耐（抗）柑橘黃龍病種質材料的評價研究*

武曉曉，婁兵海，唐 艷，陳傳武，劉 萍，章慧璇，范七君，黃俊源，門友均，鄧崇嶺

（1 廣西特色作物研究院，廣西柑橘育種與栽培工程技術研究中心，桂林541004）（2 廣西師范大學生命科學學院）

柑橘黃龍病是一種世界性的柑橘毀滅性病害，主要通過柑橘木虱、嫁接、帶病的苗木傳播，也可以通過菟絲子傳播，每年對我國柑橘產業造成的經濟損失有數十億元。柑橘黃龍病不但造成很大的經濟損失，且其防治也非常困難，目前，只能說是可防可控，而無法根治[1-3]。眾多科研院所經十幾年研究，仍未搞清楚其致病機理，主要障礙在于病菌不能培養和缺少抗病品種[4-8]。

廣西的柑橘黃龍病出現于20 世紀30 年代，其發生歷史已近1個世紀，廣西中部和南部20 世紀七八十年代發展起來的柑橘園幾乎全部毀于柑橘黃龍病，面積超過6.67 萬hm2，直接經濟損失超過100 億元[9-10]。由于柑橘黃龍病在廣西發生歷史久，發生面廣，損失慘重，感病樹基數大，因此，從中獲得耐柑橘黃龍病種質材料是有可能的。

課題組在2012—2020 年調查中發現，在少數果園有個別柑橘植株存活30～50 年，生長結果正常，而周邊柑橘植株被黃龍病毀掉2～3 代；還有已感染黃龍病10～20 年的柑橘樹，個別枝條生長結果正常，表明在田間可能也存在耐黃龍病的柑橘植株變異資源，這些變異資源是解析致病機理、尋找抗病基因[10-12]的寶貴資源。因此，篩選出對柑橘黃龍病具有耐性的柑橘種質材料，并在生產上推廣應用，是解決柑橘黃龍病危害最根本的途徑，對柑橘產業健康可持續發展具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為廣西壯族自治區范圍內的野生柑橘種質資源和疑似耐（抗）柑橘黃龍病柑橘種質材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質材料收集、選種及鑒定方法

2012—2020 年，在廣西壯族自治區范圍內對野生柑橘種質資源和田間疑似耐（抗）柑橘黃龍病的種質材料進行選種和收集，選種及收集時期為整個柑橘生長季，重點在秋、冬季柑橘黃龍病病癥表現期。

1.2.2 疑似耐（抗）柑橘黃龍病柑橘種質材料的保存

課題組對篩選出的疑似耐（抗）柑橘黃龍病柑橘種質材料，通過嫁接的方式進行擴繁，種植在塑料桶里進行保存，建立耐（抗）柑橘黃龍病柑橘種質材料保存圃。

1.2.3 疑似耐（抗）柑橘黃龍病柑橘種質材料的高接染毒鑒定法

（1）高接。在果園中選取已經感染黃龍病的柑橘樹，進行定性PCR 檢測加以確定。高接方法主要為春接，春接時間為2—4 月，高接方式為單芽切接，在高接樹上選取直徑0.5 cm 以上的枝條，從樹皮平滑處剪斷，在枝條斷面下方沿皮層與木質部交界處向下縱切1 刀，露出形成層，切面要短于接穗芽，然后從待鑒定的種質材料的枝條上切取單芽，再插入中間砧枝條切口上，對準形成層并用嫁接膜綁縛。

（2）田間癥狀觀察。高接4個月后，根據待鑒定的種質材料抽出的枝梢的癥狀來進行診斷：枝梢生長良好、無黃梢、無斑駁型黃化葉片或僅有輕微葉片黃化癥狀，則初步判定該種質材料對柑橘黃龍病具有耐性；枝梢生長較弱、黃梢嚴重、葉片斑駁型黃化癥狀明顯，則初步判定該種質材料對柑橘黃龍病不具有耐性。

（3）實時熒光定量PCR 檢測。采集高接成活且初步判定為耐柑橘黃龍病種質材料的葉片，采用改良CTAB 法[13]提取葉脈DNA，得到待測樣品的DNA 模板；從健康柑橘樹的葉脈中提取DNA，作為陰性對照；從柑橘黃龍病樹的葉脈中提取DNA，作為陽性對照；參照Li 等[14]報道的方法進行實時熒光定量PCR 擴增，繪制標準曲線，并建立標準曲線方程，計算病原菌含量。

2 結果與分析

2.1 疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質材料的收集

本研究共收集疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質材料177 份，其中野生柑橘資源19 份（表1）；田間疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質材料158 份（表2），包括‘砂糖橘’25 份、‘沙田柚’29 份、椪柑65份、橙類19 份、‘桂橘一號’5 份、溫州蜜柑10份、‘蜜廣橘’2 份、‘南豐蜜橘’1 份及其他柑橘材料2 份。

2.2 疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質材料的PCR 檢測

對收集到的177 份疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質材料進行PCR 檢測，如表1、表2 所示，檢測結果均為陰性，表明這些單株（材料）均未感染黃龍病菌。

表1 野生柑橘種質材料收集情況及檢測結果

續表2

2.3 疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質材料的保存

對篩選出的177 份疑似耐病材料通過嫁接的方式進行擴繁，種植在塑料桶內進行保存，建立耐（抗）柑橘黃龍病種質材料保存圃1個（圖1），可以滿足后續高接鑒定以及其他相關試驗的需要。

圖1 疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質材料保存圃

2.4 疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質材料的鑒定

2.4.1 田間癥狀觀察

分別于2018 年3 月和2019 年3 月對收集、保存的疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質材料進行高接染毒鑒定（圖2），高接成活4個月后田間黃龍病典型斑駁型葉片黃化癥狀明顯（圖3），對待鑒定材料進行黃龍病田間癥狀觀察和統計，經觀察發現部分材料沒有表現黃龍病癥狀，與其他材料相比表現出了耐病性。

圖2 高接染毒鑒定試驗

圖3 田間黃龍病葉片黃化癥狀

2.4.2 黃龍病PCR 檢測

在觀察待鑒定材料田間癥狀的同時采集樣品，進行定性/定量PCR 檢測，結果表明部分材料感染黃龍病（檢測結果為陽性）時間較晚，例如陽性對照在高接5個月后（2019 年8 月）檢測到已感染黃龍病，KH-9、KHY-2 在高接8個月后（2019 年11月）才檢測到，GCC-8 甚至在高接11個月后（2020年2 月）才檢測到（表3）。

表3 部分種質材料不同時期定性PCR 檢測結果

感染黃龍病后，對待鑒定材料和陽性對照進行黃龍病菌定量檢測，結果顯示KHY-2 植株內的黃龍病菌平均含量為123 520.0個細胞/μg DNA，而陽性對照植株內的黃龍病菌平均含量為3 623 351.0個細胞/μg DNA，KHY-2 中的黃龍病菌含量始終明顯低于陽性對照（圖4）。

圖4 KHY-2 種質材料不同時期黃龍病菌含量

經過2 年的試驗研究，共篩選出16 份耐柑橘黃龍病的種質材料，其中包括野生柑橘材料4 份、田間耐病材料12 份（表4）。

表4 耐柑橘黃龍病的種質材料

3 討論與結論

從1919 年黃龍病首次被報道至今，關于柑橘和柑橘近緣種對黃龍病的抗性或耐受性的報道屢見不鮮。Vand 等[15]通過嫁接試驗鑒定了15個柑橘品種對黃龍病的耐病能力，依據表現出的癥狀可以將它們分為5 組：重癥組、中癥組、輕癥組、耐病組和抗病組。Stover 等[16]對受黃龍病嚴重影響的佛羅里達州的主要商業化柑橘品種進行了耐病評價。其中‘Temple’表現出的HLB 癥狀最輕，而‘默科特’和‘米尼奧拉’的癥狀最明顯。‘Sugar Belle’橘和‘Bearss’檸檬與其他品種相比對黃龍病具有顯著的耐病能力[17]。滕彩玲等[18]研究發現，‘馬蜂柑’具有較強耐病性，且其作為中間砧亦可顯著延緩甜橙的發病時間。枳與‘印度野橘’雜交后代‘US-897’接種黃龍病菌后沒有明顯感病癥狀，果實生長正常，樹體生長幾乎不受影響[19]。以上研究都表明，不同的柑橘品種對黃龍病表現的耐病性存在很大的差異。

本研究通過大田株選的方法，對廣西壯族自治區內的疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質材料進行選種、收集和保存，共收集和保存疑似耐（抗）柑橘黃龍病材料177 份，其中野生柑橘材料19 份，田間疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質材料158 份，建立耐（抗）柑橘黃龍病種質材料保存圃1個，并通過高接染毒法對這些材料進行鑒定，結合田間黃龍病癥狀觀察與定性/定量PCR 檢測結果，共篩選出16 份對柑橘黃龍病表現耐性的種質材料，其中野生資源4 份，田間耐病材料12 份。耐柑橘黃龍病材料的具體表現為：①與同時期高接染毒的材料相比，感染黃龍病的時間較晚，即檢測到黃龍病菌的時間較晚；②感染黃龍病后，植株表現較為正常，黃龍病癥狀不明顯；③感染黃龍病后，經過定量PCR 檢測顯示，植株體內黃龍病菌含量顯著低于其他材料。本研究采用高接染毒鑒定法對疑似耐（抗）柑橘黃龍病種質材料開展黃龍病的耐性鑒定和評價工作，為柑橘的抗病育種奠定了理論和實際基礎。