人補體調節蛋白CD46與異種移植

容勛精 綜述 王毅 審校

海南醫學院第二附屬醫院器官移植科，海南 海口 570100

同種異體移植是治療終末期器官功能衰竭疾病的較好醫療手段之一。同種異體腎移植的優點在臨床上已經得到了充分的證實，相對于血液透析或者腹膜透析等治療方式，同種異體腎移植不僅延長了患者的生存時間，而且明顯改善患者的生活質量。然而，人體器官的供需不平衡使器官移植在臨床應用上遇到瓶頸。在中國，每年需接受腎移植的患者大約30萬，而實際接受腎移植的患者小于2 萬，這使器官來源短缺的問題更加突出。異種移植以轉基因豬器官移植的形式提供了克服已故和活著的人類捐贈者長期短缺的可能性，成為解決器官來源短缺這一世界性難題的根本途徑之一。然而豬-非人靈長類動物的異種移植同樣面臨著許多障礙，其主要障礙除組織相容性差及異種排斥反應外，還有凝血功能障礙、炎癥過程及人畜共患傳染病等，這些最終會造成異種移植物的失功。面對這些障礙研究者們不僅可以敲除異種抗原，還可以轉入人體補體調節蛋白(CRP)等進行調節，這使異種移植物的存活時間有所延長。人體CRP 主要包括人衰變加速因子、攻膜復合物抑制因子和膜輔助蛋白(CD46)等。本文將著重闡述人膜輔助蛋白(hCD46)在異種器官移植中的作用。

1 hCD46 的結構與功能

1.1 hCD46 的結構1985 年，hCD46 首次在人外周白細胞中發現，是能與C3b結合的膜蛋白，它被命名為gp45.70[1]。之后，有人首次提純并明確gp45.70為C3b 及C4b 裂解的輔助因子，同時改其名為膜輔蛋白，并依據人白細胞分化抗原劃分為CD46，因此CD46 又稱膜輔助蛋白[2]。hCD46 其染色體定位于人類1 號染色體短臂的32 號區，其分子量大小約48～56 KU，含有4 個同源的的短序列(scr)，屬于補體活化調節蛋白基因家族[3-4]。CD46 的N 端由4 個補體控制蛋白(CCPs)和一個通過選擇性剪接產生的高度O-糖基化區域組成，包括B 和/或C 亞型。B 和C 結構域富含蘇氨酸、絲氨酸和脯氨酸(STP)，隨后是12個功能未知的氨基酸、一個跨膜區域，然后是兩個可能的選擇性剪接細胞質尾部(CYT-1或CYT-2)中的一個。這兩個細胞質結構域都含有信號傳遞基序，并被證明介導不同的細胞功能[5-7]。CD46 為單鏈蛋白，通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定于細胞膜上，廣泛表達于造血細胞、白細胞、上皮細胞、血小板和成纖維細胞等表面，但不表達于紅細胞。

1.2 hCD46 的功能

1.2.1 CD46 與免疫調節CD46 是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，最初被鑒定為補體抑制劑。它是先天免疫系統的一部分，但也在適應性免疫中發揮作用。在先天免疫系統中，CD46是因子Ⅰ介導的C3b和C4b裂解的唯一普遍表達的輔助因子，在保護宿主細胞免受有害補體激活損傷中起到關鍵作用[8]。CD46 能夠同時在經典和旁路途徑兩條途徑中發揮調控補體激活的功能[9-10]。目前，關于CD46 在先天性免疫細胞中的作用了解甚少。有項研究表明CD46激活后可降低自然殺傷細胞的殺傷活性[11]。有關CD46 在適應性免疫系統中的研究相對較多，ASTIER 等[12]、ZAFFRAN 等[13]觀察到CD46 可作為人類CD4+T 細胞的共刺激分子，在抗原提呈過程中激活CD46 可誘導細胞增殖。CD46 的兩個主要細胞內尾(Cyt1 和Cyt2)通常在人細胞中共同表達。CD46的Cyt1和Cyt2對細胞增殖和白細胞介素2 (IL-2)和白細胞介素10 (IL-10)分泌量的控制不同，Cyt1可促進CD4+T細胞增殖，降低CD8+細胞毒性和IL-2 的產生，抑制炎癥反應，而Cyt2 增加CD8+細胞毒性并降低IL-10 的產生，從而促進炎癥反應，Cyt1 的分裂促進T 細胞的活化，而Cyt2 的分裂抑制T 細胞的活化[14-15]。之后的一系列研究最終證明在T 細胞活化過程中CD46 的參與可誘導IL-10 分泌及調節性T 細胞(Tregs)的激活或生成[16-18]。而調節性T細胞對于維持外周免疫耐受和免疫反應的控制起到非常重要，可抑制和控制效應物輔助型T 細胞1(Th1)、輔助型T細胞2 (Th2)和輔助型T細胞17 (Th17)的激活，IL-10則是一種有效的免疫抑制細胞因子，其在自身免疫性腦脊髓炎(EAE)和小鼠多發性硬化(MS)模型中的重要性已得到充分證明[19-21]?？傊?，CD46在適應性免疫系統中起到促進T 細胞活化[12]、調節炎癥[15]和1型調節性T細胞(Tr1)分化[17]，以及影響T細胞形態[13]和極性[11]的作用。雖然目前沒有跡象表明CD46介導的信號直接影響B細胞增殖、存活或抗體產生[22]，但已有研究表明CD46激活的T細胞對B細胞的影響，CD46可通過與調節性T細胞接觸及IL-10的產生來促進B細胞產生抗體[22]。

1.2.2 病原體磁鐵CD46 是某些病原體的受體。CD46廣泛表達于各類細胞及相對較高水平的表達模式很好的解釋了某些病原體可利用CD46作為受體的原因。這些病原體可能利用CD46作為一個或多個補體調節活動、信號傳遞能力或內在化機制[23]。目前發現9種人類特異性病原體以CD46為受體，分別包括4種病毒(麻疹病毒、B、D組腺病毒和6型皰疹病毒)和5 種細菌(淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、化膿性鏈球菌、大腸埃希菌和核梭桿菌)。其中研究最廣泛的是麻疹病毒和CD46之間的相互作用[6，24]。麻疹病毒血凝素附著在CD46結構中的ccps1和ccps2上，引起細胞內部化，改變細胞內處理和抗原呈遞[25-26]。麻疹病毒與CD46結合增加了小鼠巨噬細胞一氧化氮的產生[27]，降低了人巨噬細胞中IL-12的產生[28]，以及改變了非淋巴細胞細胞系中CD46的內化途徑[29]。此外，麻疹病毒的附著可誘導CD46轉換，從而增強細胞對補體介導的溶解的敏感性[30-31]。腺病毒纖維結蛋白同樣附著在CD46結構中的ccps1和ccps2上，而皰疹病毒6型的包膜糖蛋白復合物結合ccps 2和ccps 3[32]。奈瑟菌屬的Ⅳ型菌毛主要針對CD46 結構的ccps3 和ccps4 以及STP 片段。奈瑟菌與CD46相互作用產生鈣通量和CYT-2的酪氨酸磷酸化[33-34]。研究表明，這種磷酸化對奈瑟菌附著和細胞骨架重排至關重要，并且奈瑟菌在感染期間也刺激CD46尾部的蛋白水解裂解[9，35]?？偟膩碚f病原體與CD46的結合可通過誘導CD46下調和補體攻擊敏感性來觸發炎癥反應，從而幫助宿主防御[31]、炎癥細胞因子的產生[36]、抗體類別轉換[37]和自噬[38]。

1.2.3 CD46 與人類自身免疫性疾病補體的激活對病原體具有毀滅性，但同時也可以對自身組織造成類似的損害。補體調節蛋白CD46特性研究揭示了補體和適應性免疫之間的新的和意想不到的聯系，及補體在感染和自身免疫疾病中的作用。CD46變異與炎癥性疾病的關系日益密切，尤其是以小血管血栓形成為特征的炎癥性疾病，特別是非典型溶血性尿毒綜合征(aHUS)[39-43]。CD46基因突變，內皮細胞特異性補體調節缺陷，造成aHUS，表現為溶血性貧血、血小板減少癥和急性腎功能衰竭等癥狀[44-45]。多發性硬化是由于腦和脊髓軸突脫髓鞘導致認知障礙的慢性自身免疫性疾病，而T細胞是誘導慢性炎癥、脫髓鞘和軸突損傷的中心角色[46]。1型調節性T細胞(Tr1)是Treg的一個亞群，其特征是分泌IL-10，這是一種有效的抗炎分子。事實上，CD46有能力根據細胞因子環境將T細胞表型從Th1 轉換為Tr1[18]。多發性硬化癥(MS)患者的Tr1分化途徑存在缺陷，因為約50%的患者在CD46激活后產生IL-10[47-48]。另一項有趣的研究表明，與健康獻血者相比，多發性硬化癥患者的樹突狀細胞在CD46激活后產生的促炎性細胞因子IL-23p19的數量也可能增加。這增加了IL-23 的產生，然后反過來又誘導T 細胞增加IL-17 的產生[49]。類風濕性關節炎主要導致關節軟骨破壞和關節強直的慢性全身性疾病，自動反應效應T細胞調節缺陷，使T細胞在CD46激活后不會“關閉”伽馬干擾素(IFN-g)，因此缺乏IL-10+細胞亞群，產生的IFN-g 比健康人的T 細胞多20 倍。此外，類風濕關節炎患者的IFN-g+/IL-10+T細胞群是非抑制性的，而來自健康獻血者的IFN-g+/IL-10+T細胞群抑制旁觀者T細胞激活[18]。CD46介導的Tr1分化缺陷不僅存在于MS和類風濕關節炎[18]中，在哮喘[50]的患者中也存在。哮喘以氣道阻塞和支氣管痙攣為特征的氣道慢性炎癥性疾病，缺陷效應T 細胞調節：IL-10生成減少[50]。有趣的是，聯合使用地塞米松和CD46共同刺激哮喘患者的T 細胞，可使IL-10 的產生恢復到正常水平，這表明CD46 和糖皮質激素受體通路之間存在功能性串擾[50]。原發性C3 缺乏癥為由于重要免疫細胞功能受損而導致的反復和嚴重感染，C3 基因突變缺少的效應T 細胞誘導和調節，CD46 激活后不產生IL-10和減少IFN-g的產生[51]。除上述疾病外，CD46也與免疫調節性多內分泌疾病腸病X連鎖綜合征相關[52]。

2 hCD46與異種移植物

2.1 hCD46 與心臟移植DIAMOND 等[53]將表達hCD46的豬心臟異位移植到狒狒體內，發現避免了超急性排斥反應(HAR)，心臟存活了23 d。這是首次證明hCD46 在轉基因豬器官中的表達可以保護豬器官免受異種環境中補體激活介導的損傷，同時發現在轉基因豬器官上表達hCD46 可阻止補體的激活。轉基因豬心臟病理沒有檢測到C5b 沉積，也沒有檢測到的膜攻擊復合物(MAC)沉積。ADAMS 等[54]在豬-狒狒心臟異種移植中發現與野生型心臟相比，表達hCD46 的心臟具有更長的存活時間和更少的補體沉積。而且與超急性排斥的野生型心臟相比，表達hCD46 的心臟的組織學顯示MAC 沉積減少。表明hCD46蛋白在豬-靈長類異位心臟移植模型中對超急性排斥具有保護作用。在兔抗人胸腺細胞免疫球蛋白(ATG)和利妥昔單抗誘導，移植前脾切除及術后應用免疫抑制劑的基礎上表達hCD46 的異種心臟移植最高存活了137 d[55]。然而，以抗胸腺細胞球蛋白和aCD20 抗體誘導，用霉酚酸酯和密集劑量的aCD40(2C10R4)抗體維持的GGTA1KO.hCD46.hTBM 豬-靈長類異種心臟移植存活達到945 d[56]。

2.2 hCD46 與肺移植通過基因修飾，異種心臟、腎臟和肝臟的超急性排斥反應和早期移植失敗的發生率顯著降低[57-58]。相比之下，表達人源C 反應蛋白(hCRP)或GGTA1基因敲除(GGTA1KO)的豬肺異種移植在人血或豬-狒模型的體外灌注中仍然容易發生超急性肺排斥反應(HALR)[59-60]。體外實驗證明，hCRP 的額外表達通過抑制補體級聯激活，進一步增強了對異種細胞損傷的保護[61]。WESTALLG 等[62]的研究表明，表達多種基因修飾(hCD55、hCD59) 的GalTKO肺在異種灌注模型中表現出改善和持續的肺功能。Burdorf和Pierson使用hCD46/ GGTA1KO豬肺移植對狒狒進行了維持生命的肺移植。hCD46 的加入對延長移植物存活時間幾乎沒有影響，平均存活時間的中位數為240 min，范圍為0～240 min。然而，BURDORF 等[63]發現與GGTA1KO 肺相比，hCD46/GGTA1KO 肺中位生存時間更長(hCD46/GGTA1KO為171 min，GGTA1KO 為120 min)。而且除了補體激活的顯著下調外，在GGTA1KO 肺中hCD46 的表達降低了血小板和凝血級聯激活、中性粒細胞隔離和組胺釋放[63]。對于hCD46 在異種移植肺的作用，仍需進一步研究。

2.3 hCD46 與肝移植與異種心臟或腎臟移植相比，豬肝異種移植似乎更令人困惑，盡管已經取得了很大進展。關于異種移植肝的研究較少，而對于hCD46 在異種肝移植的研究更少。在異種肝移植研究中反復出現的障礙是因為血小板減少癥的迅速發展，并伴有出血并發癥和凝血障礙。然而由于主要的問題未解決，特別是凝血失調，豬肝異種移植存活率僅限于一個月[64-65]，尤其是血小板大量丟失會導致致命出血[66-67]。目前GGTA1KO 肝異種移植存活時間最長為29 d[67]，而在GGTA1KO 的基礎上表達的hCD46存活了4～7 d[68]。

2.4 hCD46 與胰島移植通過移植替代受損的器官或組織是改善危及生命的疾病的理想方法。對于Ⅰ型糖尿病患者來說，進行胰島移植是較好的醫學治療之一，但同樣面臨著器官資源短缺的困難，而異種胰島移植是解決胰島器官來源短缺的一種潛在方法。事實上，臨床前的模型已經證明豬胰島可以在糖尿病非人靈長類動物中移植、存活并實現葡萄糖穩態[69-72]。在豬-非人靈長類動物的胰腺移植中最大的障礙是靈長類動物對豬胰島的免疫及炎癥反應，可能表現為快速早期移植物排斥反應(即血液介導的即時炎癥反應)或T細胞介導的排斥反應。豬胰島移植成功地逆轉了非人靈長類動物的糖尿病至少100 d[73-74]。然而，通過在豬胰島上表達hCD46 抑制補體激活并不能顯著減少胰島質量的初始損失，而是有效地限制抗體介導的排斥反應。這導致對免疫抑制的需求減少，以保持足夠的胰島質量來長期維持正常血糖[75]。

2.5 hCD46與腎移植CD46作為CRP家族的一員，它是血漿絲氨酸蛋白酶因子Ⅰ介導的C3 和C5 轉化酶亞基C4b和C3b的輔助因子。在本質上，CD46在保護細胞免受補體介導的經典和替代途徑的裂解方面都非常有效[10，76]。VAKNIN-DEMBINSK等[49]首次在活體內證明了表達在豬器官上的人CD46能夠調節補體激活和克服移植到非人靈長類動物體內的超急性排斥反應的能力。有研究表明盡管存在抗體和補體沉積，單個CD46 轉基因可控制未經治療的狒狒超急性腎移植排斥反應[18]。而在GGTA1KO/hCD46豬在狒狒體內的腎臟移植，總是伴隨著消耗性凝血病的早期發展，所有接受者都在16 d 內實施安樂死[77]。非人類靈長類動物(NHP)的豬腎移植存活率最近顯著提高[78]。在2015年之前，豬腎移植在NHP中的最長存活時間是90 d[79]。在2015 年，ADAMS 等[80]實施一例GGTA1KO/hCD46/hCD55/hTBM/hEPCR/hCD39 豬到狒狒的異種腎移植，移植物存活136 d，腎功能良好，肌酐值正常，未出現明顯的排斥癥狀。2019 年，KIM等[81]進行GGTA1KO/hCD55 豬至獼猴異種腎移植，創造了499 d的世界最長生存紀錄。

3 總結

CD46 是人體補體調節蛋白的一員，是一把雙刃劍。CD46可以在先天性免疫及適應性免疫中起到免疫作用，但也能作為一些病原菌的受體引發疾病的發生。它對病原體具有毀滅性，也可對自身組織造成類似的損害。轉基因豬的器官雖是可以解決器官資源短缺的潛在方法，但也面對著異種抗原導致的排斥反應、組織相容性差、凝血功能絮亂、炎癥等問題。hCD46是多基因修飾中的一個，在一定程度上起到增強組織相容性、減輕凝血功能絮亂、抑制炎癥等作用。目前hCD46在異種心臟移植的效果較好，而在異種肝、腎、胰島移植的效果差一些，但在異種移植中起到了一定作用。hCD46 的生化結構本身就是一個復雜調節的來源，產生了許多亞型，其表達受到不同信號的密切調節，如凋亡和細胞激活。在功能上，CD46不僅根據其環境微調T 細胞反應，而且通過其對表達和酶處理的嚴格調節，具有啟動和隨后終止T 細胞反應的能力。hCD46 的復雜性要使其在異種移植中發揮更好的作用，還需要一定的科學研究。