枯萎病拮抗菌JM-3對草莓連作土壤酶活性及微生物多樣性的影響

姜莉莉 武沖 武海斌 宮慶濤 孫瑞紅

摘要：前期分離得到1株草莓枯萎病高效拮抗菌JM-3，以其制備的固體菌劑處理草莓連作土壤，采用生理生化手段評價其對土壤酶活性的影響，同時采用高通量測序技術分析其對土壤微生物群落結構的調控規律。結果表明，在盛果期，拮抗菌JM-3處理可提高草莓連作土壤的纖維素酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性。土壤微生物多樣性分析發現，拮抗菌JM-3處理的盛果期毛殼屬（Chaetomium）和腐質酶屬（Humicola）相對豐度較高，表明其可在一定程度上提高土壤有益菌的含量。PCA結果表明，在盛果期和末果期，拮抗菌JM-3處理與多菌靈處理之間的距離較近，表明其群落結構相似度較高。

關鍵詞：草莓;連作;拮抗菌;土壤酶;微生物多樣性

中圖分類號： S182;S188+.3;S668.406? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0236-05

收稿日期：2021-03-19

基金項目：山東省自然科學基金（編號：ZR2019PC013）。

作者簡介：姜莉莉（1986—），女，山東煙臺人，博士，助理研究員，主要從事果樹植保研究。E-mail：j--lili@163.com。

通信作者：孫瑞紅，博士，研究員，主要從事果樹植保研究。E-mail：srhruihong@126.com。

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）為薔薇科草莓屬多年生草本植物，其果實飽滿多汁、香氣宜人，深受消費者喜愛，素有“水果皇后”的美譽[1]。近年來，隨著人民生活水平的提高，市場對鮮食草莓的需求量逐漸增大。在規模化生產地區，由于輪作、倒茬困難，重茬普遍，草莓枯萎病等土傳性病害發生日益嚴重[2]。

草莓枯萎病是由半知菌亞門瘤座菌科鐮孢屬尖孢鐮刀菌草莓專化型（Fusarium oxysporum f. sp. fragariae）侵染引起，它從根部侵染草莓維管束組織，阻礙養分物質輸導，導致植株萎蔫死亡[3]。目前，對于該病害的防治仍以化學藥劑為主，而長期頻繁施用化學殺菌劑具有較高的環境生態代價和抗藥性風險[4]。生防菌防治植物土傳病害，無藥劑殘留風險，對環境友好，且能活化土壤，有助于作物健壯栽培[5]，已成為國內外科研人員的研究熱點。筆者前期從山東省泰安市草莓枯萎病發生嚴重的設施草莓根際土壤中分離得到1株高效拮抗菌 JM-3，授權專利號為ZL201810272145.5，它對草莓枯萎病菌的平板對峙抑制率為57.42%，以其制備的固體菌劑對草莓枯萎病的90 d田間防效為80.00%，且可提高草莓果實的糖酸比，有助于提升草莓果實品質，但其修復草莓連作土壤的生態機理尚未進行系統研究。

微生物在土壤生態系統中作用巨大，生防菌的大量投入必將對土壤酶活性、微生物多樣性及相對豐度等指標產生影響[6]。生防菌與土著微生物的相互作用，對其防控效果的發揮也至關重要[7]。本研究通過生理生化手段評價枯萎病拮抗菌JM-3制劑對土壤酶活性的影響;采用高通量測序技術，系統分析該生防菌制劑處理草莓根際不同時間對草莓連作根際土壤微生物群落結構的影響，探索該生防菌緩解草莓連作障礙的作用機制，對推動草莓產業可持續發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗取樣地位于山東省泰安市岱岳區房村鎮三棵樹草莓采摘園（35°58′123″N，117°12′13″E），屬溫帶氣候，全年平均氣溫12.8 ℃，降水量697 mm，日照時數2 527.1 h。土壤為棕壤土，連續種植草莓4年，土傳病害發生較重，土壤養分及理化性質如表1所示。

表1 試驗區土壤理化性質

全氮含量（%）全磷含量（%）全鉀含量（%）堿解氮含量（mg/kg）硝態氮含量（mg/kg）速效磷含量（mg/kg）速效鉀含量（mg/kg）有機質含量（g/kg）pH值

0.1370.0820.64011.1298.4101.1238.916.346.81

1.2 試驗設計

2019年8月27日進行土壤處理，共設3個處理：（1）以黃腐酸鉀、硅藻土等載體制備菌株JM-3菌體濃度為2×108 CFU/g固體制劑，按20 g/株拌土處理;（2）50%多菌靈可濕性粉劑1000倍稀釋液，按20 mL/株灌根處理;（3）空白對照，不做任何處理。每個處理重復3次，每個小區面積50 m2。隨機區組排列，處理間設空白保護行。

移栽3葉1心期章姬草莓幼苗，起壟、覆黑膜栽培，每壟2行，壟高40 cm，壟頂寬60 cm，壟底寬90 cm，壟溝寬20 cm，株距15 cm，定植密度12萬株/hm2，實施常規栽培管理。

1.3 樣品采集

分別于11月27日（初果期）、3月7日（盛果期）和5月7日（末果期）采集土壤。每個處理選取20個點，除去表層土壤后，以鉆土器打取5～15 cm土層土壤樣品，充分混勻。土樣過1 mm孔徑篩子后，分成2份。其中1份以干冰保存，用于高通量測定土壤微生物多樣性;另1份于4 ℃保存，用于測定土壤酶活性。

1.4 樣品測定與分析

1.4.1 土壤酶活性測定 土壤脲酶活性測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，蔗糖酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸法[8]，酸性磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法[9]，纖維素酶活性測定采用蘇州格銳思土壤纖維素酶試劑盒（G0308F）。

1.4.2 土壤微生物多樣性測定 高通量測序分析由北京諾禾致源生物信息科技有限公司代理完成。采用CTAB法提取土壤基因組DNA，以瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和濃度，并稀釋至1 ng/μL。分別采用帶Barcode 的16S V4區515F、806R和18S V4區528F、706R特異性引物進行PCR，擴增產物經電泳檢測，根據濃度等量混樣，以1×TAE 濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化，回收目的條帶。構建文庫，經過Qubit 定量和文庫檢測合格后，使用Thermofisher的Ion S5TMXL進行上機測序。

剪切掉低質量部分reads，拆分出各樣品數據，截去Barcode和引物序列，去除嵌合體序列，得到最終有效數據。利用Uparse軟件（v7.0.1001）進行聚類分析，依據算法原則篩選OTUs代表序列。對OTUs序列進行物種注釋，并分別在各個分類水平統計各樣本的群落組成。以各樣品中數據量最少的為標準進行均一化處理，基于此進行后續的α-多樣性分析和β-多樣性分析。使用Qiime軟件（v1.9.1）計算Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、ACE、Goods-coverage、PD_whole_tree 指數，使用R軟件（v2.15.3）繪制稀釋曲線，并進行 α-多樣性指數組間差異分析。使用R軟件（2.15.3）繪制PCA圖。

1.5 數據處理

采用EXCEL 2010和SPSS 18.0進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌JM-3對草莓連作土壤酶活性的影響

由圖1可知，對于土壤脲酶，在初果期、盛果期和末果期，拮抗菌JM-3處理的酶活性均略高于多菌靈藥劑處理和空白對照。對于纖維素酶，在盛果期，拮抗菌JM-3處理的酶活性遠高于多菌靈處理和空白對照，末果期活性略低。對于酸性磷酸酶，在盛果期和末果期，拮抗菌JM-3處理的酶活性均高于藥劑處理和空白對照。對于蔗糖酶，在初果期和盛果期，拮抗菌JM-3處理的酶活性高于藥劑對照和空白對照。

2.2 拮抗菌JM-3對草莓連作土壤真菌多樣性的影響

由圖2可知，多菌靈處理的初果期曲霉屬（Aspergillus）相對豐度較高，盛果期根霉屬（Rhizopus）相對豐度較高，盛果期和末果期毛殼屬（Chaetomium）相對豐度較高。拮抗菌JM-3處理的初果期新赤殼屬（Neocosmospora）相對豐度較高，盛果期毛殼屬和腐質酶屬（Humicola）相對豐度較高，末果期新赤殼屬和漆斑菌屬（Myrothecium）相對豐度較高。對照區盛果期新赤殼屬和漆斑菌屬相對豐度較高，末果期曲霉屬相對豐度較高。

2.3 拮抗菌JM-3對草莓連作土壤細菌多樣性的影響

由圖3可知，多菌靈處理的初果期酸桿菌（Acidibacter）相對豐度較高，盛果期鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）相對豐度較高。拮抗菌JM-3處理的初果期藍藻細菌（Unidentified_Cyanobacteria）相對豐度比較高，盛果期溶桿菌屬（Lysobacter）相對豐度較高，末果期鞘脂單胞菌屬相對豐度較高。對照區盛果期單胞菌屬（Arenimonas）和溶桿菌屬相對豐度較高，末果期酸桿菌相對豐度較高。

2.4 不同處理草莓連作土壤真菌群落結構的PCA分析

由圖4可見，在初果期，各處理間的真菌群落PCA 距離較遠，其中CK與拮抗菌JM-3和多菌靈處理的距離更遠，表明處理間的真菌群落結構差異較大。在盛果期和末果期， 各處理的真菌群落PCA

距離較近，其中拮抗菌JM-3處理與多菌靈處理之間的真菌群落距離較近，可以推測該拮抗菌對土壤真菌具有一定的抑制作用。

2.5 不同處理草莓連作土壤細菌菌群落結構的PCA分析

由圖5可見，初果期各處理的細菌群落與盛果期和末果期的PCA距離較遠，表明初果期的細菌群落結構與盛果期和末果期差距較大。盛果期和末果期的CK處理細菌PCA距離較近，表明草莓連作土壤在中后期的細菌群落結構變化不大。

3 討論與結論

土壤酶由植物根系分泌和微生物代謝產生，參與土壤生物化學反應過程和養分循環，是土壤中具有催化能力的一類生物活性物質，也是影響土壤微生態環境的重要因素[10]。土壤酶是衡量土壤生態系統變化的敏感指標。生防制劑或化學藥劑的大量投入，必將對土壤酶活性產生影響。土壤脲酶催化酰胺化合物水解， 產生的氨是植物生長所需的重

要氮素來源。酸性磷酸酶催化土壤中的有機磷轉化為植物可直接吸收的無機磷[11]。蔗糖酶又稱轉化酶，參與有機質代謝過程，為植株生長提供能源[12]。纖維素酶可催化降解土壤纖維素，促進土壤能量轉化[13]。劉麗等報道，接種根瘤菌和促生菌，可顯著提高大豆成熟期土壤的脲酶和蔗糖酶活性[14]。范琳娟等報道，以棉隆熏蒸處理草莓重茬土壤，土壤脲酶和磷酸酶活性分別降低201.00%和27.48%，并引起土壤肥力降低[15]。田給林等報道，草莓連作土壤滅菌后施用蚯蚓糞，可提高土壤脲酶活性，是緩解草莓連作土壤滅菌對草莓植株生長發育影響的有效措施[16]。曹丹等報道，生物有機肥可顯著提高草莓連作土壤脲酶、酸性磷酸酶和過氧化氫酶的活性[17]。本研究發現，在盛果期，拮抗菌 JM-3 處理可提高草莓連作土壤的纖維素酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性，在初果期和末果期影響不明顯，推測拮抗菌JM-3可促進草莓連作土壤的能量和有機磷轉化。

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成，促進土壤有機質的分解和養分的吸收、轉化[18]。土壤微生物群落結構失衡是造成草莓連作障礙的主要原因[15]。深入研究拮抗菌JM-3土壤處理后與土著微生物的互作關系，對于揭示該生防菌緩解草莓連作障礙的作用機制、開發新型生防制劑以及保障草莓可持續綠色生產等具有重要科學意義。曹坳程等報道，草莓田多年施用氯化苦熏蒸會導致細菌多樣性顯著下降，而真菌多樣性不受影響[19]。王廷峰等報道，玉米套作及秸稈還田處理后，草莓連作土壤微生物結構由“真菌型”轉變為“細菌型”，增強了抵御病蟲害侵染的能力[20]。馬麗等報道，施用生物炭能夠增加連作草莓根際土壤微生物含量，促進草莓根系生長[21]。陳哲等報道，以敵磺鈉和微生物肥料共同處理草莓連作土壤，可降低真菌多樣性，提高細菌多樣性及有益菌屬的豐度[22]。本研究以拮抗菌JM-3固體制劑處理草莓連作土壤，采用高通量測序分析發現，對于真菌而言，拮抗菌JM-3處理的初果期新赤殼屬（Neocosmospora）相對豐度較高，盛果期毛殼屬（Chaetomium）和腐質酶屬（Humicola）相對豐度較高，末果期新赤殼屬和漆斑菌屬（Myrothecium）相對豐度較高，可見其可在一定程度上提高盛果期草莓連作土壤的有益菌含量。對于細菌而言，拮抗菌JM-3處理的盛果期溶桿菌屬（Lysobacter）相對豐度較高，末果期鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）相對豐度較高。主成分分析（PCA）結果表明，對于真菌，在盛果期和末果期，拮抗菌JM-3處理與多菌靈處理之間的真菌群落距離較近，推測該拮抗菌對土壤真菌具有一定的抑制作用;對于細菌，初果期的細菌群落結構與盛果期和末果期差距較大。盛果期和末果期的空白對照處理細菌群落PCA距離較近，表明草莓連作土壤在中后期的細菌群落結構變化不大。

參考文獻：

[1]鄔 劼，王曉琳，黃潔雪，等. 7種殺菌劑對草莓膠孢炭疽菌和灰霉病病菌的室內毒力測定[J]. 江蘇農業科學，2019，47（20）：129-133.

[2]Suga H，Hirayama Y，Morishima M，et al. Development of PCR primers to identify Fusarium oxysporum f. sp. fragariae[J]. Plant Disease，2013，97（5）：619-625.

[3]顧春波，姜莉莉，王開運，等. 抗戊唑醇草莓枯萎病菌ZY-W的誘導及其生物學特性[J]. 中國農業科學，2010，43（14）：2897-2904.

[4]顧春波，史曉斌，姜莉莉，等. 草莓枯萎病菌對多菌靈的抗性及其抗性菌株生物學特性[J]. 植物保護學報，2010，37（3）：266-272.

[5]馮江鵬，邱莉萍，梁秀燕，等. 草莓膠孢炭疽菌拮抗細菌貝萊斯芽孢桿菌JK3的鑒定及其抗菌活性[J]. 浙江農業學報，2020，32（5）：831-839.

[6]Larkin R P. Impacts of biocontrol products on Rhizoctonia disease of potato and soil microbial communities，and their persistence in soil[J]. Crop Protection，2016，90：96-105.

[7]Paulitz T C. Population dynamics of biocontrol agents and pathogens in soils and rhizospheres[J]. European Journal of Plant Pathology，2000，106：401-413.

[8]張 超，周 旭，張 海，等. 蘋果專用肥對旱地果園土壤酶活性以及微生物多樣性的影響[J]. 生態學雜志，2017，36（12）：3485-3492.

[9]鐘曉蘭，李江濤，李小嘉，等. 模擬氮沉降增加條件下土壤團聚體對酶活性的影響[J]. 生態學報，2015，35（5）：1422-1433.

[10]范琳娟，劉奇志，宋兆欣，等. 氯化苦對重茬草莓土壤生物和非生物因子的影響[J]. 農藥，2017，56（2）：131-134.

[11]范琳娟，劉子榮，徐雪亮，等. 6種殺線劑對重茬山藥土壤微生物數量、酶活性和養分含量的影響[J]. 浙江農業學報，2021，33（3）：506-515.

[12]鐘曉蘭，李江濤，李小嘉，等. 模擬氮沉降增加條件下土壤團聚體對酶活性的影響[J]. 生態學報，2015，35（5）：1422-1433.

[13]汪子微，萬松澤，蔣洪毛，等. 青藏高原不同高寒草地類型土壤酶活性及其影響因子[J]. 植物生態學報，2021，45（5）：528-538.

[14]劉 麗，馬鳴超，姜 昕，等. 根瘤菌與促生菌雙接種對大豆生長和土壤酶活的影響[J]. 植物營養與肥料學報，2015，21（3）：644-654.

[15]范琳娟，劉奇志，宋兆欣，等. 溫室重茬草莓土壤施用棉隆和氯化苦效果評價[J]. 農藥，2017，56（4）：293-296.

[16]田給林，嚴婷婷，畢艷孟，等. 草莓連作土壤滅菌與施用有機肥對根際土壤酚酸及土壤酶活性的影響[J]. 園藝學報，2015，42（10）：2039-2048.

[17]曹 丹，鳳舞劍，白耀博. 不同施肥處理對連作草莓生長及土壤生物學特性的影響[J]. 北方園藝，2020（17）：39-44.

[18]韋小了，何 季，何騰兵，等. 種植年限對刺梨園土壤微生物數量和酶活性的影響[J]. 江蘇農業科學，2019，47（13）：280-284.

[19]曹坳程，方文生，王秋霞，等. 氯化苦的生態毒理效應[J]. 世界農藥，2020，42（10）：32-35，45.

[20]王廷峰，趙密珍，關 玲，等. 玉米套作及秸稈還田對草莓連作土壤養分及微生物區系的影響[J]. 江蘇農業學報，2019，35（6）：1421-1427.

[21]馬 麗，齊紅志，閆 明，等. 生物炭對連作障礙條件下土壤微生物和草莓生長的影響[J]. 江蘇農業科學，2019，47（17）：142-146.

[22]陳 哲，黃 靜，趙 佳，等. 殺菌劑和肥料對連作草莓根際土壤微生物多樣性的影響[J]. 山西農業科學，2019，47（8）：1380-1385，1433.