肉鴿圓環病毒、腺病毒及皰疹病毒Ⅰ型混合感染的多重PCR檢測

陳俊紅 何宇 祁宇晨 劉裕鵬 邢光東 王瑩 徐善金 方光遠 戴鼎震

摘要：運用多重PCR同時檢測肉鴿病原（圓環病毒、腺病毒及皰疹病毒Ⅰ型）的方法，分別設計與合成3種病毒基因擴增引物，并提取疑似病鴿的肝臟樣品DNA、進行單一PCR擴增及基因序列測定，結果分別獲得了大小為239、418、618 bp的DNA產物。通過摸索多重PCR反應條件，應用多重PCR同時檢測3種病毒基因片段，同時獲得了鴿皰疹病毒Ⅰ型、鴿圓環病毒及鴿源腺病毒的基因片段。再對疑似混合感染這3種病毒的肝臟樣品進行檢測，發現50%（6/12）樣品存在3種病毒的混合感染、25%（3/12）樣品存在鴿圓環病毒和鴿源腺病毒的混合感染、8.3%（1/12）樣品存在鴿源腺病毒和Ⅰ型鴿皰疹病毒的混合感染、8.3%（1/12）樣品存在鴿圓環病毒和Ⅰ型鴿皰疹病毒的混合感染、8.3%（1/12）樣品未發生任何感染。結果表明，多重PCR可快速檢測鴿皰疹病毒Ⅰ型、鴿圓環病毒及鴿源腺病毒的混合感染，表明運用三重PCR檢測3種病毒混合感染有很好的應用價值。

關鍵詞：鴿圓環病毒;鴿源腺病毒;鴿皰疹病毒Ⅰ型;多重PCR;基因測序

中圖分類號：S858.39?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0167-04

收稿日期：2021-05-08

基金項目：江蘇省“六大人才高峰”D類項目;金陵科技學院“創客虛擬班”立項項目（編號：2017008）。

作者簡介：陳俊紅（1990—），女，安徽宿州人，博士，講師，主要從事預防獸醫、比較醫學及中獸醫學研究。E-mail：chenjunhong@jit.edu.cn。

通信作者：戴鼎震（1964—），男，江蘇興化人，博士，教授，主要從事預防獸醫、中獸藥及中西獸醫結合研究。E-mail：dzdai@163.com。

鴿圓環病毒（PiCV）、鴿源腺病毒（PiAdV）及鴿皰疹病毒Ⅰ型（PiHV-1）是近年來在鴿子體內發現的病毒性病原體。PiCV是一種單股DNA病毒，體型很小、球形、無囊膜，常經口傳染1歲以下鴿子[1-2]。該病毒也可經蛋垂直傳播，并可造成鴿的免疫抑制[3]。目前，尚無任何合適疫苗控制鴿圓環病毒感染。PiAdV引起鴿嘔吐及水樣下痢，傳播迅速，任何年齡的鴿皆可感染。短時間鴿舍內所有鴿均可感染，如繼發大腸桿菌等病原感染，則死亡率很高[4-6]。PiHV-1感染成年鴿感染后多呈潛伏感染[7]，但可向環境排毒。及時注射疫苗也仍不足以阻止感染鴿帶毒。因此，及時檢測并隔離陽性鴿群非常重要。PiAdV、PiHV-1及PiCV通常以混合感染的形式出現，這大大增加了死亡率，給鴿業帶來嚴重危害。由此可見，這3種病原的快速準確檢測非常重要。PCR是一種快速而實用的檢測方法，準確、靈敏、方便。目前，國內外多見于運用單一PCR進行檢測[8-10]，也有針對2種病原的PCR[11-12]，但缺點是檢測成本高、工作量大。如能運用三重PCR同時檢測這3種病原目的基因，就可快速甄別混合感染鴿，及時淘汰病鴿，凈化種群。運用多重PCR對PiAdV、PiHV-1及PiCV混合感染的檢測并不多見，本研究擬分別設計與合成3種病毒基因擴增引物，構建多重PCR反應體系，同時檢測3種病毒，為快速檢疫病原提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗時間：2019年3月5日至2020年5月20日;地點：金陵科學院獸醫微生物實驗室。

1.1.1 病料 來自鎮江句容、南京六合區及浦口鴿場的疑似病鴿;PiCV、PiHV-1及PiAdV的對照陽性樣品均為筆者所在單位鑒定保存。

1.1.2 試劑 DNA提取試劑盒及膠回收試劑盒（廣州基迪奧生物科技有限公司）、DNA marker（康為世紀 CW0636），分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 模板基因分別是：PiAdV的六鄰體蛋白（Hexon）基因來自GenBank中MF576429.1;PiHV-1的多聚酶 polymerase 基因序列來自KJ995972.1）;PiCV Rep蛋白和衣殼蛋白（cap）基因序列來自JX901125.1。利用Primer 5.0軟件設計從保守區篩選3對特異性引物，預計擴增的目的基因大小見表1。引物合成來自南京思普金公司。

1.2.2 DNA的提取 根據試劑盒提取要求進行DNA提取。取疑似病鴿口腔、鼻竇、肝臟膜樣品 10～20 mg，研磨，加緩沖液混合混勻，55 ℃水浴，使組織充分酶解。再加消化液，混勻，于70 ℃水浴維持10 min。然后過柱純化，得到DNA，保存于 -20 ℃ 備用。

1.2.3 單一PCR檢測 采用設計的引物分別用提取的3種病毒模板進行單一PCR檢測，PCR擴增反應。由表2可知，預混液為2×Es Taq MasterMix。每對引物濃度均為10 mmol/L。反應條件：98 ℃預變性5 min;95 ℃ 10 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環;72 ℃延伸5 min，16 ℃ 維持5 min。擴增產物經凝膠電泳，觀察產物大小。

1.2.4 多重PCR檢測 利用上述引物針對PiCV、PiAdV及PiHV-1 模板建立三重PCR擴增體系。由表3可知，反應條件：98 ℃預變性5 min;95 ℃ 15 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 1.5 min，35個循環; 72 ℃延伸5 min，16 ℃ 維持5 min。擴增完成后，2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

1.2.5 PCR產物基因序列測定 按試劑盒程序將產物進行回收、送檢、測序。

1.2.6 臨床樣品多重PCR檢測 采集鎮江、六合及浦口等地鴿場采集場疑似病料，共18份，提純DNA模板，進行三重PCR擴增，統計結果。

2 結果與分析

2.1 單一PCR產物的電泳結果與分析

從3種病毒標準DNA模板擴增出來的基因片段，經瓊脂糖凝膠電泳。由圖1可知，PCR產物擴增結果分別為大小在600～800、400～500、200～300 bp 的單一清晰條帶。表明針對標準陽性模板的引物設計是準確的，與預期欲獲得的616、418、 239 bp 基因片段大小相符。

2.2 多重PCR產物的電泳結果與分析

由圖2可知，通過多重PCR獲得了PiAdV、PiCV及PiHV-1的特異性基因片段，經2%瓊脂糖

凝膠電泳，與標準DNA對照相比發現，3條條帶分別位于600～800、400～500、200～300 bp間，大小均分別與單一PCR所擴增片段大小相對應，表明3對特異性引物混合在一起進行擴增，未出現相互互補現象，它們均擴增出了清晰的DNA條帶，符合預期擴增616、418、239 bp基因片段大小。

2.3 DNA序列測定結果與分析

對3對引物擴增到的DNA產物進行了核酸序列測定，分別為PiAdV，616 bp;PiCV，418 bp;PiHV-1，239 bp。結果證實各自擴增的DNA片段大小的正確性。經過DNA序列比對及編碼蛋白的閱讀框架分析，發現所擴增的目的基因片段核酸序列分別與各自的標準模板基因序列相同，且閱讀框架與所編碼的Hexon蛋白、DNA polymerase及PiCV的Rep與cap蛋白相同，證明所擴增的目的基因正確。

2.4 臨床樣品多重PCR結果與分析

由表4可知，經三重PCR檢測，在總共18份檢測樣品中，PiAdV、PiHV-1及PiAdV檢測呈陽性的分別是5、12、8份，結果與單一PCR相比完全相符合。

由圖3可知，泳道2、5、6、8、9、11均從樣品中擴增到3種病毒基因片段，表明存在這3種病毒混合感染，感染率達50%（6/12）;泳道3、4、7見有2個擴增條帶，大小分別對應于PiAdV及PiCV目的片段大小，反映出樣品存在這2種病毒混合感染，感染率25%（3/12）;泳道10也有2個條帶，大小分別對應PiAdV及PiHV-1目的基因片段，說明發生了這2種病原雙重感染，感染率為8.3%（1/12）;泳道13存在2個條帶，分別對應PiHV-1、PiCV目的片段，說明存在這2種病原感染，占樣品數8.3%（1/12）。泳道12無條帶，判定樣品無感染。結果表明，三重PCR能一次性檢出單一感染、雙重感染及三重感染。

3 討論與小結

PiAdV、PiCV及PiHV-1混合感染不僅僅是單純的3種傳染病，且均參與導致了更嚴重的幼鴿疾病綜合征（YPDS）[3-4，13]，往往引起很高死亡率。因此，同時快速檢測病鴿這3種病毒的感染對于預防控制鴿病具有重要意義。目前，能夠用來檢測這3種病毒的方法有病毒分離與鑒定、單一PCR檢測和病理組織學檢測[14]。但分離鑒定法費時、費力、診斷周期長。病毒可存在于病鴿的口腔、鼻竇、肝臟、食管等部位，病毒分離費時、費力，且分離較為困難，分離率不高，這對于快速診斷、隔離病鴿是不利的。相對來說，PiHV-1分離容易一些，而PiAdV及PiCV的分離培養較為困難。如趙盼盼在野鴿體內分離到了野鴿PiHV，并進行了分析[15]。Hess等通過肝細胞培養出了PiAdV[5]。尚未見PiCV分離的報道，這就限制了對其開展進一步研究。由于這3種病毒均可產生包涵體，因此，可以通過病理切片觀察包涵體。腺病毒感染鴿的肝細胞、小腸絨毛的上皮細胞中可檢查到核內包涵體[5]。Gough等報道了在鴿的法氏囊內發現了圓環病毒樣粒子[1]，但這些檢測方法均需逐個檢測，不適合大量同時檢測。

相比之下，運用PCR檢測就較為快速、準確，加之3種病毒均為DNA類病毒，PCR擴增不需要進行反轉錄，因而更為方便。如Zhang等[7]、余旭平等[9]及薛媚等[10]通過PCR分別檢測到了PiHV-1及PiCV的基因。蔣文明等運用雙重PCR同時檢測到了PiAdV及PiHV-1的基因，總體上體現出PCR快速、準確的特點，但仍不能一次性同時檢測3種病原[11]。

本研究首先使用單一PCR方法檢測PiAdV、PiHV-1及PiCV，通過變性、退火、延伸3個基本反應步驟，進行循環，準確地獲得了PiAdV、PiHV-1及PiCV特異性片段，經電泳獲得了大小不同的條帶。結果表明，此法具有特異性強、靈敏度高、快捷等優點。在此基礎上通過重構反應體系，將3種反應體系合而為一，并優化反應條件，同時成功擴增到到了DNA產物，并通過基因序列測定確認是這3種病毒基因，從而證實多重PCR一次性檢測混合感染不僅快速、靈敏，而且特異性強、成本低。從多重PCR擴增的產物看，DNA條帶清晰可變，大小適中，便于觀察。經過臨床樣品的進一步擴大檢測，還能夠觀察到檢測鴿樣品發生感染的實際狀況（即有的鴿子3種病原同時感染，有的僅感染其中2種）。結果還提示，由于病毒分布全身多個組織器官，為增大擴增成功率，可在多個部位進行取樣，但肝臟樣品必須采集。總之，本試驗三重PCR可同時檢測3種病毒，敏感、準確、快速，且省時省力，適用于檢測種鴿病原混合感染。不過試驗方法還值得進一步優化，如最低濃度試驗、最優反應條件等。此外，還可開展更多病原的基因多重檢測，或者重新設計合成引物進行PCR擴增，以便擴增到病毒不同的亞型基因，從而更精細地進行病原檢測。

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