小麥揚輻麥4號輻射誘變突變體篩選和突變體庫構建

劉建鳳 張容 陳士強 王建華 范德佳 何震天

摘要：人工誘變是選育小麥新品種、創制新種質和挖掘新基因的有力工具之一。以豐產、穩產、廣適的小麥品種揚輻麥4號為材料，通過60Co-γ輻射誘變，對獲得的2 869個M2代穗系進行農藝性狀和生物學性狀表型篩選，結果獲得89個幼苗、葉、莖、穗、生育期等生物學和主要農藝性狀變異的突變體，突變頻率為3.102%。經M3代驗證，共發現22個表型穩定的突變體，其中葉部突變體4個、莖部突變體5個、穗部突變體11個、生育期突變體2個。對M2代中莖部突變體和穗部突變體衍生的M3代株系，收獲后進行考種，數據分析表明，其中8個突變體在穗長、穗粒數、小穗數、不孕小穗數、硬度、千粒質量、粒長、粒寬等性狀上有一個或多個優于對照揚輻麥4號。這些優良突變體可作為新的種質資源為培育小麥新品種提供基礎，此外，構建的突變體庫將有助于開展小麥功能基因組學的研究。

關鍵詞：小麥;輻射誘變;60Co-γ射線;突變體

中圖分類號：S512.103.52?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0088-06

收稿日期：2021-03-01

基金項目：江蘇省農委農業重大新品種創制項目（編號：PZCZ201707）;江蘇里下河地區農業科學研究所科研項目[編號：SJ（17）303];國家重點研發計劃（編號：2016YFDO102101）。

作者簡介：劉建鳳（1968—），女，江蘇興化人，副研究員，主要從事稻麥輻射誘變育種和植保研發的研究。E-mail：yzljfeng@163.com。

通信作者：何震天，研究員，主要從事稻麥輻射誘變育種研究。E-mail：yzhzt@ 126.com。

輻射誘變育種是人工利用χ射線、γ射線、電子束、紫外線、激光、離子注入、混合離子場等物理誘變因素，誘發植物遺傳基因突變，在短時間內獲得多種多樣的、有利用價值的突變體，育成的新品種供生產直接利用，或者在此基礎上培育出新種質資源的育種技術[1]。小麥是世界上生產量最高的糧食作物之一，世界上超過1/3的人口以小麥為主要糧食[2]。我國小麥種植面積和總產量僅次于玉米和水稻，居第3位[3]。我國自輻射誘變技術應用于小麥育種工作以來，不僅創造了豐富的種質資源，還育成了許多小麥品種，如川輻2號、山農輻63、龍輻麥3號、龍輻麥16號、魯麥20、鄭品麥8號、豫麥63、小偃 6號、眾麥2號、鄭六輻、寧麥3號等[4-7]，為我國小麥生產作出了重大貢獻。60Co-γ射線誘變具有輻照條件易于控制、射線波長短、能量高、穿透性好、突變率高等優點，是目前輻射誘變育種中最常用的輻射源[8-9]。通過60Co-γ射線輻射誘變小麥種子，可獲得很多有益變異，如株高突變、熟期提前、育性突變、抗病性增強、品質改良、產量增加等優良性狀或具有特異性狀的突變種質資源[10]。

江蘇里下河地區農業科學研究所自20世紀50年代末期開展小麥輻射誘變育種工作，先后育成了揚麥158及13個揚輻麥系列小麥品種，其中揚麥158在1993—2003年累計種植面積1 000萬hm2以上，獲國家科技進步一等獎[11];揚輻麥4號2008年通過江蘇省審定，2010年獲農作物品種權保護[12]，該品種自審定以來，種植面積一直處在江蘇淮南麥區小麥品種前列，2014年被評為“江蘇好品種”，年推廣面積20萬hm2以上，為農業生產創造了較好的社會經濟效益。

普通小麥是異源六倍體（AABBDD，2n=42），與水稻相比基因組巨大（16 Gb）[13]，可以承受龐大的突變密度。雖然已有一些小麥突變體庫構建的研究報告，但是與龐大的小麥基因組相比，數量有限，還需要構建新的突變體庫來補充，尤其是江蘇省淮南麥區尚未創建適合當地種植的小麥突變體庫。因此，本研究以高產、優質、多抗小麥品種揚輻麥4號為基礎，構建60Co-γ輻射誘變突變體庫，旨在為小麥基因功能研究和新品種選育提供基礎材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

揚輻麥4號是通過輻射誘變寧麥8號/寧麥9號雜交種選育的一個小麥優良品種，該品種為春性，幼苗直立，葉色深綠。株型緊湊，分蘗性強，成穗較高。長芒，白殼，長方型穗，籽粒紅皮，半角質，屬于中筋小麥。具有高產、穩產、高抗小麥黃花葉病、中抗赤霉病、適應性廣等特點[12]。

1.2 試驗方法

1.2.1 輻射處理

2016年10月中旬，在揚州輻照中心采用60Co-γ射線輻照處理小麥揚輻麥4號干種子1 kg，輻射總劑量為300 Gy。

1.2.2 試驗地點

2016年10月30日，處理后的種子密播于江蘇里下河地區農業科學研究所萬?；卦囼炋铮囼灥赝临|為沙壤土，前茬水稻，肥力中等。

1.2.3 突變材料的構建

2016—2017年對M1代做好田間管理，成熟后按主莖單穗收獲4 000個，單穗單脫;于10月種成穗行，M2代群體共2 869個穗系，根據不同時期觀察記載的突變體形態性狀進行篩選，按單株收獲。鑒于M2代同一個穗系的不同單株間仍可能存在變異，所以收獲M2代時，沒有出現明顯分離的穗系，僅收獲1個單株出現明顯分離的穗系，收獲一個最具代表性的單株，同時根據表型剔除重復的單株。2018年秋播時將M2代表型變異材料單株種植成M3代株系，每株種2行，2019年對表型突變體的穩定性進行鑒定。各世代每隔50個試驗材料設置1個對照，對照處理為未輻照的揚輻麥4號。輻照材料各世代均按行長1.50 m、行距0.25 m、株距0.05 m播種，常規田間管理。

1.2.4 表型性狀調查

對60Co-γ射線誘變獲得的M2、M3代材料，全生育期每隔3～5 d田間調查1次，觀察記錄幼苗、葉、莖、穗、生育期、抗病性等表型變化。抽穗期與株高調查方法：在調查抽穗期時，當每個株系中有50%以上麥穗頂部小穗（不算芒）露出葉鞘，或在葉鞘中上部裂開見小穗時的日期確定為該株行的抽穗日期，早熟以早抽穗4 d以上為準，晚熟以晚抽穗4 d以上為準;株高為從基部至主莖頂部生長點之間的距離，矮稈以株高低于對照平均高度15 cm以上為準，高稈以株高高于對照平均高度15 cm以上為準。對M2代獲得的莖部突變體和穗部突變體衍生的M3代株系及對照收獲時每個株系取5株進行考種，分別測定株高、穗長、穗粒數、小穗數、不孕小穗數、硬度、千粒質量、粒長及粒寬等性狀。

1.2.5 籽粒性狀測定

M3代種子的硬度利用小麥硬度測定儀（JYDX100×40）進行測定，千粒質量、粒長、粒寬采用浙江托普云農科技股份公司智能考種分析系統（TPKZ-3）進行考種。

1.2.6 數據處理

對M3代考種的數據采用Excel作次數分布圖和相關分析。

2 結果與分析

2.1 突變體類型和突變頻率

在2 869個M2代穗系中共篩選出89個表型突變穗系，突變頻率為3.102%。其中，幼苗習性突變體3個，突變頻率0.105%;葉部性狀突變體17個，突變頻率為0.593%;莖部性狀突變體26個，突變頻率為0.906%;穗部性狀突變體29個，突變頻率為1.011%;生理性狀突變體5個，突變頻率為0.174%，抗病性狀突變體9個，突變頻率為0.314%（表1）。

2.1.1 幼苗習性突變體

揚輻麥4號在越冬返青期幼苗習性為直立型。在調查的2 869個穗系中有3個穗系為匍匐型，突變頻率為0.105%。經M3代驗證，發現后代分離為匍匐、半匍匐、半直立3種類型。

2.1.2 葉部性狀突變體

在M2代中共觀察到17個穗系的葉片發生了突變，突變頻率為0.593%。

2.1.2.1 葉色突變 共有6種類型：一是黃化葉突變，共3個穗系，整個生育期葉片都呈黃色，但后期的長勢不及對照;二是葉片黃萎，1個穗系，三葉期前葉片呈淡黃色，由于無法進行正常的光合作用，隨著植株的生長逐漸枯萎;三是基部黃葉，2個穗系，這類植株基部的葉片一直是黃色，隨著新葉的出現與伸展，基部葉片仍呈黃色，后期植株的長勢長相與對照揚輻麥4號沒有明顯差別;四是葉片淡綠突變，2個穗系，植株的葉片與對照揚輻麥4號相比呈淡綠色且葉片較薄;五是葉片黃綠相間，1個穗系，整株葉片有黃綠相間的條紋;六是紅綠葉突變，1個穗系，葉片顏色略帶暗紅色，葉尖最明顯。這6種類型的葉色突變經M3代驗證，第1、3、4、5類后代無分離，其他2種類型仍有分離。

2.1.2.2 葉形突變 葉片形態突變體共有2種：一是披葉型突變，3個穗系，整株葉片都下披;二是闊葉型突變，4個穗系，表現為葉片極闊。這2個類型經M3代驗證，突變性狀有部分分離。

2.1.3 莖稈性狀突變

在M2代誘變群體中共發現了26個莖稈性狀相關的突變，突變頻率為0.906%。

2.1.3.1 株高突變 共發現了10個穗系突變體，突變頻率為0.349%。矮稈突變體4個穗系，最矮株 54 cm;高稈突變體6個穗系，最高達120 cm，對照材料揚輻麥4號在突變體庫中平均高84.3 cm（圖1-A）。經M3代驗證，高稈和矮稈后代性狀穩定，對矮稈突變體正在做進一步的等位基因檢測驗證。

2.1.3.2 分蘗突變 分蘗是禾本科的一個重要生物學特征，分蘗數與小麥的產量性狀密切相關，共發現9個突變穗系，突變頻率為0.314%。分蘗突變主要有3種：單蘗、少蘗、多蘗。其中單蘗有2個穗系;少蘗就是僅有2～3個分蘗，4個穗系;多蘗有3個穗系。其中多蘗有2種情況：一種是分蘗期分蘗多，多達30個以上;另一種是幼苗期分蘗少，拔節期小分蘗多，多達27個分蘗以上，但是小分蘗的結實差。經M3代驗證，單蘗、少蘗和多蘗仍有分離，需進一步篩選。

2.1.3.3 莖稈直徑突變 共發現5個突變體，突變頻率為0.174%，其中較對照揚輻麥4號細的穗系有1個，較粗的有4個。經M3代驗證，突變體的性狀穩定。

2.1.3.4 蠟質莖稈 發現有蠟質莖稈的突變體2個，突變頻率0.07%。經M3代驗證，蠟質莖稈性狀穩定遺傳（圖2-G）。

2.1.4 穗部性狀突變

在M2代誘變群體中共觀察到29個穗系為小麥穗部突變，突變頻率為1.011%，其中主要有穗形突變、穗色突變、穗芒突變、籽粒性狀突變。

2.1.4.1 穗形突變 60Co-γ射線輻照處理后穗形變異較明顯，有16個穗系的穗形發生了突變，突變頻率0.558%，變異類型有5種：一是密穗，有4個穗系，穗子短小，穗長在3.2～4.6 cm，穗粒數平均24～34個，但是不孕小穗數比對照揚輻麥4號多，平均有3～6個，這種穗形緊密，幾乎呈球形（圖1-C-g），經M3代驗證，后代的性狀穩定（圖2-A）;二是穗子頂部小穗緊密，下半部正常，共觀察到5個穗系（圖1-C-h～圖1-C-l），經M3代驗證，后代的性狀基本穩定（圖2-B）;三是大長方穗，穗長高達14.1 cm，比對照揚輻麥4號的平均穗長10.9 cm多了3.2 cm，穗粒數最高達78粒，比對照揚輻麥4號的穗粒數45～50 粒多20余粒，共觀察到2個穗系（圖1-B-e～圖1-B-f），經M3代驗證，后代的性狀部分穩定（圖2-C）;四是半截穗，穗子中上部小穗不發育，僅1個穗系，經M3代驗證，性狀有部分分離（圖2-D）;五是寶塔型穗，穗子下大上小呈寶塔狀，共觀察到4個穗系（圖1-B-a至圖1-B-d），經M3代驗證，性狀穩定（圖2-E）。

2.1.4.2 穗色突變 淺綠穗，該突變與對照揚輻麥4號比較，穗子呈淺綠色，僅1個穗系，經M3代驗證，后代性狀穩定。

2.1.4.3 穗芒突變 對照揚輻麥4號為長芒品種，在突變群體中發現1個穗系麥芒較短，突變頻率為0.035%，經M3代驗證，性狀穩定（圖2-F）。

2.1.4.4 籽粒突變 對照揚輻麥4號的籽粒是粉紅色，半角質，千粒質量41 g左右。突變群體中獲得白皮籽粒2個穗系;籽粒比對照揚輻麥4號變得更長的有4個穗系（圖1-D），千粒質量在50 g以上，最高58.2 g，高于對照17 g左右;籽粒與對照比變短變圓的有2個穗系，這個突變體多半生于密穗突變;籽粒全癟的1個穗系;硬度值在70以上的有2個穗系，高于對照（硬度52.8）。經M3代驗證，白皮粒、圓粒、長粒、角質籽粒的變異基本穩定，癟粒仍有分離。本研究獲得了長粒和角質籽粒的突變體，但是結果的可靠性還需多年多點進一步驗證。

2.1.5 生理性狀突變

在M2代中共觀察到5個穗系的生理性狀發生了突變，突變頻率為0.174%。

2.1.5.1 生育期突變 突變群體中共發現4個早熟突變和晚熟突變，突變頻率0.139%，其中早熟突變有1個穗系，其余3個穗系都是晚熟突變。早熟突變在乳熟后期籽粒迅速脫水，葉片失綠，比對照早熟2 d左右;晚熟突變類型在乳熟期開始時葉片仍呈現正常綠色，成熟期拉得較長，最晚延后12 d左右，種子成熟較慢。經M3代驗證，生育期突變穩定，獲得了早熟和晚熟突變體。

2.1.5.2 不育突變 在M2代觀察到不育變異有1個穗系，主要表現為花藥弱小干癟無花粉，穗子輕，不結實。

2.1.6 抗病性狀突變

在M2代誘變群體中共觀察到9個穗系為抗病性突變，突變頻率為0.314%。因試驗田靠近赤霉病鑒定圃，且銹病近幾年發病較嚴重，采用自然發病法來初步篩選抗赤霉病和抗銹病的突變體。對照揚輻麥4號是中抗赤霉病、中感銹病品種，經過M2代的初選和M3代的驗證，有2個穗系由中感銹病誘變為中抗;3個穗系由中抗赤霉病誘變為高抗赤霉病、2個穗系為中感赤霉病;有2個穗系銹病和赤霉病同時都發生了變異。對抗病性突變結果的可靠性，將做進一步的鑒定驗證。

2.2 突變體主要性狀的考種分析

對M2代中26個莖部突變體和29個穗部突變體衍生的131個M3代株系及對照揚輻麥4號各收5株進行考種，分別測定株高、穗長、穗粒數、小穗數、不孕小穗數、硬度、千粒質量以及籽粒的長、寬等指標。結果（圖3）表明，與對照揚輻麥4號相比，穗部突變體株系的株高、穗長、穗粒數、小穗數、不孕小穗數、硬度、千粒質量、粒長、粒寬等9個農藝性狀基本服從正態分布，株高高于對照均值（84.3 cm）的株行占69.5%，低于對照的株行占29.8%;穗長高于對照均值（10.7 cm）的株行占35.1%，低于對照的株行占61.1%;穗粒數高于對照均值（58.1個）的株行占35.9%，低于對照的株行占61.1%;小穗數高于對照均值（20.8個）的株行占26.0%，低于對照的株行占72.5%;不孕小穗數高于對照均值（1.1個）的株行占58.8%，低于對照的株行占38.2%;硬度高于對照均值（52.8）的株行占40.5%，低于對照的株行占58.8%;千粒質量高于對照均值（41.6 g）的株行占46.6%，低于對照的株行占53.4%;籽粒的長高于對照均值（5.73 mm）的株行占64.9%，低于對照的株行占32.8%;籽粒的寬高于對照均值（3.01 mm）的株行占35.1%，低于對照的株行占63.4%。

通過對M3代突變體株系的分離進行鑒定，獲得了表型性狀穩定株系22個，其中葉片突變體4個，莖稈突變體5個，穗部突變體11個，生育期突變體2個，其中8個穗部性狀優良、穩定的突變體，穗長、穗粒數、小穗數、硬度、千粒質量、粒長及粒寬與對照揚輻麥4號相比都有明顯的區別，且有的一個或多個性狀優于對照，這些突變體可以作為新的種質資源。

3 討論與結論

突變體是承載和表達遺傳變異的載體，是研究植物功能基因組學的基礎材料[8]，分析鑒定小麥基因功能目前最直接最有效的途徑是構建小麥飽和的突變體庫，通過突變體分析鑒定基因功能[14]。目前，利用輻射誘變技術已經在擬南芥[15]、花生[16]、水稻[17]、大豆[18]等植物中構建了突變體庫，并在功能基因組學研究中發揮了重要作用。前人在普通小麥研究中獲得了多個典型的突變體，Mago等利用60Co-γ射線處理小麥，獲得了小麥感稈銹病突變體[19];郎淑平等通過60Co-γ輻射小麥品種揚麥158，獲得了高產、低植酸的小麥突變體[20];王停停等利用60Co-γ射線輻射小麥品種鄭麥9023，獲得強筋小麥突變體[21];張從宇等利用60Co-γ射線輻照小麥品種皖麥50，獲得高分子量谷蛋白亞基（HMW-GS）突變體[22];孫光祖等利用60Co-γ射線照射小麥品種新克旱9，獲得抗赤霉病突變體[23]。因此，60Co-γ射線是構建小麥突變體的重要手段。

本研究通過60Co-γ射線輻照誘變構建了揚輻麥4號突變體庫。從該庫M2代中篩選到89個表型變異明顯的突變體，突變頻率為3.102%，這些突變體包括莖稈、穗部、生育期等在內的6個類型，不同類型出現的頻率為0.105%～1.011%，通過M3代的鑒定篩選，獲得了22個具有明顯遺傳研究和育種價值的突變體株系。M2代主要農藝性狀變異分析表明，60Co-γ射線誘變揚輻麥4號能引起農藝性狀的廣泛變異，有利于創造、篩選出特殊類型種質資源。M3代考種分析表明，株高、穗長、穗粒數、小穗數、不孕小穗數、硬度、千粒質量、粒長、粒寬等指標的變異率較大，易于品種和品質的改良。農藝性狀間變異的程度存在差異，變異頻率有大也有小，這說明小麥各農藝性狀對60Co-γ射線的敏感度不同。由此可見，在短時間內可以根據需要篩選多種有利用價值的突變體，以供直接生產利用或者以此為基礎培育出新的種質資源[1]。

對M2代和M3代突變體表型鑒定表明，揚輻麥4號突變體庫突變頻率高，突變類型豐富，易獲得一些具有優良農藝性狀的突變體，如大長穗、大粒、矮稈、抗病、早熟、硬度高等突變體，這將成為小麥高產、抗病、優質等要素研究很好的切入點。這些優良性狀源于人工誘變，控制這些優良性狀的基因與來自自然變異的基因通常是有差異的，因此是一種新的優良基因源，可作為優異的種質資源用于小麥育種。隨著小麥分子育種研究的深入，控制突變體庫中的株高、生育期、穗形、硬度等突變體進行相關基因的定位與挖掘，為優良基因在小麥育種中的應用提供理論和實踐基礎。

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