體外產氣法比較不同活力屎腸球菌對綿羊瘤胃體外發酵的影響

白天天 崔浩然 蔣辰宇 周小玲，2 郭雪峰，2*

(1.塔里木大學動物科學學院，阿拉爾 843300；2.塔里木大學，新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，阿拉爾 843300)

屎腸球菌(Enterococcusfaecium)為自然界常見的乳酸菌，具有耐高溫、黏附力強、耐胃酸和耐膽鹽等特點[1-2]，由于其在生產加工上的獨特優勢，廣泛應用于畜牧業[3]。當前，屎腸球菌包含在《飼料添加劑品種目錄(2013)》中，被允許在飼料中使用，其特有的安全無毒、無藥殘的特點，使其在飼料應用方面發展迅速。屎腸球菌在單胃動物上有大量研究，添加菌株后發現其具有促進斷奶仔豬腸道發育、增強腸道[4]和提高肉仔雞血清免疫球蛋白G(IgG)含量的作用[5]；促進肉雞脂類和蛋白質的合成代謝[6]；提高感染致病菌的家禽免疫力，調整患病肉雞腸道菌群，減緩鼠傷寒沙門菌對肉雞的損傷[7]。屎腸球菌在反芻動物上的研究包括：減少牦牛腸道內毒素含量與尿素酶活性[8]；提高犢牛平均日增重和料重比，提高泌乳中、后期奶牛瘤胃氨態氮(NH3-N)濃度[9]，降低腹瀉率與死亡率，維持腸道微生物平衡[10]。乳酸菌具有產生乳酸的能力[11]，反芻動物酸中毒與乳酸的產生積累有關[12]，而添加不同活力的屎腸球菌是否對瘤胃產生影響的研究還未見報道。因此，本試驗研究不同活力的屎腸球菌對綿羊瘤胃體外發酵參數的影響，為屎腸球菌在綿羊上的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

屎腸球菌F11.1G為塔里木大學畜牧科技重點實驗室篩選菌株，于中國典型培養物保藏中心保藏(保藏號：M 2020793)。乳酸菌培養使用MRS培養基，pH為6.8[13]。

1.2 試驗動物及飼糧

瘤胃液采集的試驗動物是3只體重為(35±3)kg、安裝瘺管的卡拉庫爾羊。每日09:00和20:00分2次定量飼喂，自由飲水。依據《肉羊飼養標準》配制基礎飼糧，基礎飼糧以玉米和苜蓿顆粒為主要原料，其組成及營養水平見表1，精粗比為60∶40。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.3 試驗設計

本試驗共有4個組，分別為對照組、試驗1組、試驗2組和試驗3組，各組分別添加0、1×1012、1×1011和1×1010CFU/mL的屎腸球菌，基礎飼糧粉碎過40目作為發酵底物，每個組6個重復，共24個注射器，在3、6、12、24、36和48 h讀取產氣量，在24和48 h時進行干物質降解率、pH和NH3-N、揮發性脂肪酸(VFA)濃度的測定。

1.4 人工瘤胃培養液配制

緩沖液采用Menke等[14]方法制備并通入二氧化碳至無色，然后置水浴鍋中保溫備用，晨飼前2 h采集瘤胃液，經4層紗布過濾后與緩沖液以1∶2比例均勻混合制成培養液。

1.5 體外發酵培養及樣品的處理

準確稱取0.2 g發酵底物和屎腸球菌發酵液，置于玻璃注射器(規格為100 mL，可讀刻度為1 mL)頂端，并設置3個重復。在39 ℃恒溫數顯水浴搖床中振蕩培養，吸取30 mL培養液并密封的注射器。在3、6、12、24、36和48 h讀取產氣量，測定24和48 h培養液的pH，離心后取上清液用于NH3-N和VFA濃度測定。

1.6 指標測定

屎腸球菌活力：參照郭雪峰等[15]方法進行檢測；總產氣量：讀取注射器上的刻度進行測定；pH：通過希瑪牌便攜式pH測試筆測定；VFA濃度：參照丁學智等[16]方法，采用GC-2014氣相色譜儀測定；干物質降解率：采用趙超等[17]方法進行測定；NH3-N濃度：采用馮宗慈等[18]方法進行測定。

1.7 數據處理

試驗數據采用SPSS 26.0軟件的one-way ANOVA進行方差分析，差異顯著采用Duncan氏法進行多重比較，用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 添加不同活力屎腸球菌對體外產氣量的影響

由表2可知，各組產氣量在發酵初期增長迅速，呈上升趨勢，各組產氣量顯著高于對照組(P<0.05)，試驗2組和試驗3組差異不顯著(P>0.05)，在發酵3～12 h時，試驗3組的產氣量顯著高于試驗1組(P<0.05)，在發酵24 h時，各試驗組產氣量差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同活力屎腸球菌對體外產氣量的影響Table 2 Effects of different activities of Enterococcus faecium on gas production in vitro

2.2 添加不同活力屎腸球菌對培養液pH的影響

由表3可知，各組pH在整個發酵過程中均呈逐漸下降的趨勢。在發酵24和48 h時，各組pH顯著低于對照組(P<0.05)，試驗3組的pH為最低，各組之間差異不顯著(P>0.05)。試驗3組在發酵48 h時pH最低，為6.35。

表3 不同活力屎腸球菌對培養液pH的影響Table 3 Effects of different activities of Enterococcus faecium on pH of rumen fluid

2.3 添加不同活力屎腸球菌對干物質降解率的影響

由表4可知，各試驗組隨著發酵時間的增長，各組干物質降解率均顯著高于對照組(P<0.05)，各組之間差異顯著(P<0.05)。在發酵24 h時，試驗3組的干物質降解率顯著高于對照組、試驗1組和試驗2組(P<0.05)。在發酵48 h時，試驗3組的干物質降解率顯著高于對照組、試驗1組和試驗2組(P<0.05)。

表4 不同活力屎腸球菌對干物質降解率的影響Table 4 Effects of different activities of Enterococcus faecium on degradation rate of dry matter %

2.4 添加不同活力屎腸球菌對培養液NH3-N濃度的影響

由表5可知，在試驗開始初期，各組NH3-N濃度呈上升趨勢，在發酵24 h時，試驗3組的NH3-N濃度顯著高于對照組(P<0.05)，但與試驗1組和試驗2組差異不顯著(P>0.05)，此時對照組NH3-N濃度是11.67 mg/dL，為最低；在發酵48 h時，各組的NH3-N濃度與對照組相比，差異不顯著(P>0.05)，試驗3組的NH3-N濃度最高，為27.18 mg/dL。

表5 不同活力屎腸球菌對培養液NH3-N濃度的影響Table 5 Effects of different activities of Enterococcus faecium on concentration of NH3-N in rumen fluid mg/dL

2.5 添加不同活力屎腸球菌對培養液VFA濃度的影響

由表6可知，在發酵24 h時，試驗2組的乙酸濃度顯著高于其他各組(P<0.05)，但與對照組差異不顯著(P>0.05)，在發酵48 h時，試驗2組和試驗3組的乙酸濃度顯著高于其他組(P<0.05)；在發酵24 h時，試驗組1的丙酸含量顯著高于對照組和其他各組(P<0.05)，在發酵48 h時，試驗2組丙酸濃度最高，試驗1組和試驗2組顯著高于對照組(P<0.05)；在發酵24 h時，對照組的丁酸濃度最低，試驗2組的丁酸濃度顯著高于對照組和試驗組3(P<0.05)，在發酵48 h時，試驗1組的丁酸濃度顯著高于其他各組(P<0.05)，但與對照組差異不顯著(P>0.05)；在發酵24 h時，試驗1組和試驗2組的總VFA濃度顯著高于對照組(P<0.05)，在發酵48 h時，試驗2組和試驗3組的總VFA濃度顯著高于對照組(P<0.05)；發酵24 h時的試驗2組和發酵48 h時的試驗3組的乙酸/丙酸均高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)。

表6 不同活力屎腸球菌對培養液VFA濃度的影響Table 6 Effects of different activities of Enterococcus faecium on concentration of VFA in rumen fluid

3 討 論

3.1 不同活力屎腸球菌對培養液產氣量的影響

瘤胃微生物消耗可溶性碳水化合物等營養物質產生氣體，主要是代謝產物，如氫氣、二氧化碳、甲烷、低級脂肪酸等[19]，一定程度上反映瘤胃微生物對發酵底物利用的程度。由本試驗結果可見，添加屎腸球菌于瘤胃液體外發酵能顯著促進底物發酵，添加屎腸球菌的各組產氣量顯著高于對照組，0～24 h的產氣量增加迅速，24～48 h時的產氣量呈緩慢上升狀態，其中添加了1×1010CFU/mL屎腸球菌對于體外發酵產氣量的影響最為明顯。推測可能是屎腸球菌進入瘤胃環境中迅速增殖，成為優勢菌種，促進營養物質的消化[20]，促進產氣，而添加活力的大小會影響產氣的多少，但活力過高的屎腸球菌的進入影響了瘤胃微生物的平衡，反而不利于瘤胃內容物的消化。

3.2 不同活力屎腸球菌對培養液pH的影響

瘤胃pH正常范圍維持在6.0～7.5，與瘤胃內營養物質的消化利用息息相關，pH的變化與反芻動物唾液分泌、瘤胃食糜外流速度、瘤胃發酵產酸以及瘤胃上皮對VFA的吸收有關[21-22]。本試驗各組pH在整個發酵過程中呈下降趨勢，添加屎腸球菌可以顯著降低培養液pH，pH的降低可能與屎腸球菌發酵積累乳酸、乙酸等有關[23]，人們發現，瘤胃在pH降至5.0～5.5時，反芻動物常常出現亞臨床酸中毒，而當pH低于5.0時，急性酸中毒則會發生[24]，在本試驗中通過測定確定培養液pH為6.35～7.37，處于瘤胃發酵pH的正常范圍內，此結果說明，添加1×1012、1×1011和1×1010CFU/mL的屎腸球菌，并不會影響瘤胃酸堿內環境守恒。

3.3 不同活力屎腸球菌對培養液干物質降解率的影響

干物質降解率的高低，反映了飼料綜合營養素的可消化特性，是評價不同飼料飼用價值高低的重要指標，越高越有利于動物的生長和生產[25]。在本試驗中，添加屎腸球菌組的干物質降解率均顯著高于對照組，而運用體外產氣法研究屎腸球菌對瘤胃發酵指標的報道較少。根據本試驗結果可以推斷屎腸球菌由于其對腸道菌群的有益作用，而提高了瘤胃對飼料的消化。

3.4 不同活力屎腸球菌對培養液NH3-N濃度的影響

瘤胃消化發酵飼料會產生NH3-N，因此，瘤胃NH3-N反映蛋白質和碳水化合物降解情況，而瘤胃微生物可以利用NH3-N合成菌體蛋白，反映瘤胃微生物與菌體蛋白的合成情況[26]。由本試驗結果顯示，添加屎腸球菌可以促進NH3-N產生，其原因可能是屎腸球菌進入瘤胃后降低pH使得以氨為唯一氮源維持生長的瘤胃細菌受到抑制，致使NH3-N濃度上升[27]。在發酵24 h時，添加1×1010CFU/mL屎腸球菌后培養液的NH3-N濃度顯著提高，這與聶煉等[9]的結果一致。添加1×1010CFU/mL的屎腸球菌更利于瘤胃微生物生長。

3.5 不同活力屎腸球菌對培養液VFA濃度的影響

VFA是動物生長、繁殖與泌乳等基本活動的主要能量來源之一，其濃度變化直接影響反芻動物對營養物質的吸收、利用和生產能力等[28]。乙酸是反芻動物體內脂肪合成的主要前體物，丙酸是唯一能凈生成葡萄糖的VFA，足夠的丙酸能滿足動物對葡萄糖的需要[29]。在本試驗中添加屎腸球菌后發現乙酸濃度有所增加，姜艷美等[30]將屎腸球菌液添加至奶牛飼糧中發現，其瘤胃內乙酸濃度有所提高。劉星[31]接種乳酸菌和酵母菌進行奶牛體外發酵試驗發現乙酸、丙酸和丁酸濃度高于對照組，與本試驗結果一致。添加屎腸球菌組的總VFA濃度高于對照組，可能是因為丙酸濃度高于對照組，此結果證實接種乳酸菌于培養液中進行體外發酵能夠影響VFA的產生量，對VFA的組成產生一定影響。在本試驗中，添加不同活力屎腸球菌后，各組總VFA濃度均升高，說明屎腸球菌可以增強瘤胃發酵功能，促進底物發酵，產生更多的VFA。添加1×1012CFU/mL屎腸球菌組的丙酸濃度高于乙酸濃度，可能與高活力屎腸球菌產酸較多，抑制纖維降解菌和纖維素酶活性[32]，使乙酸產量降低，瘤胃液發酵趨于丙酸發酵型有關[29]，說明添加微生物發酵飼料能改變瘤胃的發酵類型，從而提高了瘤胃發酵的能量利用率。

3.6 添加低活力屎腸球菌對瘤胃體外發酵效果評價

添加高活力的屎腸球菌較低活力屎腸球菌對瘤胃體外發酵效果差的原因可能是在瘤胃發酵液中添加高活力的屎腸球菌，使屎腸球菌在短時間內成為優勢菌，與瘤胃內其他微生物爭奪營養物質并產生乳酸，乳酸迅速產生堆積在發酵液中使內環境pH短時間內快速降低[29,31-33]，盧德勛[34]認為促進纖維素消化的適宜瘤胃液pH范圍為6.0～6.8，pH過低時，纖維分解菌生長就會受到抑制。前人研究發現，瘤胃內微生物的活力與pH的變化具有很大的關系。可能是因為養分的耗盡和瘤胃內環境pH的變化使得瘤胃內屎腸球菌和其他微生物活力降低，反過來又影響瘤胃內NH3-N的利用和干物質降解率。很多研究表明，瘤胃內的pH過高，可能會降低胃蛋白酶活性，以及影響蛋白質的消化率，益生菌會影響瘤胃內pH，從而提高瘤胃蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶的活性[35]。這與試驗3組發酵24 h時的干物質降解率顯著高于對照組一致。乳酸菌還對維持瘤胃的環境產生積極的效應，如產生多種抑菌物質如細菌素，抑制瘤胃內有害的厭氧微生物生長，蛋白質分解減慢，并競爭性抑制有害菌黏附，與腸道黏膜形成穩定的生物屏障[4]，高活力的屎腸球菌進入瘤胃后成為優勢菌群，可能會產生大量細菌素抑制瘤胃微生物的正常生長，導致瘤胃內原有穩態結構被破壞。因此，屎腸球菌在瘤胃液中的添加量要適度。

4 結 論

本試驗結果表明添加屎腸球菌至發酵液中可以提高產氣量、干物質降解率及NH3-N和VFA濃度，降低發酵液pH。通過各項指標分析比較，建議屎腸球菌在綿羊體內的添加活力為1×1010CFU/mL。