高產(chǎn)漆酶菌株的篩選、鑒定和固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

李彩聯(lián) 郭艷麗 張鐵鷹 王麗華 高愛琴

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，呼和浩特 010018)

能量飼料資源短缺限制了我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)平穩(wěn)發(fā)展[1-2]。秸稈等農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物和麩皮等糧食加工副產(chǎn)品中均含有豐富的纖維素和半纖維素，具有較強(qiáng)供能潛質(zhì)。若能將其高效水解利用，對(duì)緩解能量飼料供需矛盾具有重要意義。不僅纖維素本身結(jié)晶結(jié)構(gòu)影響了纖維水解酶的水解效率，同時(shí)木質(zhì)素對(duì)纖維素的包埋作用阻礙了纖維水解酶與之結(jié)合，進(jìn)一步增加了高纖維飼料利用難度[3-4]。因此，消除纖維類飼料中木質(zhì)素是高效利用纖維的主要環(huán)節(jié)之一。與此同時(shí)，木質(zhì)素也是玉米、大豆等籽實(shí)植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的成分，降解其中的木質(zhì)素成分、破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、快速釋放胞內(nèi)養(yǎng)分，可以提高能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率。

木腐真菌通過菌絲或菌絲體在木材內(nèi)蔓延，菌絲頂端可分泌漆酶等氧化酶來氧化破壞木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致木材腐朽[5]。漆酶是一種含銅多酚氧化酶[6-7]，廣泛分布于高等植物[8]、真菌[9-10]和細(xì)菌中[11-12]，通過攻擊木質(zhì)素中酚類化合物來實(shí)現(xiàn)對(duì)木質(zhì)素的降解[13-15]。漆酶對(duì)破壞植物性飼料中木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，提高飼料利用率具有重要意義[16-18]。目前，產(chǎn)漆酶木腐真菌主要包括白腐菌、褐腐菌和軟腐菌[19]。其中，白腐菌降解木質(zhì)素的能力最強(qiáng)[20-22]，常見白腐菌主要包括雜色云芝、血紅密孔菌、變色栓菌、黃孢原毛平革菌等[23]。這些真菌在自然環(huán)境條件下通常生長(zhǎng)速度慢，產(chǎn)漆酶活性也普遍較低[24-25]，無法滿足實(shí)際生產(chǎn)需求。因此，本研究擬通過對(duì)多株木腐菌進(jìn)行平板顯色篩選，獲得高產(chǎn)漆酶菌株，并采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶條件進(jìn)行優(yōu)化，提高其產(chǎn)酶活性，以期達(dá)到可用于改善飼料利用率的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

試驗(yàn)共選擇33株白腐菌和褐腐菌，均購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂，1 L去離子水。

愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基：在PDA培養(yǎng)基中加入質(zhì)量體積比為0.04%的愈創(chuàng)木酚。

種子培養(yǎng)基：麩皮1%，磷酸二氫鉀0.3%。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮10 g，磷酸二氫鉀0.5%，初始含水量50%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化及傳代

將33株白腐菌和褐腐菌菌株先接種至平面PDA培養(yǎng)基上，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5 d。

1.2.2 菌株初篩

將純化后的33株白腐菌和褐腐菌菌株再次接種至愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)72 h。愈創(chuàng)木酚是漆酶的特征底物，菌株生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的漆酶會(huì)將愈創(chuàng)木酚氧化成紅棕色，菌株生長(zhǎng)越快，變色圈越大，漆酶活性越高，變色圈越深。因此，根據(jù)紅棕色變色圈大小及顏色深淺確定初篩菌株。

1.2.3 菌株復(fù)篩

1.2.3.1 種子液制備

選取平面PDA培養(yǎng)基上干凈菌絲塊，放入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)96 h。

1.2.3.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，種子液接種量為10%，30 ℃恒溫培養(yǎng)不同時(shí)間，測(cè)定漆酶活性進(jìn)行復(fù)篩。不同菌株發(fā)酵時(shí)間根據(jù)菌種生長(zhǎng)狀態(tài)和菌絲密集程度確定。每個(gè)菌株6個(gè)平行。

1.2.3.3 漆酶活性測(cè)定

準(zhǔn)確稱取0.50 g均質(zhì)固態(tài)發(fā)酵樣品于50 mL離心管中，加入20 mL pH 4.5琥珀酸-氫氧化鈉緩沖液，30 ℃、120 r/min浸提30 min，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定漆酶活性[26-27]。

1.2.4 菌株平板生長(zhǎng)特性

將高活性菌株接種于固體PDA培養(yǎng)基中，30 ℃倒置培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出后，觀察其菌落生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.5 18S rDNA菌種鑒定

根據(jù)Omega-D3390 Fungal DNA Mini Kit試劑盒說明書操作步驟提取復(fù)篩菌株基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增，合成引物，獲得18S rDNA部分序列，進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 發(fā)酵條件對(duì)漆酶活性的影響

分別對(duì)培養(yǎng)基接種量、含水量、通氧量、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定適宜發(fā)酵條件，每個(gè)處理6個(gè)平行。

1.3.1 接種量對(duì)漆酶活性的影響

在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，將種子液接種量分別設(shè)置為1%、5%、10%和20%，30 ℃培養(yǎng)150 h，測(cè)定漆酶活性。

1.3.2 含水量對(duì)漆酶活性的影響

在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基的含水量分別設(shè)置為50%、55%、60%和65%，30 ℃培養(yǎng)150 h，測(cè)定漆酶活性。

1.3.3 通氧量對(duì)產(chǎn)漆酶的影響

在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基的通氧量分別設(shè)置為0、10%、20%和30%，不同比例通氧量用含有不同數(shù)量5 mm透氣孔的封瓶膜封住瓶口，1個(gè)5 mm透氣孔代表10%通氧量，30 ℃培養(yǎng)150 h，測(cè)定漆酶活性。

1.3.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)漆酶的影響

在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基的發(fā)酵時(shí)間分別設(shè)置為90、102、114、126、138、150 h，30 ℃培養(yǎng)，測(cè)定漆酶活性。

1.3.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以培養(yǎng)基接種量、含水量、通氧量和發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素為試驗(yàn)因子，設(shè)計(jì)4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)，選出最優(yōu)條件，每個(gè)處理6個(gè)平行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行單因素差異顯著性方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)漆酶菌初篩

通過愈創(chuàng)木酚-PDA培養(yǎng)基對(duì)33株菌株進(jìn)行培養(yǎng)，各菌株產(chǎn)紅棕色氧化圈情況見圖1。由圖可知，21、24、27、29、30、31號(hào)這6株菌株無漆酶活性，2、3、4、6、7、8、9、10、11、14、15、18、19、25、26、32、33號(hào)這17株菌株的紅棕色氧化圈大且顏色深，故對(duì)這17株菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵與酶活性測(cè)定復(fù)篩。

圖1 高產(chǎn)漆酶菌株初篩Fig.1 Preliminary screening of high-yield laccase strains

2.2 高產(chǎn)漆酶菌株復(fù)篩

在復(fù)篩過程中，32號(hào)菌株發(fā)酵全程無菌絲，可能未生長(zhǎng)，無漆酶活性。由表1可知，17個(gè)復(fù)篩菌株中14號(hào)菌株漆酶活性最高，達(dá)2 029.49 U/g；25號(hào)菌株次之，漆酶活性達(dá)1 865.95 U/g，二者酶活性無顯著差異(P>0.05)；但相比25號(hào)菌株，14號(hào)菌株發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)，故選擇25號(hào)菌株對(duì)其固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。

表1 高產(chǎn)漆酶菌株復(fù)篩Table 1 Re-screening of high-yield laccase strains

2.3 菌株平板生長(zhǎng)特性

25號(hào)菌株平板生長(zhǎng)情況如圖2所示，25號(hào)菌株在PDA平板上生長(zhǎng)較快，5 d可長(zhǎng)滿整個(gè)平板，菌絲潔白，邊緣呈放射狀，菌落具有明顯的同心圓特征(圖2-A)。菌株經(jīng)愈創(chuàng)木酚-PDA顯色，菌落周圍及底部有紅棕色變色圈產(chǎn)生(圖2-B)。

圖2 25號(hào)菌株形態(tài)特征(A)、篩選平板變色圈(B)Fig.2 Morphological characteristic (A)and screening plate color zone (B)of strain 25

2.4 高產(chǎn)漆酶菌株鑒定

通過BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)25號(hào)菌株與靈芝屬GI-16(GanodermalucidumGI-16)序列的相似性高達(dá)99.59%。根據(jù)BLAST比對(duì)結(jié)果，取相似度較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)。對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可知，25號(hào)菌株與靈芝屬菌株最為相似，故確定25號(hào)菌株為靈芝屬。

圖3 基于18S rDNA基因序列對(duì)25號(hào)構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain 25 based on 18S rDNA gene sequence

2.5 產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.5.1 接種量對(duì)漆酶活性的影響

由表2可知，接種量為5%時(shí)漆酶活性最高，為3 111.53 U/g，繼續(xù)增加接種量，漆酶活性逐漸下降，接種量為20%時(shí)漆酶活性顯著低于接種量為5%和10%時(shí)(P<0.05)。這說明過高的接種量不利于該菌分泌漆酶，接種量5%較為適宜。

表2 接種量對(duì)漆酶活性的影響Table 2 Effects of inoculation amount on laccase activity U/g

2.5.2 含水量對(duì)漆酶活性的影響

由表3可知，培養(yǎng)基中漆酶活性隨著含水量增加先升高后降低，含水量為60%時(shí)，漆酶活性最高，為3 111.53 U/g，顯著高于含水量為50%、55%和65%時(shí)(P<0.05)。這說明含水量對(duì)漆酶活性影響較大，含水量過高可影響菌體通氧量，導(dǎo)致漆酶活性降低。

表3 含水量對(duì)漆酶活性的影響Table 3 Effects of water content on laccase activity U/g

2.5.3 通氧量對(duì)漆酶活性的影響

由表4可見，當(dāng)用無孔封瓶膜將瓶口封住(即通氧量為0)時(shí)，菌株生長(zhǎng)受限，漆酶活性受到嚴(yán)重抑制。隨著通氧量增加，漆酶活性呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且通氧量為10%時(shí)的漆酶活性顯著高于其他通氧量(P<0.05)。這說明通氧量是影響固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素，通氧量對(duì)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶有較大影響，過低和過高的通氧量均不利于漆酶分泌。

表4 通氧量對(duì)漆酶活性的影響Table 4 Effects of oxygen content on laccase yield U/g

2.5.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)漆酶活性的影響

由表5可見，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，漆酶活性快速提高，并于發(fā)酵時(shí)間為114 h時(shí)達(dá)到最高，隨后漆酶活性呈逐漸下降趨勢(shì)。這可能是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，漆酶代謝產(chǎn)物積累，反饋抑制了漆酶的分泌，同時(shí)漆酶在此固態(tài)培養(yǎng)基條件下的穩(wěn)定性較差也是導(dǎo)致漆酶活性降低的原因。發(fā)酵時(shí)間為102和114 h時(shí)漆酶活性無顯著差異(P>0.05)，且顯著高于其他發(fā)酵時(shí)間(P<0.05)。故以發(fā)酵時(shí)間114 h為宜。

表5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)漆酶活性的影響Table 5 Effects of fermentation time on laccase activity U/g

2.6 正交試驗(yàn)

對(duì)培養(yǎng)基適宜接種量、含水量、通氧量、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素，進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果見表6。通過正交試驗(yàn)極差(R)分析，培養(yǎng)基含水量對(duì)漆酶活性起決定性作用，發(fā)酵時(shí)間次之，接種量和通氧量對(duì)產(chǎn)漆酶活性影響較小。

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 6 Orthogonal test results and analysis

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

由表7可知，驗(yàn)證結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果一致，最適發(fā)酵條件為接種量5%、含水量62.5%、通氧量15%、發(fā)酵時(shí)間120 h，漆酶活性達(dá)9 522.22 U/g，較優(yōu)化前(3 111.53 U/g)提高了2.06倍。

表7 結(jié)果驗(yàn)證Table 7 Result verification

3 討 論

利用成本低廉的天然有機(jī)原料為基質(zhì)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，具有操作工序簡(jiǎn)單、節(jié)能和供氧更充足等優(yōu)點(diǎn)，較適合于絲狀真菌生長(zhǎng)。固態(tài)發(fā)酵也存在養(yǎng)分流動(dòng)性差、發(fā)酵散熱不良和無法持續(xù)補(bǔ)充養(yǎng)分等缺點(diǎn)。因而，科學(xué)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)對(duì)提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量至關(guān)重要。本研究篩選獲得了1株靈芝屬高產(chǎn)漆酶菌，屬于絲狀真菌類，在自然界中主要生長(zhǎng)在固態(tài)基質(zhì)中。本研究采用固態(tài)發(fā)酵方法模擬其自然生長(zhǎng)狀態(tài)，并優(yōu)化其產(chǎn)漆酶的最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵參數(shù)，以期滿足實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的需要。

接種量大小會(huì)直接影響菌種在培養(yǎng)基中的發(fā)酵速度和產(chǎn)酶效率。本研究結(jié)果顯示，該靈芝屬菌產(chǎn)漆酶適宜接種量為5%，而血紅密孔菌[29]、云芝[30]和變色栓菌[31]產(chǎn)漆酶適宜接種量分別為4%、10%和10%，與本研究結(jié)果存在一定差異。這可能與不同菌種之間的生長(zhǎng)特性以及培養(yǎng)基的組成有關(guān)。高接種量雖然可以縮短菌絲繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，減少雜菌生長(zhǎng)機(jī)會(huì)，但也會(huì)造成養(yǎng)分消耗過快、產(chǎn)熱積累集中或溶氧不足等問題，進(jìn)而影響漆酶合成。過低接種量會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵周期延長(zhǎng)、生產(chǎn)效率降低和雜菌污染等風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果也證明了這一點(diǎn)，當(dāng)接種量高于5%時(shí)，漆酶活性逐漸降低。這說明在本試驗(yàn)條件下過高接種量不利于該菌株分泌漆酶。

固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)內(nèi)適宜含水量既有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的溶解與傳遞，且使基質(zhì)呈松散狀態(tài)，又有助于通氧和散熱。高恩麗[30]和張樹江[32]報(bào)道的云芝固態(tài)發(fā)酵，產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基適宜含水量為65%；江義[33]報(bào)道的栓菌屬FA-J1培養(yǎng)基含水量為70%；而孫珂[31]報(bào)道的變色栓菌漆酶培養(yǎng)基含水量為83.57%。本研究的靈芝屬菌產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基適宜含水量為62.5%。這說明不同菌種固態(tài)發(fā)酵，產(chǎn)漆酶對(duì)培養(yǎng)基中含水量需求不盡一致。此外，本研究以麩皮為主要發(fā)酵基質(zhì)，而高恩麗[30]、孫珂[31]和張樹江[32]以玉米皮與麩皮混合物、玉米皮和茶渣為發(fā)酵基質(zhì)。不同基質(zhì)間持水力不同，也可能是導(dǎo)致菌株間發(fā)酵培養(yǎng)基含水量需求存在差異的原因。

微生物生長(zhǎng)代謝越旺盛，其代謝產(chǎn)物積累越快。好氧生物發(fā)酵過程中，通常以加大通氧量的方式來提高微生物生長(zhǎng)代謝速度。漆酶是一種氧化還原酶，需在氧的參與下才能發(fā)揮其作用。本研究發(fā)現(xiàn)，適度限制試驗(yàn)菌株發(fā)酵過程中的通氧量可增加漆酶產(chǎn)量。通氧量過低時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度明顯減慢，使得菌絲稀疏且纖細(xì)，進(jìn)而影響其漆酶分泌。通氧量過高時(shí)，可能會(huì)加快漆酶氧化木質(zhì)素的速度，氧化產(chǎn)物過度積累，進(jìn)而反饋抑制該菌株漆酶分泌，最終影響漆酶產(chǎn)量。有關(guān)通氧量對(duì)白腐菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響尚未見相關(guān)報(bào)道，具體的影響機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

漆酶是由白腐真菌分泌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)生主要發(fā)生在發(fā)酵中后期[30]。本研究結(jié)果表明，以麩皮為發(fā)酵基質(zhì)，該靈芝屬菌隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，漆酶活性快速升高至峰值后開始下降，發(fā)酵時(shí)間為120 h時(shí)漆酶活性達(dá)到最大。趙杰[29]將血紅密孔菌漆酶基因轉(zhuǎn)進(jìn)里氏木霉后，重組漆酶培養(yǎng)96 h時(shí)活性達(dá)到最大；張樹江[32]以玉米皮和麩皮為原料，發(fā)酵10 d后云芝產(chǎn)漆酶活性達(dá)高峰；Gómez等[34]研究發(fā)現(xiàn)，彩絨革蓋菌以栗子殼和麩皮為基質(zhì)，發(fā)酵12 d時(shí)酶活性達(dá)到最大；Meza等[35]研究的朱紅密孔菌以木糖渣為載體，最高酶活性出現(xiàn)在發(fā)酵14 d；孫榮等[36]研究的雜色云芝發(fā)酵8 d酶活性達(dá)到最大。這些研究結(jié)果表明，不同菌株在不同的培養(yǎng)基中產(chǎn)漆酶適宜發(fā)酵時(shí)間各異，這一方面與菌株本身生長(zhǎng)特性有關(guān)，同時(shí)也可能與培養(yǎng)基組成和為菌株提供產(chǎn)漆酶養(yǎng)分的效率不同而異。另外，在本研究中還發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，漆酶活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這說明漆酶在本發(fā)酵條件下穩(wěn)定性較差，過長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間不利于漆酶高產(chǎn)。因此，適宜的發(fā)酵時(shí)間對(duì)提高漆酶產(chǎn)量和發(fā)酵生產(chǎn)效率至關(guān)重要。

本研究在各發(fā)酵參數(shù)單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)及驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)靈芝屬菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，將各因素最優(yōu)水平進(jìn)行組合后，發(fā)酵所產(chǎn)漆酶活性提高了2.06倍。段珺等[37]采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化長(zhǎng)絨毛栓菌產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件后，漆酶活性提高了1.56倍；甄靜等[38]采用單因素試驗(yàn)優(yōu)化毛栓孔菌XYG422產(chǎn)漆酶條件后，漆酶活性顯著提高；馮波等[39]研究的毛栓菌最優(yōu)產(chǎn)漆酶條件為麩皮2.0%、豆餅粉0.6%、發(fā)酵5 d，此時(shí)漆酶活性達(dá)到最大。以上研究表明，不同方法優(yōu)化不同菌株產(chǎn)漆酶條件存在一定差異，但漆酶活性均有不同幅度地提高，這說明固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)間的相互影響對(duì)提高漆酶活性至關(guān)重要。由此可知，適宜的培養(yǎng)條件更有利于白腐菌高效分泌漆酶。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)篩選獲得了1株靈芝屬高產(chǎn)漆酶菌株。該菌株經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，漆酶活性達(dá)9 522.22 U/g，具有較大應(yīng)用價(jià)值。