型(R-Smad)：Smad1/2/3/5/8；共同通用型(Co-Smad)：Smad4；抑 制 型(I-Smad)：Smad6/7[26]。通常來說，信號轉導始于配體誘導的絲氨酸/蘇氨酸受體激酶的寡聚化，以及TGF-β/激活素途徑中的細胞質信號轉導分子Smad2/3和骨形態發生蛋白(BMP)途徑中的Smad1/5/9磷酸化[28-30]。在公認的TGF-β誘導Smad激活后，導致Smad介導基因表達的模型中：TGF-β二聚體與Ⅱ型TβRII結合，導致TβRI募集到異構體受體復合體中，使TβRI的GS結構域轉磷酸化。隨后激活的TβRI通過C-末端絲氨酸的磷酸化激活Smad2和Smad3，這些受體激活的R-Smads與Smad4結合，形成Smad三聚體進入細胞核，并與靶基因Smad結合的調控DNA序列上的其他輔助轉錄因子結合，從而直接激活或抑制靶基因的表達[31]。

4.2 TGFβ-Smads信號通路 TGFβ-Smads信號通路促進骨祖細胞增殖、趨化和早期分化。同時，它也抑制成骨細胞的成熟、礦化和向骨細胞過渡。通過降低RANKL/OPG分泌比例抑制破骨細胞分化，但通過直接結合破骨細胞上的受體促進破骨細胞發生。Smad2和Smad3具有雙向調節轉化生長因子-β介導的成骨細胞分化和軟骨細胞內骨化。Smad2/3抑制Runx2的表達，激活的Smad3也招募Ⅱ類組蛋白去乙酰化酶(HDACs)4和5來抑制Runx2的功能，在缺乏Smad3的情況下，TGF-β不能再抑制成骨細胞的分化[32-34]。TGF-β-Smad3雖然負調控成骨細胞的發生，但也抑制成骨細胞凋亡和向成骨細胞分化[35]。因此，Smad3缺失大鼠的骨質減少與骨細胞數量增加和細胞凋亡相關。成骨細胞受到機械力刺激時細胞數目增加，同時TGF-β的表達亦增加。在大鼠腭中縫牽張成骨實驗中，驗證了在應力刺激下成骨細胞TGF-β1、TGF-β2的高表達使其增殖指數上升，而TGF-β3呈低表達狀態。Smad4作為唯一的通用型Smad分子，是TGFβ信號通路的中心介導者。TGF-β3在體外促進rDPSCs的成骨向分化實驗中，不同時間點Smad4呈高表達趨勢，但Smad2/3復合物及相關Smad蛋白是否參與到TGF-β3誘導的rDPSCs成骨還尚未見報道[36]。

4.3 TGFβ-p38MAPK信號通路 p38MAPK(α、β、γ和δ)是MAPK家族的成員，各種環境應激和炎癥細胞因子均可將其激活。多項研究表明，PDLSCs通過p38MAPK信號通路進行成骨分化[37-39]。研究發現，在TGF-β3誘導PDLSCs后，TGF-β3與TβRⅠ/Ⅱ受體結合后，啟動p38磷酸化后入細胞核促進RUNX2的表達，從而促進hPDLSCs的成骨分化，但其上下游分子機制不明[4]。RUNX2在協同參與成骨細胞分化的多種信號方面發揮重要作用，是成骨分化和骨形成所必需的特異性轉導調控因子，也是細胞成骨分化過程中最早持續表達的蛋白，標志著成骨分化的開始。TGF-β3誘導牙源性干細胞成骨分化的p38 MAPK信號通路，多數學者認同以下觀點：TGF-β3激活特異性Ⅰ型、Ⅱ型受體并與之相互作用，形成受體復合物，并將信號傳導到細胞內，使得細胞內的TAK1被激活，TAK1再激活并磷酸化MKK3/6，進一步激活下游的P38MAPK，后者可直接進入細胞核，從而磷酸化激活RUNX2，影響細胞因子的釋放并上調相關的成骨相關基因表達，促使干細胞成骨分化。

5 結語

牙槽骨缺損修復是臨床上最常見的棘手問題，對于牙槽骨的功能性保存與修復再生是十分必要的。轉化生長因子家族在骨組織工程修復中起著重要的作用，大量實驗證實了TGF-β3具有促進骨軟骨細胞軟骨分化的能力，是軟骨組織工程的理想細胞因子之一。將TGF-β3作為牙槽骨修復的細胞因子，是骨向修復而不是軟骨，突破了TGF-β3慣常的理論，將是一種新的策略。本文分析了TGF-β3能誘導的牙源性干細胞成骨分化的作用以及兩條重要途徑——Smads信號通路和p38MAPK信號通路，但是在其他信號通路的作用及相關通路之間的聯系目前尚不清楚。TGF-β3用于與牙槽骨缺損修復的應用研究的相關理論和機制并沒有得到完全清楚的解釋和闡述，從動物實驗到人的應用還有許多待解決的科學問題，可望形成新的治療策略，為骨組織工程的研究提供新思維。