響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助提取桑葉蛋白工藝研究

鄧 翔，李 祥，唐 奔，秦 祁，楊從發(fā),2

（1.江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005）

【研究意義】桑樹為桑科桑屬植物，在我國種植歷史久遠(yuǎn)，種植廣泛，尤其在江浙地區(qū)［1-2］。桑葉，是桑樹的葉片，性寒，味甘苦，被國家衛(wèi)健委列入藥食兩用目錄中。桑葉含有豐富的生物活性物質(zhì)，如黃酮類、多糖類、氨基酸和1-脫氧野尻霉素等［3-5］，具有治療肺氣失和、清肝瀉火氣和解毒明雙目等作用［6-7］。植物葉蛋白是指從植物莖葉中提取，其氨基酸組成比一般谷物和豆類蛋白質(zhì)豐富，與動(dòng)物性蛋白相仿且更適合被人體消化吸收的蛋白質(zhì)［8］。植物葉蛋白含有大量人體所需的必需氨基酸和非必需氨基酸，是一種資源豐富，不含膽固醇，具有一定食用價(jià)值和藥用價(jià)值的可再生新型蛋白資源，有極高的研究開發(fā)意義和價(jià)值［9-10］。【前人研究進(jìn)展】桑葉種植粗放、生產(chǎn)成本低廉、產(chǎn)量極高［11］,在藥用、食用、動(dòng)物養(yǎng)殖方面均有相關(guān)應(yīng)用。在藥用方面，桑葉生物堿1-脫氧野尻霉素為降血糖成分，黃酮類成分可抗病毒；在食用方面，近年已開發(fā)出桑葉烏龍茶、脫水桑葉菜等新產(chǎn)品；在動(dòng)物養(yǎng)殖方面，可直接喂食鮮葉或桑葉干燥磨粉后加入飼料中喂食［12］。研究表明，桑葉富含葉蛋白，葉蛋白含量占其干基重量的15%～30%［13］，且桑葉蛋白氨基酸種類較豐富，必需氨基酸含量較高，是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白來源，符合消費(fèi)者對(duì)蛋白食品的要求。但目前對(duì)葉蛋白的研究多在苜蓿草方面，對(duì)桑葉蛋白提取利用較少。我國擁有全球最豐富的桑葉資源，若僅將桑葉用于養(yǎng)蠶，利用有限且具有一定季節(jié)性，易造成資源費(fèi)現(xiàn)象。目前，葉蛋白的主要提取方法有堿溶酸沉法［14］、乳酸發(fā)酵法、膜過濾分離提取法、超聲波提取法［15-16］、發(fā)酵酸法［17］、有機(jī)溶劑法、鹽析法［18-19］和微波提取法［20-22］等。【本研究切入點(diǎn)】桑葉蛋白作為桑葉提取物，其成本低廉、來源廣泛、營養(yǎng)豐富，對(duì)于滿足當(dāng)代消費(fèi)者不斷增長的蛋白攝入需求有重要意義。本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法探索不同條件下桑葉蛋白提取率的變化并優(yōu)化提取方法。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)利用微波輔助堿法提取干燥桑葉中的葉蛋白，研究桑葉粉和浸提液之間的料液比、微波提取功率、微波提取時(shí)間、提取液pH值對(duì)桑葉蛋白提取率的影響，明確微波輔助提取桑葉蛋白的最佳試驗(yàn)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試桑葉采購于浙江蘭溪桑葉基地。考馬斯亮藍(lán)（北京化學(xué)試劑公司）、氫氧化鈉（天津市華東試劑廠），均為分析純。主要試驗(yàn)儀器包括：HM-SY96S 全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（山東恒美電子科技有限公司），L-550 臺(tái)式低速大容量離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），UDK132 半自動(dòng)凱氏定氮蒸餾儀（日本EYELA 東京理化器械株式會(huì)社），P70D20TL-D4 微波爐（格蘭仕電器制造有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑葉蛋白提取流程 桑葉原料→前期預(yù)處理→熱風(fēng)50 ℃烘干→粉碎，過孔徑74 μm 篩→稱取桑葉粉樣品→加去離子水→加1 mol/L NaOH 溶液調(diào)pH 值→微波輔助堿法提取→離心→上清液中蛋白質(zhì)含量測(cè)定→計(jì)算提取率

1.2.2 桑葉蛋白含量的測(cè)定 采用凱氏定氮法測(cè)定桑葉粉中的粗蛋白含量。（1）在6 支離心管中分別加入1 mg/mL 牛血清蛋白0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μL，再相應(yīng)加入0.15 mol/L PBS 緩沖液0.9、0.8、0.6、0.4、0.2、0 μL，然后在每支離心管中分別加入考馬斯亮藍(lán)G-250 溶液1.0 mL，輕搖顛倒混勻，靜置3 min 后用移液槍吸取反應(yīng)完全的溶液200 μL 到酶標(biāo)板孔中，測(cè)定595 nm 處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=3.1034x-0.031，R2=0.9957。

（2）精確稱量1 g（精確至0.0001 g）桑葉粉樣品，按比例加入去離子水，攪拌，固定微波裝載量為每組100 mL，微波輔助提取，離心，分離上清液，吸取一定體積的上清液，根據(jù)情況相應(yīng)稀釋后取200 μL，依照上述方法測(cè)定上清液的吸光度，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算桑葉粉樣品中的蛋白質(zhì)含量。

式中，M1為上清液中的蛋白含量（mg），M2為桑葉干粉中的粗蛋白含量（mg）。

1.2.3 桑葉蛋白提取工藝單因素試驗(yàn) 以蛋白提取率為指標(biāo)，選取微波功率（200、300、400、500、600、700 W）、微波提取時(shí)間（20、40、60、80、100、120 s）、pH 值（8、9、10、11、12、13、14）、料液比（1︰40、1︰60、1︰80、1︰100、1︰120 g/mL）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究各因素對(duì)蛋白提取率的影響并確定最佳提取工藝參數(shù)。

1.2.4 桑葉蛋白提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)的設(shè)計(jì)理論，選取pH（A）、料液比（B）、微波功率（C）、微波提取時(shí)間（D）對(duì)桑葉蛋白提取率影響顯著的4 個(gè)因素，使用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)（表1）。

表1 桑葉蛋白提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Response surface test factors and levels of mulberry leaf protein extraction process

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉蛋白提取工藝單因素試驗(yàn)

2.1.1 pH 對(duì)桑葉蛋白提取率的影響 由圖1 可知，桑葉蛋白提取率隨著浸提液pH 值逐漸上升而上升，當(dāng)浸提液pH 為13 時(shí)，桑葉蛋白提取率達(dá)到峰值23.72%。主要原因是隨著提取液pH值上升，部分蛋白變性而延展，更容易溶出。但提取液pH 值過高會(huì)使浸提液相對(duì)更加黏稠，對(duì)后續(xù)離心產(chǎn)生影響。此外，提取液pH 值過高可能會(huì)導(dǎo)致氨基酸發(fā)生脫氨、脫羧反應(yīng)，對(duì)桑葉蛋白提取液成分造成負(fù)面影響；桑葉蛋白的氨基酸組成與脫脂大豆粉基本一致［23］，在pH12.5 條件下，大豆蛋白、谷蛋白、酪蛋白等在堿性條件下進(jìn)行加熱處理，苯丙氨酸、異亮氨酸等必需氨基酸發(fā)生外消旋化為D-型氨基酸，導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)變性而造成營養(yǎng)價(jià)值流失［24-25］。因此在后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)中選取pH 值3 個(gè)水平分別為10、11、12。

圖1 pH 對(duì)桑葉蛋白提取率的影響 Fig.1 Effect of pH on extraction yield of mulberry leaf protein

2.1.2 料液比對(duì)桑葉蛋白提取率的影響 由圖2可知，料液比在1︰40～100 g/mL 范圍內(nèi)，桑葉蛋白提取率隨著料液比的減小明顯上升，當(dāng)料液比達(dá)到1︰100 g/mL 時(shí)，桑葉蛋白提取率達(dá)到峰值32.37%，之后隨著料液比的增加，桑葉蛋白提取率明顯下降。主要原因是當(dāng)料液比較高時(shí)，提取液黏度較高，阻礙蛋白質(zhì)溶出，導(dǎo)致浸提出蛋白質(zhì)的能力較低，從而導(dǎo)致可溶性蛋白提取不充分。當(dāng)料液比調(diào)整至合適比例時(shí)，提取液黏度降低，可溶性蛋白充分溶解于提取液內(nèi)，當(dāng)料液比大于最佳比例后，可能會(huì)導(dǎo)致降低分散于提取液內(nèi)的原料對(duì)于微波輻射的吸收，影響蛋白溶出，導(dǎo)致提取率不升反降。

圖2 料液比對(duì)桑葉蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of mulberry leaf protein

2.1.3 微波提取時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取率的影響 由圖3 可知，微波提取時(shí)間在20～120 s 范圍內(nèi)，桑葉蛋白的提取率隨著微波提取時(shí)間的延長呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，可能是提取時(shí)間過短，桑葉蛋白沒有被充分釋放出來，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到80 s 時(shí)，桑葉蛋白得到了充分的釋放，提取率達(dá)到最大值28.04%。之后繼續(xù)增加提取時(shí)間，會(huì)引起提取溫度持續(xù)升高，可溶性蛋白因熱變性，疏水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致提取到的蛋白相應(yīng)減少，提取率也隨之降低。

圖3 微波提取時(shí)間對(duì)桑葉蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of microwave extraction time on extraction yield of mulberry leaf protein

2.1.4 微波功率對(duì)桑葉蛋白提取率的影響 由圖4可知，桑葉蛋白提取率隨著微波功率的增加呈現(xiàn)出顯著上升趨勢(shì)，可能是初始微波功率過低，桑葉中的活性物質(zhì)沒有被充分釋放，當(dāng)微波功率達(dá)到500 W 時(shí)，桑葉蛋白提取率達(dá)到最大值25.77%，但當(dāng)微波功率繼續(xù)上升，桑葉蛋白提取率呈現(xiàn)出單邊下行的趨勢(shì)，特別是在微波提取功率升至600 W 后，桑葉蛋白提取率更是大幅度下降，其原因可能是由于微波功率過大時(shí)一些其他雜質(zhì)也被釋放出來，對(duì)蛋白質(zhì)分子的破壞也隨之增加。

圖4 微波功率對(duì)桑葉蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of microwave power on extraction yield of mulberry leaf protein

2.2 桑葉蛋白提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 桑葉蛋白提取結(jié)果 為進(jìn)一步優(yōu)化桑葉蛋白提取工藝，在前期單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，以pH、料液比、微波功率、微波提取時(shí)間為桑葉蛋白提取率影響顯著的4 個(gè)因素，使用Design Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的響應(yīng)面試驗(yàn)方案，結(jié)果見表2。

表2 桑葉蛋白提取工藝響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results of mulberry leaf protein extraction process

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型的建立 經(jīng)過對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)的多元回歸擬合，得到桑葉蛋白提取率與pH（A）、料液比（B）、微波功率（C）、微波提取時(shí)間（D）響應(yīng)面二次多項(xiàng)回歸模擬方程如下：

桑葉蛋白提取率Y=35.39+0.93A+1.55B+0.032C+1.01D -0.073AB -1.26AC -0.54AD -2.5×10-3BC+0.93BD -0.84CD -3.30A2-8.35B2-3.22C2-6.55D2

根據(jù)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)的方差分析，結(jié)果見表3。此模型的回歸系數(shù)R2=0.9546，說明提取率的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值擬合較好，決定系數(shù)RAdj2=0.9092，說明90.92%試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可以用此回歸模型來解釋。從表3 提取率方差分析可以看出，此模型P＜0.0001，具有極顯著性。失擬誤差P=0.1420 ＞0.05，表示失擬項(xiàng)不顯著，該模型擬合度良好，能夠較好地反映響應(yīng)面的變化。

F值的大小可以反映試驗(yàn)各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)影響程度的高低，F(xiàn)值越大表明試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)的影響越顯著。通過對(duì)比各因素的F值（表3）可知，在這些選用的因素水平范圍內(nèi)，按照對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響依次為：料液比（B）＞微波提取時(shí)間（D）＞pH（A）＞微波功率（C）。一次項(xiàng)中，B 極顯著，D 顯著，二次項(xiàng)中，A、B、C、D極顯著，交互項(xiàng)均不顯著，表明這4 個(gè)因素之間的交互效應(yīng)影響較小。由此可知，每個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值引起的影響并非是普通的線性關(guān)系。

表3 桑葉蛋白提取率試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of extraction yield test of mulberry leaf protein

2.2.3 響應(yīng)曲面分析 響應(yīng)面3D 圖反映出每兩個(gè)自變量因素之間的交互作用，可直觀反映各試驗(yàn)因素對(duì)桑葉蛋白提取率的影響。響應(yīng)曲面越陡峭表明圖中兩個(gè)試驗(yàn)因素交互影響越大，而反映兩個(gè)試驗(yàn)因素之間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱則是等高線的不同形狀［26-27］。由圖5 可見，料液比和微波提取時(shí)間的曲面都較為陡峭，對(duì)桑葉蛋白提取率影響相對(duì)較為顯著；再由等高線圖為橢圓可知，微波提取時(shí)間、pH 值、微波功率和料液比之間的各交互項(xiàng)均不顯著。

圖5 桑葉蛋白提取影響因素交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of the effect of interaction of factors affecting the extraction yield of mulberry leaf protein

2.2.4 最佳提取工藝條件的優(yōu)化及驗(yàn)證 根據(jù)桑葉蛋白提取率模型的二次回歸方程，通過Design Expert 8.0.6 對(duì)微波輔助堿法提取桑葉蛋白工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，選取模型中最優(yōu)提取條件，結(jié)果表明最佳提取工藝參數(shù)為：pH 11.4、料液比為1︰101.92 g/mL、微波功率為496.74 W、微波提取時(shí)間為81.6 s，此提取參數(shù)下桑葉蛋白提取率理論值為35.58%。考慮實(shí)際操作可行性，修正最佳提取參數(shù)為：pH 11.4、料液比為1︰102 g/mL、微波功率為500 W、微波提取時(shí)間為82 s，采用修正后的最佳提取參數(shù)進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，桑葉蛋白提取率為35.84%，試驗(yàn)結(jié)果與理論值基本一致。可見，根據(jù)響應(yīng)面法得到的優(yōu)化提取參數(shù)真實(shí)準(zhǔn)確，表明本試驗(yàn)所用模型適用桑葉蛋白的提取。

3 討論

由凱氏定氮法測(cè)得桑葉干粉中粗蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.18%，本試驗(yàn)采用優(yōu)化后的微波輔助堿法提取工藝得到的桑葉蛋白提取率高于江洪波等［28］采用堿法浸提工藝所得的桑葉蛋白提取率（4.42%）和朱天明等［29］采用纖維素酶輔助提取工藝所得的桑葉蛋白提取率（6.5%），相較于堿法浸提和纖維素酶輔助提取，微波輔助堿法提取桑葉蛋白效率高，能大幅減少提取時(shí)間，提高葉蛋白提取率，為桑葉蛋白的提取提供了更多的可行方法。基于不同地區(qū)桑葉干粉的粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在一定差異，后續(xù)可繼續(xù)深入研究不同產(chǎn)地桑蛋白含量的差異及桑葉在不同生長時(shí)期所含葉蛋白的差異等。我國擁有世界上最豐富的桑葉資源，但利用率低及桑葉產(chǎn)品附加值低，本試驗(yàn)為桑葉蛋白在藥用、食用及動(dòng)物養(yǎng)殖領(lǐng)域工業(yè)化生產(chǎn)提供研究基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究采用微波輔助堿法提取干燥桑葉粉中的葉蛋白，通過響應(yīng)面綜合考慮提取液pH 值、料液比、微波功率、微波提取時(shí)間4 個(gè)因素對(duì)桑葉蛋白提取率的影響，依據(jù)Box-Behnken 中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)了四因素三水平試驗(yàn)，結(jié)果表明，微波輔助堿法提取桑葉蛋白的最佳工藝參數(shù)為：pH 11.4、料液比1 ∶102 g/mL、微波功率500 W、微波提取時(shí)間82 s，在此工藝參數(shù)條件下桑葉蛋白提取率為35.84%。