基因重組技術在豬偽狂犬病毒基因工程疫苗中的研究進展

柯海意，王 帥，徐民生，蔡汝健，勾紅潮，臧瑩安，李春玲，簡運華

（1.仲愷農業工程學院動物科技學院，廣東 廣州 510305；2.廣東省農業科學院動物衛生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣東 廣州 510640；3.茂名市動物疫病控制中心，廣東 茂名 525000；4.廣東廣墾畜牧集團股份有限公司，廣東 廣州 510612）

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）為皰疹病毒家族成員，豬是PRV 的天然宿主和主要傳染源［1］。PRV 感染能夠引起母豬流產、產死胎，仔豬出現神經癥狀，成年出現豬呼吸困難等系統性疾病，對世界各地養豬業造成巨大經濟損失。1970 年開始，我國生豬飼養規模化發展，但國外種豬大量引進和國內生豬頻繁調運等因素使PRV在我國呈蔓延趨勢，嚴重影響我國集約化生豬養殖產業的健康發展，直至引入匈牙利Bartha-K61株疫苗后，通過免疫接種、野毒監測及凈化等技術手段,才有效控制了豬偽狂犬病疫情［2］。但使用該疫苗會出現潛伏帶毒和毒力返強的可能。2011 年開始，許多規模化豬場均不同程度地出現了傳統疫苗免疫失敗的情況，豬發病率和死亡率明顯上升，并出現了新的發病特征。近幾年，我國很多地區都從病豬中分離出了新的PRV 毒株，并且證實為PRV 變異株。將PRV 變異株與傳統PRV 毒株進行相關毒力基因序列對比，發現兩者之間存在明顯差異，新的PRV 毒株抗原性已發生一定變異，傳統的PRV 毒株屬于基因Ⅰ型,而變異株屬于基因Ⅱ型。與經典強毒株相比,PRV 變異株引發的的臨床癥狀更明顯，傳播速度更快，死亡率更高,呈現出毒力增強的趨勢，Bartha-K61疫苗已不能提供完全保護，導致我國呈現PRV 變異株大面積流行的情況［3-5］。

PRV 毒力由多基因共同調控,病毒的復制和致病機制復雜，且毒力增強機制尚未研究清楚［6］。通過基因重組技術對PRV 關鍵毒力基因敲除或插入免疫增強基因，是降低病毒毒力或提高病毒免疫原性的有效方法之一，也是研制PRV 基因工程疫苗的重要手段。自20 世紀80 年代基因重組技術出現后，已有多種技術手段應用于PRV基因組的改造，根據技術原理的不同，大致可分為四類：經典的基因同源重組技術、Cre/lox P 位點特異性重組技術、細菌人工染色體（Bacterial artificial chromosome，BAC）技術、CRISPR 基因編輯（Gene-editing）技術。本文綜述了目前應用于PRV 的基因重組技術，以期為PRV 重組疫苗的進一步深入研究提供參考。

1 PRV 基因組

1.1 PRV 基因組結構

PRV 是一種雙鏈DNA 病毒，其基因組龐大，約為150 kb，GC 含量高達74%，至少含有70 多個開放閱讀框（ORF），編碼100 多種病毒蛋白質，成熟的病毒粒子約有50 種蛋白質。PRV 病毒基因組由長獨特區段（Unique long，UL）、短獨特區段（Unique short，US）及US 兩側的末端重復區（Terminal repeat sequence，TRS）與內部重復區段（Internal repeat sequence，IRS）組成。由于UL 區與US 區方向可以相同或相反，因此PRV 有兩種異構體，且兩種異構體均具有感染力。

1.2 PRV 基因功能

目前已基本研究清楚PRV 基因組中70 多個基因的功能，主要是用于編碼病毒的結構蛋白、免疫調節蛋白、轉錄調節因子、毒力相關蛋白、病毒復制與釋放相關酶類等。PRV 有11 種糖蛋白（gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM、gN），其中gG 為非結構成分，是與分泌相關的蛋白，其余10 種均為結構蛋白，在病毒感染機理、復制機制和免疫誘導中具有特殊作用［7］。gB、gD、gH、gL、gK 是病毒復制所必需的糖蛋白，gE、gI 是病毒的主要毒力基因。在免疫誘導方面，糖蛋白gB、gC、gD 是PRV 的主要保護性抗原蛋白。此外，胸苷激酶（TK）、核酸還原酶（RR）、蛋白激酶（PK）、堿性核酸外切酶（AN）和脫氧尿苷三磷酸激酶（dUTPase）等與PRV 的毒力密切相關，其中TK 基因編碼胸苷激酶，是PRV最主要的毒力基因，也是決定PRV 持續感染的重要因素。TK 基因缺失后，病毒的毒力將明顯降低［8］。相關研究［9］發現，PRV 超過一半是復制非必需基因，這些基因通常也是毒力相關基因。缺失毒力相關基因會降低PRV 的毒力但不影響病毒生長，由此PRV 可作為一種異源基因插入的理想載體。

2 PRV 基因工程疫苗的基因重組技術

2.1 基因同源重組技術

同源重組（Homologous recombination,HR）主要是基因同源序列發生在分子間或分子內的DNA，交換對等部分然后重新組合。根據同源重組原理，合理設計并通過目的基因克隆、融合PCR和酶切連接等方法構建不同結構的重組載體，然后利用DNA 轉化技術將其導入宿主細胞中，實現對宿主基因序列的插入、缺失或者置換突變。通過體外同源重組技術構建重組病毒，篩選一個親本毒株復制非必需基因片段，將此片段克隆到質粒轉移載體上，再與病毒基因組DNA 共轉染到細胞進行同源重組，最終將外源基因導入病毒基因組。重組病毒具有與親本株相同的生物學特性。但是在重組病毒研究中應用，同源重組技術與反向遺傳操作技術（病毒拯救），RNA 干擾和PCR修飾等有所不同，這種方法避免了在體外直接操縱基因，不需引入其他DNA 序列，并且簡化了實驗程序。同源重組有磷酸鈣-DNA 共沉淀轉染法、脂質體介導的DNA 轉染法、含質粒DNA 的細胞原生質體與哺乳動物細胞融合技術等3種方法［10］。同源重組技術改造病毒，其重組效率不高，重組病毒純化篩選過程也相對較復雜。

目前，人們已經利用同源重組成功構建了多種重組病毒。王琴等［10］領先開展了系統性PRV分子生物學研究，采用磷酸鈣法和脂質體介導的DNA 轉染法將TK 缺失重組質粒PDTK－DNA 與PRV Fa DNA 進行同源重組，獲得了PRV Fa TK－毒株。該團隊用磷酸鈣轉染了構建的PP63LacZ轉移載體質粒和PRV Fa DNA 到MDBK 細胞，通過同源重組獲得了PRV Fa gE－/gI－/LacZ 基因缺失株。將pDTK 3-6、5-6 TK 缺失質粒與上述雙基因缺失菌株在TK-143 細胞中同源重組以獲得gE－/gI－/TK－三基因缺失疫苗株（PRV-SA215株）［11］。陳煥春等［12］將PRV 鄂A 株TK－突變株基因組DNA 和TK 缺失轉移質粒pUCPB 采用磷酸鈣法共轉染PK-15 細胞，構建了PRV Fa TK基因缺失株。WANG 等［13］構建了PRV AH02LA株的感染性克隆，獲得了gE 缺失突變株PRV（LA-AB），將PRV（LA-AB）株滅活后加入佐劑制備滅活疫苗，顯著減少了攻毒后病毒脫落，能為動物提供完全的臨床保護。童武等［14］采用同源重組的方法對PRV 變異株（JS-2012 株）進行改造，成功構建了PRV gE 和gI 雙基因缺失的病毒株（JS-2012-ΔgE/gI 株），以PRV-JS-2012-ΔgE/gI 毒株為種毒，開發出了PR 活疫苗和滅活疫苗，經過免疫學試驗，結果表明該活疫苗與滅活疫苗對兩周齡哺乳仔豬具有安全性，免疫后仔豬得到充分的免疫保護，能抵抗經典PRV或PRV 變異株，其免疫原性和反應原性表現優越。

2.2 Cre/lox P 位點特異性重組技術

Cre/lox P 位點特異性重組系統來自于大腸桿菌噬菌體P1，該系統由特異性Cre 重組酶和特異性lox P 位點兩部分組成。Cre 重組酶能夠識別特異的DNA 序列（lox P 位點）并進行特定的切割和拼接。Cre重組酶蛋白有N端和C端兩個結構域，N端與lox P的識別有關，C端處有1個四聯體結構，是Cre 基因的活性中心，與DNA 的切割結合都有關。Cre 酶的特異識別位點lox P 是兩個13 bp 的反向重復序列與8 bp 的間隔序列。位點特異性重組發生在特定DNA 序列之間，在重組酶的介導下，識別并切割特定DNA 序列，實現結合交換，完成重組［15-16］。位點特異性重組只發生在特異位點之間，克服了外源基因隨機整合帶來的不確定性，有助于推動構建穩定、高效的基因表達系。

王敏秀［17］將Cre/lox P 系統應用于PRV 重組，將單個的lox P 位點插入到TK-PRV SH 株中，構建了PRV 上海株TK 基因缺失株（rPRV2），其含有單個lox P 位點。蘇鑫銘［18］構建兩端帶有lox 位點的GPF 表達盒GFP-loxP 的PRV 重組病毒，HAT 反向篩選確定其為TK－表型，為進一步利用Cre/lox P 系統進行下游的基因工程操作打下良好基礎；之后構建了可用于外源基因在含有lox P 位點的PRV 基因組中快速刪除或整合，且能穩定表達Cre 重組酶的293A-Cre 細胞系。梁苑燕等［19］首先構建出了帶有lox P 位點和EGFP 的PRV gE－/EGFP+株，通過Cre 酶處理后得到不帶EGFP 的PRV gE－株，之后利用同樣的方法得到了PRV gE－/TK－株。吳鳳筍［20］在河南一免疫豬場分離出PRV 毒株（HNXY），使用傳統的同源重組技術結合Cre/lox P 系統，分別在gE、TK 位置重組了EGFP 熒光標記基因，細胞傳代篩選出攜帶熒光的PRV 毒株，先后缺失了gE、TK 基因且利用Cre 酶將EGFP 熒光標記基因去除，構建了一株雙基因缺失rPRV-HNXY-ΔgE-ΔTK 重組病毒。

2.3 細菌人工染色體技術

采用細菌人工染色體技術進行病毒重組，是將病毒基因組插入到 BAC 載體中，并借助細菌人工染色體進行基因組的保存和修飾。BAC 載體的大小約7.5 kb，其本質上是以大腸桿菌的F 因子為基礎的質粒克隆載體，它可將供體染色體（F+性狀標記）高效地轉移至受體細胞（F－）。天然F 因子是大小約100 kb 的雙鏈閉環DNA 分子，只有1～2 個低拷貝數，編碼60 多種參與復制、分配和接合過程的蛋白質，在大腸桿菌基因組DNA包裝后，大小可達上千kb。人工構建的BAC 載體（約7.4 kb），例如pBeloBAC11［21］保留了在細胞分裂時能保證將低拷貝的BAC 質粒精確分配到子代細胞的parA、parB 和parC 基因，與F因子自主復制功能相關的起始基因（oriS），以及易于DNA 復制的由ATP 驅動的解旋酶定向基因（repE）。細菌人工染色體具有許多優點：一方面由于病毒啟動子在細菌中不能正常工作，病毒基因需要借助細菌聚合酶在大腸桿菌中復制，此過程中病毒基因組不會發生基因突變，遺傳特性穩定；另一方面，BAC 質粒具有高容量特質，可以容納300 kb 外源基因，且BAC 載體上的細菌抗生素耐藥性基因方便在大腸桿菌中篩選。近年來快速發展的重組技術，如轉座子誘變、基于Rec-A 的重組系統、基于Red 的重組系統以及Cre/loxP 和FLP/FRT 重組系統等可以在BACs 中快速插入、刪除和突變特定序列，均利于進一步深入研究病毒基因功能［22］。

PRV 在體外環境復制較慢，因此在細胞培養過程中采用傳統的同源重組方法構建重組病毒十分復雜，而且重組成功后需對病毒反復純化耗時費力。長片段DNA 克隆的實現有賴于細菌人工染色體技術的突破。在大腸桿菌中，PRV 感染性克隆能以單拷貝或極低拷貝質粒的形式進行復制，且不易發生變異，可用多種不同的修飾技術進行遺傳操作，具有效率高和操作精度高的特點，將其轉染到宿主細胞后可成功拯救出重組病毒。1999 年PRV BAC（pBecker1）首次構建成功，該研究將F 質粒插入PRV-Becker gG 基因上游，盡管pBecker1 能在大腸桿菌中穩定增殖，但在轉染真核細胞后，F 質粒的某些序列會出現自刪現象［23］。為了解決這一問題，Smith 等［24］將BAC骨架載體插入PRVUS9基因poly A 序列的上游，并且在mimi-F 復制子和Camr基因兩側各引入了一個lox P 位點，進一步改進了PRV-BAC 的結構。在表達Cre 重組酶的動物細胞中轉入BAC 載體，在兩個lox P 位點之間的重組反應被Cre 酶催化，從病毒基因組上去除BAC 載體骨架部分，僅留下34 bp 的lox P 序列，保證了基因組的保真性和完整性。彭金美等［25］將pBeloBAC Ⅱ載體線性化后插入到帶綠色熒光蛋白篩選標記的質粒中，利用同源重組在PRV 弱毒疫苗株Bartha K61 的TK 基因中插入了BAC 質粒，獲得了重組病毒rv-PRVBAC，且重組病毒在Vero 細胞中能穩定遺傳。尹文玲等［26］將BAC 載體插入到PRV TK 基因中，構建了國內強毒分離株PRV-ZJ 感染性細菌人工染色體，并在此基礎上對該病毒株的基因組做了不同修飾。Zhang 等［27］利用同源重組方法將BAC 質粒插入PRV HN11201 株的TK 位點,成功構建PRV BAC,并在此基礎上利用Red/ET 技術敲除gE/gI 基因，構建了三基因缺失vPRV HN1201 TK－/gE－/gI－株。叢鑫等［28］以PRV TJ株為親本株，通過分段克隆將基因片段依次克隆到pOK12 載體中，構建成轉移載體pOK-TK-LR-EGFP；利用Cre/lox P 系統處理得到含單一lox P 位點的重組病毒rPRVTJ-delTK-lox P，提取rPRVTJ-delTK-lox P 基因組DNA，將其與pBelloBACII-RFP 同時用Cre 重組酶處理后，轉染Vero 細胞，進行重組病毒rPRVTJ-del TK-BAC-RFP 拯救。陳利紅等［29］將PRV 基因組用Accl Ⅰ酶切使其線性化，再與pBeloBAC Ⅱ轉移載體共轉染BHK21 細胞，拯救出重組病毒并研究其生物學特性。劉婭梅等［30］構建PRV AH02LA 株的BAC 時將mini-F 基因序列替換插入了gE 和gI 基因的等位位點，構建雙基因缺失重組病毒PRV-AH02LA（gE－/gI－），提取病毒環狀基因組轉化到DH10B 中，成功構建PRV AH02LA BAC。陳毓欣等［31］利用病毒重組細菌人工染色體BAC 對偽狂犬病毒進行基因修飾，采用Red/ET 同源重組技術構建了PRV UL21缺失株，Red/ET 重組系統通常利用PCR 產物進行重組，通過引物合成方式把BAC 重組所需的短同源序列插入到5′突出端，然后將PCR 產物電轉化到含有所需BAC 的大腸桿菌中，重組后的克隆可以通過選擇標記篩選出來。

2.4 CRISPR/Cas9 介導的基因編輯技術

CRISPR/Cas9技術是一種由向導RNA指導的，利用Cas9 核酸酶對靶向基因進行編輯的基因重組技術，因其載體構建簡單且靶向效率高而深受研究人員關注。CRISPR/Cas9 系統敲除流程如下：Cas 蛋白表達，間隔重復序列轉錄并經過剪切形成短CRISPR 的RNA，crRNA 通過堿基配對與tracrRNA 退火形成復合體，此復合體能特異性識別基因組序列，引導Cas 蛋白識別PAM 位點，結合到染色體上，在尋找到目標序列后，切割DNA形成雙鏈斷裂（Double strand break，DSB），再通過同源重組或非同源末端鏈接（Non-homologous end joining，NHEJ）修復［32-33］。而通過人工設計的crRNA 和tracrRNA，形成具有引導作用的sgRNA（Single guide RNA）。CRISPR/Cas9 技 術的應用能高效編輯靶向基因，也簡化了重組病毒的構建過程。

2016 年已有研究人員使用CRISPR/Cas9 技術對PRV 基因組進行基因改造。Xu 等［34］利用CRISPR/Cas9 成功構建了PRV gE－/TK－株。于之清［35］首次使用CRISPR/Cas9 技術直接對病毒基因進行大片段替換編輯，將CRISPR/Cas9基因編輯技術與同源重組相結合，用PRV 突變株JS-2012 的gB 基因取代了PRV 經典疫苗株Bartha-K61 的gB 基因，用低熔點瓊脂糖噬斑和PCR 對病毒進行純化和篩選鑒定，獲得重組病毒rPRV-BJB。劉繼婷［36］采用CRISPR/Cas9 技術對PRV HeN1 毒株基因組進行快速編輯，先是篩選出有效的sgRNA，將PRV HeN1 毒株gE、gI 和TK 3 個基因分別敲除，獲得了gE－PRV、gE－/gIPRV 和gE－/gI－/TK－PRV 3 株基因缺失毒株，并在小鼠體內進行免疫保護實驗，其中gE－PRV和gE－/gI－PRV 基因缺失毒株的致病力與親本毒株HeN1 無明顯差異，而gE－/gI－/TK－PRV 三基因缺失株的毒力相對于親本株明顯降低，對當前流行的PRV 變異株HeN1 表現出良好的免疫保護作用，促進了研制PRV 變異株疫苗的發展。2018 年湯艷東等［37］構建了Luciferase 螢光素酶和EGFP 雙報告基因的重組病毒，同時建立了PRV 大片段缺失平臺，發現了雙sgRNA 共同介導可提高大片段基因缺失效率。金銘等［38］采用CRISPR/Cas9 基因編輯技術，首先篩選出轉染效率較高的細胞系和1 對高效編輯 PRV gE 基因的sgRNA，通過5 輪噬斑克隆純化，獲得1 株重組病毒PRV-1-ΔgE，對傳代病毒進行測序分析，證實此重組病毒能穩定遺傳。

2.5 CRISPR/Cas9 和Cre/lox 技術聯用

CRISPR/Cas9 技術與Cre/lox 技術聯用，可以對PRV 基因組多個位點同時進行修飾。Xu 等［34］利 用CRISPR/Cas9 和Cre/lox 對PRV 的gE/TK 基因同時進行缺失，成功構建了PRV gE－/TK－株。首先，利用CRISPR/Cas9 系統結合同源重組，分別用兩側各有相同方向的lox P 和lox N 位點的綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白（mCherry）重組到PRV 野毒株強毒基因gE 和TK 位點。然后，應用單細胞流式細胞儀加速重組病毒的純化。隨后，利用Cre/lox 系統切除GFP 和mCherry 選擇基因。史志斌［39］首先從PRV 4 株流行株中篩選出免疫原性最高的HNQYY2012 作為親本株，利用CRISPR/Cas9 技術和Cre/lox P 系統構建帶有lox P 位點的HNQYY2012ΔgE/EGFP+，然后利用Cre 酶去除EGFP基因，構建PRV gE 基因缺失 株 HNQYY2012ΔgE。Li 等［40］利 用CRISPR/Cas9 和Cre/lox 系統分別構建了gE/gI 基因缺失重組株（rGXΔgE/gI）和TK/gE/gI 基因缺失重組株（rGXΔTK/gE/gI），小鼠免疫實驗和豬免疫實驗結果均表明，后者的安全性比前者更好。缺失TK/gE/gI 基因的重組PRV 更安全，可作為具有一定防控作用的PRV 候選疫苗。CRISPR/Cas9 技術與Cre/lox 技術的聯用彌補了CRISPR/Cas9 技術精確修復率低和同源重組技術重組效率低等問題，便于外源基因的插入和重組病毒的篩選，大幅提高基因編輯效率，縮短疫苗研發周期，使疫苗更好地預防當前流行毒株，達到更佳的免疫效果。

3 展望

豬偽狂犬病病毒變異快速，為臨床防控帶來了新的挑戰。而借助穩定、高效的基因重組技術敲除毒力基因和糖蛋白基因，加快研制出針對當前PRV 流行毒株的基因缺失疫苗，是對豬偽狂犬病有效防控的關鍵技術手段。同源重組技術重組效率較低，重組病毒純化篩選過程也相對較復雜。Cre/lox P 位點特異性重組技術對PRV 基因進行定位修飾，克服了其他類型重組技術隨機整合、引入抗性基因影響上下游基因表達及重組效率低等缺點，但Cre 重組酶介導lox P 位點間的重組仍需要通過傳統的同源重組方法，無法避免同源重組的低效性，需要結合其他方法彌補不足。以BAC為基礎克隆的載體，以環狀結構存在于大腸桿菌體內，便于篩選和分離純化，可通過多種不同細菌人工染色體的修飾技術對BAC DNA 進行遺傳操作，所構建的重組病毒不需要在宿主細胞傳代和篩選，構建過程效率高。CRISPR/Cas9 介導的基因組定點編輯技術結合同源重組和非同源重組對PRV 進行基因插入、缺失和替換，其操作簡易、高效而備受關注。而CRISPR/Cas9 技術與Cre/lox技術聯用，更便于外源基因的插入和重組病毒的篩選，從而提高了重組病毒的獲得效率，而且可以對PRV 基因組多個位點同時進行修飾，應用前景廣闊。CRISPR/Cas9 和多種基因重組技術聯用的病毒基因改造策略，對PRV 基因改造的發展和重組疫苗的高效研制具有指導意義。