青蒿素對奶牛乳腺上皮細胞乳脂合成相關基因表達的影響

侯 昆 李 欣* 沈義媛 詹經緯 牛 慧 熊本海 童津津** 蔣林樹**

(1.北京農學院動物科學技術學院，奶牛營養學北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193)

乳汁分泌是乳腺組織的分泌細胞以血液中的各種營養物質為原料，在細胞中生成乳汁后分泌到腺泡腔中的過程[1]。奶牛乳腺上皮細胞(BMECs)執行泌乳功能，其分泌活性對牛乳生產至關重要[2]。牛乳中基本營養物質的含量受多種因素的影響而發生變化，其中變化最大的成分就是乳脂[3]。據報道，乳脂主要由甘油三酯(TG)、甘油二酯、游離氨基酸、酸磷脂和膽固醇等組成，其含量是鑒定乳品質的重要指標之一[4]。乳脂在牛乳中的含量為3%～5%，但我國的乳脂率水平一直不高，缺乏市場競爭力，乳品質低下已成為制約我國奶業持續健康發展的關鍵問題，故探索提高乳品質的手段和方法迫在眉睫。飼料的有效利用可以提高奶牛的泌乳性能，其中植物提取物飼糧添加劑因其具有較強的抗菌、抗氧化等特性，在動物無抗飼料中替代抗生素和改善動物產品品質等方面具有廣闊的應用前景。青蒿是一年生草本植物，其提取物內含有倍半萜內酯化合物且具有抗氧化、抗炎和提高免疫力等多種生物學功能[5]。本團隊前期研究結果發現，對患有隱性乳房炎的奶牛飼喂青蒿提取物(60 g/d)后，血清中的白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、丙二醛(MDA)含量顯著降低，而超氧化物歧化酶(SOD)活性具有上升的趨勢，證明青蒿素可改善奶牛的產奶性能，增強機體抗氧化能力與免疫功能，同時顯著降低乳汁中體細胞數(SCC)[6-7]。Hunt等[8]研究發現，嗜中性粒細胞在被細菌脂多糖(LPS)激活的情況下，添加青蒿提取物(100～200 μg/mL)可顯著抑制活化的嗜中性粒細胞產生TNF-α，改善機體炎癥反應。此外，青蒿提取物可通過阻斷核轉錄因子-κB(NF-κB)信號轉導途徑，減少炎癥介質的合成和釋放，從而降低體液和細胞免疫反應[9]。由于青蒿提取物中含有的大量酚類和黃酮類化合物，可以誘導γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的轉錄來增加細胞內谷胱甘肽含量，使得細胞抗氧化防御系統更加穩定，進而預防或中和自由基的破壞作用[10-11]。因此，青蒿素作為一種綠色安全抗生素替代物，在提高奶牛生產性能和免疫功能方面，具有重要的意義。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)為一種調節機體能量代謝的重要分子，也是調控脂類代謝的核心物質。據報道，機體中AMPK作為一種糖脂代謝的關鍵酶參與多種信號通路的調節，AMPK激活抑制機體內脂肪酸及膽固醇的合成及代謝，調控脂肪組織的生成[12-13]。固醇調節元件結合蛋白(SREBP)作為核轉錄家族的一員，其中固醇調節元件結合蛋白1-c(SREBP1-c)主要參與機體脂類合成相關酶的激活，可通過靶向基因乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、硬脂酰輔酶A去飽和酶1(SCD1)和脂肪酸合成酶(FASN)等脂肪酸催化酶的表達，調節乳脂的合成[14]；目前已證明，SREBP1-c為調節BMECs乳脂合成的關鍵調節分子，促進葡萄糖的轉運來提高脂肪酸的合成[15]。然而，青蒿提取物對BMECs乳脂的合成是否有影響，尚未見報道。因此，本試驗基于磷脂酰肌醇3-激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-AKT-mTOR)和AMPK-mTOR乳脂合成關鍵信號通路，研究青蒿素對奶牛乳脂合成影響，為青蒿素作為奶牛功能性添加劑提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

試驗主要試劑：青蒿素(CAS：63968-64-9，貨號：361593，純度99%)購于Sigma公司；DMEM/F12培養基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)購自Gibco公司；OMEGA Total RNA Kit Ⅰ試劑盒、cDNA合成試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、細胞裂解液(P0013)、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(P1046)、蛋白上樣緩沖液(P0015)、電泳液(P0014B)、Western轉膜液(P0021B)、凝膠配制試劑盒(P0012A)、洗滌液(P0023C6)、QuickBlockTMWestern封閉液(P0252-500 mL)、考馬斯亮藍快速染液(P0017)、麗春紅染色液(P0022)、轉印濾紙(FFP51)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(FFP32)、熒光檢測試劑(P0018S)、彩色預染蛋白質分子質量標準10～180 ku(P0069)均購于碧云天生物技術有限公司；AMPK(一抗)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)(一抗)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)(一抗)、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(p-AKT)(一抗)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)(一抗)、β-肌動蛋白(β-actin)(一抗)均購于CST公司；mTOR(一抗)購于Proteintech公司；SREBP1-c(一抗)、山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)與山羊抗鼠IgG均購于Santa公司；PI3K(一抗)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)(一抗)均購于北京博奧森公司；細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)(一抗)購于Abcam公司。

試驗主要儀器：實時熒光定量PCR儀(lightcycler 96，瑞士)，DeNovix核酸蛋白定量儀(DS-11，美國)，電泳儀(BIO-RAD，美國)，Mini Trans-Blot Cell(BIO-RAD，美國)，Mini PROTEAN Tetra Cell電泳槽(BIO-RAD，美國)，水平脫色搖床(CX-S800，上海舍巖)，全自動化學發光圖像分析系統(Tanon-4600，北京原平皓)。

1.2 細胞培養與試劑配制

BMECs來自于東北農業大學動物生物化學與分子生物學實驗室的惠贈。在37 ℃水浴鍋內將凍存的細胞解凍，完全融化后用酒精擦拭凍存管轉移到超凈臺中，使用1 mL移液器將細胞取出放入預熱的培養液中并混勻細胞，離心除去上清液。加入12 mL培養液后轉移到培養皿中，于37 ℃、5% CO2條件下培養。當細胞貼壁率達到90%用0.25%胰酶(含0.02% EDTA)對細胞進行純化和傳代，本次試驗采用3～5代細胞。

青蒿素依據試劑說明書進行配制，經二甲基亞砜(DMSO)將其濃度分別配制為10、20、40、60、80、100 μmol/L，用于后續試驗分析。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 BMECs增殖測定

將細胞接種到96孔板中，待細胞貼壁后棄去原培養液，分別加入150 μL含有10、20、40、60、80、100 μmol/L的青蒿素培養基，與細胞共培養1、3、6、9、12、24 h，每孔及每個時間點設立6個重復和6個空白對照。共培養結束后每孔加入噻唑藍(MTT)溶液10 μL，培養箱孵育4 h后每孔加入100 μL Formazan溶解液，混勻，在培養箱中繼續孵育3～4 h后，用全自動酶標儀檢測570 nm波長下每個培養孔的吸光度(OD)值。

1.3.2 BMECs內乳脂合成產物的檢測

細胞內脂滴含量利用油紅O脂肪染色法進行檢測。將BMECs接種于6孔板中培養12 h細胞貼壁后洗滌細胞，每孔加入150 μL含有10、20、40、60、80、100 μmol/L的青蒿素培養基，繼續培養12 h，每孔及時間點設立6個重復和6個空白對照。細胞培養結束后棄去培養液，D’Hanks緩沖液洗滌細胞，使用2 mL 4%多聚甲醛固定30～40 min后棄溶液，用D’Hanks緩沖液洗滌2次，加油紅O工作液1 mL，1 h后舍棄油紅O染液進行細胞洗滌，在顯微鏡下觀察染色情況。

細胞內TG含量檢測依照試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)說明書要求進行檢測。細胞培養結束后棄上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入TG試劑盒中的裂解液0.1 mL處理10 min，收集細胞用于蛋白含量測定。將樣品水浴加熱70 ℃ 10 min，室溫下離心獲取上清液；配制TG的工作液(24 h內有效)；將標準品倍比稀釋為500.0～62.2 μmol/L；將10 μL樣品加入96孔板中，用工作液補足至200 μL，用10 μL蒸餾水調零，在37 ℃ 反應15 min測定各孔OD值，依據標準曲線計算樣品TG含量。

1.3.3 青蒿素對BMECs內乳脂合成相關基因相對表達量的影響

試驗分為對照組(不加青蒿素)和試驗組(加入20、40、60 μmol/L的青蒿素培養)，加藥后每組細胞于6孔板中培養12 h，每組3個重復。BMECs內總RNA按照Trizol法提取，用Nanodrop分光光度計檢測RNA的純度與濃度，OD260/OD280的值在1.8～2.0可用于后續試驗分析。以β-actin作為內參基因，采用實時熒光定量PCR儀，檢測乳脂合成相關基因的相對表達量。測定基因主要包括AMPK、mTOR、PPARγ、SREBP1-c、ACC、SCD1、FASN、PI3K、AKT1和CyclinD1，其引物序列見表1。試驗重復3次，各基因相對表達量用2-△△Ct法計算得出。

表1 基因的引物序列Table 1 Primer sequences of genes

續表1基因GenesGenBank登錄號GenBankaccessionnumber引物序列Primersequences(5′—3′)脂肪酸合成酶FASNNM_001012699.1F:AGCACACGCCTGTAGTATTCGR:CAGCTTCTGCTGGTGGGTAG磷脂酰肌醇3-激酶PI3KNM_174574.1F:CACTGTGGTTGAATTGGGAGAR:CGATTGACAGACAACCATAAGG絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1AKT1NM_173986.2F:TAAAGAAGGAGGTCATCGTGGR:CGGGACAGGTGGAAGAAAA細胞周期蛋白D1CyclinD1NM_001046273.2F:GGACCGCTTCCTGTCGCTR:GCCAGGTTCCACTTGAGTTTGT

1.3.4 青蒿素對BMECs內乳脂合成相關蛋白表達的影響

采用Western-blot檢測乳脂合成相關蛋白的表達量變化。使用PBS清洗細胞樣本，在細胞培養皿中添加細胞裂解液，用細胞刮刀刮取細胞后，將懸液移至新的做好標記的1.5 mL離心管中放在冰上進行充分裂解。4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，將樣品的上清液移入離心管中。使用BCA試劑盒測定蛋白含量，并調整蛋白含量一致。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠，樣品在濃縮膠中為恒壓40 V通過濃縮膠后，改為恒壓100 V，80 min；采用濕轉法進行轉膜，并用麗春紅染色劑染色，觀察轉膜情況，同時用考馬斯亮藍染含有目的蛋白的分離膠，觀察蛋白殘留情況；隨后，對膜進行封閉、一抗孵育和二抗孵育，使用BeyoECL Plus熒光檢測工作液顯色，隨后利用Tanon-4600圖像分析系統的軟件讀取條帶的凈光密度值。所有的目的蛋白的表達量均與β-actin的表達量進行對比。

1.4 數據統計與分析

試驗結果用平均值±標準誤表示。采用SPSS 21.0統計軟件中的one-way ANOVA程序進行單因素方差分析，P<0.05代表差異顯著，P<0.01代表差異極顯著。

2 結 果

2.1 添加不同濃度青蒿素作用不同時間對BMECs活性的影響

利用MTT法檢測不同濃度的青蒿素作用不同時間對BMECs活性的影響，結果如圖1所示。不同濃度的青蒿素作用BMECs 1～6 h后，相對細胞活性與對照組相比差異不顯著(P>0.05)；然而處理9 h后，添加10～80 μmol/L的青蒿素顯著提高了相對細胞活性(P<0.05)；處理12 h后，添加20、40、60 μmol/L的青蒿素極顯著提高了相對細胞活性(P<0.01)，80 μmol/L顯著提高了相對細胞活性(P<0.05)；處理24 h后，20～60 μmol/L極顯著提高了相對細胞活性(P<0.01)，80 μmol/L顯著提高了相對細胞活性(P<0.05)。綜上所述，青蒿素對BMECs作用的適宜濃度為0～80 μmol/L，青蒿素作用12 h發生顯著變化，且與24 h對細胞相對活性作用效果相同；故選擇0～80 μmol/L青蒿素處理細胞12 h進行后續試驗。

2.2 添加不同濃度青蒿素對BMECs乳脂合成的影響

采用油紅O染色法，觀察用不同濃度青蒿素處理BMECs 12 h后細胞內脂滴的含量。結果如圖2-A所示，與對照組相比，在添加20、40、60 μmol/L濃度的青蒿素處理12 h后，細胞內脂滴含量增加，而添加80 μmol/L青蒿素后細胞內脂滴的含量明顯減少。

如圖2-D所示，依據每mg蛋白含量校正TG含量，進一步驗證了油紅O染色的結果；與對照組相比，添加不同濃度青蒿素處理BMECs 12 h后，40 μmol/L的青蒿素極顯著提高了細胞內TG的含量(P<0.01)，20、60 μmol/L的青蒿素顯著提高了細胞中TG的含量(P<0.05)，而80 μmol/L的青蒿素顯著降低了細胞內TG的含量(P<0.05)。因此，選擇青蒿素濃度為20、40和60 μmol/L進行進一步的分析。

與對照組比較，“*”為差異顯著(P<0.05 )；“**”為差異極顯著(P<0.01)。下圖同。Compared with the CON group,“*”mean significant difference (P<0.05);and “**”mean significant difference (P<0.01).The same as below.圖1 不同濃度的青蒿素作用不同時間對BMECs細胞活性的影響Fig.1 Effects of different concentrations of artemisinin at different time on cell viability of BMECs

A:油紅O染色圖，檢測細胞內脂滴含量(400×)；B:甘油三酯含量標準曲線測定；C:細胞內蛋白含量標準曲線測定；D:細胞中甘油三酯含量測定。A:oil red O staining image to detect the content of lipid droplets in cells (400×);B:standard curve determination of triglyceride content;C:standard curve for determination of protein content in cells;D:determination of triglyceride content in cells.圖2 青蒿素對BMECs合成TG的影響Fig.2 Effects of artemisinin on TG synthesis in BMECs

2.3 青蒿素對BMECs內乳脂合成相關基因表達量的影響

如圖3所示，不同濃度青蒿素處理BMECs 12 h后，與對照組相比，添加40 μmol/L的青蒿素顯著提高PI3K基因相對表達量(P<0.05)，而20與60 μmol/L青蒿素的PI3K基因相對表達量無顯著性差異(P>0.05)(圖3-A)；青蒿素添加組AKT1的基因相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)(圖3-B)；40 μmol/L的青蒿素組中CyclinD1的基因相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)(圖3-C)。

PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶 phosphatidylinositol 3-kinase；AKT1：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 serine/threonine protein kinase 1；Cyclin D1：細胞周期蛋白D1。圖3 青蒿素對BMECs中PI3K、AKT1和Cyclin D1基因相對表達量的影響Fig.3 Effects of artemisinin on relative expression levels of PI3K,AKT1 and Cyclin D1 genes in BMECs

由圖4可知，40和60 μmol/L的青蒿素組能量代謝調控因子AMPK的基因相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)；與對照組相比，添加青蒿素可極顯著提高mTOR基因相對表達量(P<0.01)。

AMPK：磷酸腺苷活化蛋白激酶 AMP-activated protein kinase；mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin。圖4 青蒿素對奶牛乳腺上皮細胞AMPK和mTOR基因相對表達量的影響Fig.4 Effects of artemisinin on relative expression levels of AMPK and mTOR genes in BMECs

由圖5可知，添加不同濃度的青蒿素組PPARγ基因相對表達量顯著高于對照組(P<0.05)；添加青蒿素可顯著提高SREBP1-c基因相對表達量(P<0.05)，40 μmol/L的青蒿素極顯著提高SREBP1-c基因相對表達量(P<0.01)；此外，與對照組相比，添加青蒿素后，FASN、ACC和SCD1基因相對表達量均顯著高于對照組(P<0.05)。

PPAR γ：過氧化物酶體增殖物激活受體γ peroxisome proliferators-activated receptors γ；SREBP1-c：膽固醇調節元件結合蛋白1-c sterol regulatory element-binding proteins 1-c；FASN：脂肪酸合成酶 fatty acid synthase；ACC：乙酰輔酶A羧化酶 acetyl-CoA carboxylase；SCD1：硬脂酰輔酶A去飽和酶1 stearoyl-CoA desaturase 1。圖5 青蒿素對BMECs中PPAR γ,SREBP1-c,FASN,ACC和SCD1基因相對表達量的影響Fig.5 Effects of artemisinin on relative expression levels of PPAR γ,SREBP1-c,FASN,ACC and SCD1 genes in BMECs

2.4 青蒿素對BMECs內乳脂合成相關蛋白表達的影響

如圖6-A所示，與對照組相比，20與40 μmol/L青蒿素極顯著提高PI3K蛋白的表達(P<0.01)，而不同濃度的青蒿素均可顯著提高p-PI3K的蛋白表達(P<0.05)，青蒿素可能激活磷酸化的PI3K從而發揮作用。然而，青蒿素對AKT1與p-AKT1蛋白的表達沒有顯著影響(P>0.05)(圖6-B)，青蒿素可能沒有激活PI3K-AKT這條信號通路調控乳脂的合成。

PI3K/p-PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶/磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶 phosphatidylinositol 3-kinase/p-phosphatidylinositol 3-kinase；AKT1/p-AKT1：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1/磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1 serine/threonine protein kinase 1/p-serine/threonine protein kinase 1;β-actin:β-肌動蛋白。圖6 青蒿素對BMECs中PI3K/p-PI3K and AKT1/p-AKT1蛋白表達量的影響Fig.6 Effects of artemisinin on expression levels of PI3K/p-PI3K and AKT1/p-AKT1 proteins in BMECs

如圖7所示，與對照組相比，添加20和40 μmol/L青蒿素均可顯著提高AMPK蛋白的表達量(P<0.05)，而60 μmol/L青蒿素對AMPK蛋白的表達量沒有顯著影響(P>0.05)。如圖8所示，40 μmol/L青蒿素組中mTOR蛋白的表達量極顯著高于對照組(P<0.01)，20 μmol/L青蒿素顯著提高了mTOR蛋白的表達量(P<0.05)，然而60 μmol/L青蒿素對其蛋白的表達量沒有顯著影響(P>0.05)；但是添加青蒿素極顯著提高了p-mTOR蛋白的表達量(P<0.01)。如圖9所示，與對照組相比，添加20、40 μmol/L青蒿素顯著提高了乳脂合成關鍵蛋白PPARγ與SREBP1-c的表達量(P<0.05)，其中60 μmol/L青蒿素只顯著提高了PPARγ蛋白的表達量(P<0.05)；然而，添加青蒿素后，Cyclin D1蛋白表達量并沒有顯著變化(P>0.05)。

AMPK：磷酸腺苷活化蛋白激酶 AMP-activated protein kinase；β-actin:β-肌動蛋白。圖7 青蒿素對BMECs中AMPK蛋白表達量的影響Fig.7 Effects of artemisinin on expression levels of AMPK proteins in BMECs

mTOR：哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 mammalian target of rapamycin；p-mTOR：磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 phosphorylated mammalian target of rapamycin;β-actin:β-肌動蛋白。圖8 青蒿素對BMECs中mTOR/p-mTOR蛋白表達量的影響Fig.8 Effects of artemisinin on expression levels of mTOR/p-mTOR proteins in BMECs

PPAR γ：過氧化物酶體增殖物激活受體γ peroxisome proliferators-activated receptors γ；SREBP1-c：膽固醇調節元件結合蛋白1-c sterol regulatory element-binding proteins 1-c；Cyclin D1：細胞周期蛋白D1;β-actin:β-肌動蛋白。圖9 青蒿素對BMECs中Cyclin D1,PPARγ和SREBP1-c蛋白表達量的影響Fig.9 Effects of artemisinin on expression levels of Cyclin D1,PPARγ and SREBP1-c proteins in BMECs

3 討 論

3.1 添加青蒿素對BMECs增殖與乳脂合成的影響

奶牛的泌乳功能與乳腺上皮細胞的數目以及每個細胞分泌與合成乳汁的能力密切相關[16]。Yang等[17]研究發現，青蒿素及其衍生物可以作用于小鼠T淋巴細胞絲裂原ConA，使其脾臟淋巴細胞增殖，增加機體的免疫能力。與本研究結果一致，不同濃度的青蒿素對BMECs的增殖及活性均具有顯著的影響，由此證明青蒿素促進乳腺的泌乳功能。乳汁中TG的含量在一定程度上決定了奶牛的乳脂率[18-19]。據報道，細胞利用3-磷酸甘油氧化產生的過氧化氫，在相應酶的作用下氧化為有色的產物，進而通過顏色吸光度反映出的TG含量，更直觀地表達了細胞內TG含量的變化情況。本研究中油紅O染色結果，從形態學上解釋了20～60 μmol/L青蒿素對BMECs中脂滴的合成具有顯著的促進作用。因此，青蒿素對BMECs具有促增殖、提高乳脂合成的影響，但其具體的調控乳脂合成的機理有待進一步的研究。

3.2 青蒿素對BMECs內乳脂合成相關基因表達量的影響

PI3K-AKT-mTOR-Cyclin D1信號通路主要調節BMECs增殖與生長[20-21]，此外不僅調控乳蛋白合成相關基因的表達，同時促進SREBP1-c等關鍵信號傳感器的活化，從而促進脂肪合成轉錄因子的表達，提高乳脂合成信號通路的轉導[22]。據報道，PPARγ和SREBP1-c是mTOR信號通路中調節脂肪合成的主要調節劑[23]。當mTOR的激活被抑制時，其下游SREBP1-c表達被抑制，顯著影響脂肪酸合成酶的活性并降低脂肪酸的從頭合成[24]。而且，研究證實SREBP1-c是控制牛乳脂合成轉錄網絡的中心樞紐，乳脂抑制的部分原因是反式-10，順式-12共軛亞油酸可通過抑制SREBP1-c的活性和表達來減少乳脂合成相關基因的表達，從而抑制了乳脂合成[25]。此外，PPARγ屬于配體激活的轉錄因子，它能促進前體脂肪細胞的分化，促進脂肪組織中脂蛋白脂肪酶基因的表達并降低脂肪分解速度；在乳成分合成過程中，PPARγ能增加乳腺上皮細胞內TG的含量，在合成乳脂過程中起關鍵作用[1]。本研究結果發現，添加青蒿素可顯著提高BMECs中乳脂轉錄因子SRBEP1-c和PPARγ的表達，說明青蒿素的添加能增加脂肪酸的從頭合成，進而促進乳脂的合成。

PPARγ可作為脂肪細胞成熟標志基因，其含量顯著影響脂肪細胞的產生[26]；當其表達被抑制時，顯著降低ACC與FASN的基因表達水平，并降低脂肪酸與其互作，減少乳脂的生成[4,27]。ACC和FASN是乳脂從頭合成中2個重要的基因。據報道，FASN和ACC主要在BMECs內作用于乳脂合成的前體物乙酸和β-羥丁酸，FASN會調控37%的脂肪酸從頭合成[28]，乳中約1/2的C16∶0和幾乎全部的C4∶0～C14∶0依賴于乳腺的從頭合成，且FASN會參與其碳鏈延長的整個過程[29]。在脂肪酸合成過程中，ACC參與脂肪酸從頭合成的限速，調控奶牛乳脂的合成速度，其還與合成脂肪酸的轉錄因子SREBP1-c在PPARγ的作用下，影響長鏈脂肪酸的代謝，最終影響乳脂的合成[30-31]。Bionaz等[32]研究發現，奶牛泌乳與乳脂合成時，ACC、PPARγ、FAS、SCD和SREBP1-c等基因表達都明顯上調。本研究結果表明，添加適宜濃度的青蒿素顯著上調了SREBP1-c與PPARγ蛋白的表達，而且PPARγ可能參與調控SREBP1-c基因的表達，通過影響脂肪酸的攝取、轉運、從頭合成和酯化過程從而調控基因的表達。

AMPK作為細胞內一種重要的能量調節因子，可通過感受細胞能量狀態的方式來維持能量平衡，從而為乳蛋白合成提供充足的能量。本研究發現，青蒿素對參與調控機體乳脂代謝的AMPK-mTOR信號通路中關鍵基因FASN、ACC、PPARγ和SCD等均有顯著的促進作用，這可能與青蒿素以調節機體能量代謝的方式上調AMPK，進一步激活mTOR的磷酸化有關。據報道，SCD參與催化不飽和脂肪酸的形成，并在一定程度上參與調控其他脂肪酸代謝基因的表達來調節TG的合成[33]。研究發現，乳脂合成主要以mTOR為主，當其被激活，可以促進脂肪合成，同時抑制脂肪分解及氧化，使得TG含量上升，最終提高乳脂含量[34]。據報道，泌乳小鼠注射mTOR抑制劑3 h后，乳汁中FASN與ACC 2種酶的活性及含量顯著降低，當這2種酶活性下降時抑制了細胞中乳脂的合成[35]。由此可見，青蒿素可通過調控AMPK-mTOR信號通路中乳脂肪合成關鍵基因的轉錄來提高BMECs中乳脂的合成。

4 結 論

青蒿素可通過AMPK-mTOR信號通路調節乳脂合成關鍵調控因子FASN、ACC、PPARγ和SREBP1-c基因和蛋白的表達。當青蒿素濃度為20～60 μmol/L時，對BMECs內脂肪酸從頭合成及長鏈脂肪酸攝取的促進效果較好。