柴胡皂苷對(duì)熱誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗氧化能力和熱休克蛋白基因表達(dá)的影響

胡海濤 孫先枝 黃 峰 王青峰 李晶晶 卓 釗 范彩云 蘇衍菁 程建波**

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，合肥 230036；2.上海城建職業(yè)學(xué)院，上海 201415；3.光明牧業(yè)有限公司，上海 200436)

熱應(yīng)激(HS)一直是困擾我國(guó)奶牛生產(chǎn)的主要問(wèn)題，闡明熱應(yīng)激對(duì)奶牛機(jī)體影響的機(jī)制并找出相應(yīng)的緩解措施是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。研究表明，夏季熱應(yīng)激可能通過(guò)改變奶牛乳腺組織物質(zhì)代謝而影響泌乳量和乳成分[1]。Li等[2]在體外建立奶牛乳腺上皮細(xì)胞(BMECs)熱應(yīng)激模型，運(yùn)用微陣列分析鑒定出2 716個(gè)基因在熱應(yīng)激和正常BMECs中差異表達(dá)，這些差異表達(dá)基因參與調(diào)控細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期和應(yīng)激反應(yīng)等。熱應(yīng)激可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化而使組織和細(xì)胞受到損傷[3-4]。權(quán)素玉等[5]發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激可顯著降低BMECs的存活率，引起細(xì)胞氧化應(yīng)激。胡菡等[6]研究發(fā)現(xiàn)，42 ℃熱處理0.5 h后BMECs中熱休克轉(zhuǎn)錄因子-1(HSF-1)、熱休克蛋白27(HSP27)、熱休克蛋白70(HSP70)mRNA表達(dá)上調(diào)，其中HSP70 mRNA表達(dá)量在短時(shí)間內(nèi)迅速升高。熱應(yīng)激引起的ROS水平升高導(dǎo)致母畜乳腺組織發(fā)生氧化損傷，乳腺功能下降是影響泌乳量的重要因素[7]。因此，如何緩解熱應(yīng)激對(duì)奶牛乳腺造成的氧化應(yīng)激以提高乳腺功能，已成為畜牧工作者急需解決的問(wèn)題。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外關(guān)于中草藥和植物提取物緩解奶牛熱應(yīng)激的報(bào)道眾多。Wang等[8]研究表明，黃芪甲苷預(yù)處理牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)能有效抑制細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高和細(xì)胞凋亡率。在人醫(yī)臨床上，柴胡是一種普遍使用的解熱藥，已被證明具有很好的解熱療效[9]。柴胡中的主要活性成分包括柴胡皂苷類、揮發(fā)油和多糖等[10]，柴胡皂苷及水解后的皂苷元是主要的解熱物質(zhì)[11]。金國(guó)泰等[12]發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷對(duì)大鼠的發(fā)熱反應(yīng)可起到明顯降溫作用。有大量研究發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷能夠發(fā)揮抗炎抗腫瘤活性，可通過(guò)降低過(guò)氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化而有效降低氧化應(yīng)激損傷，提高細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的存活率[13-14]。柴胡皂苷具有較強(qiáng)的抗氧化功能，可顯著抑制ROS和丙二醛(MDA)的產(chǎn)生，增強(qiáng)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶的活性[15]。在本課題組的前期研究中，在飼糧中添加柴胡提取物飼養(yǎng)熱應(yīng)激奶牛，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)劑量的柴胡提取物可降低奶牛直腸溫度，提高熱應(yīng)激奶牛的舒適度，增加奶牛干物質(zhì)采食量，進(jìn)而提高泌乳性能，改善乳品質(zhì)[16-17]。然而，柴胡提取物中是哪種物質(zhì)發(fā)揮有效作用尚不清楚。因此，為進(jìn)一步明確柴胡提取物中具有緩解奶牛熱應(yīng)激的有效物質(zhì)是否為柴胡皂苷a(SSa)和柴胡皂苷d(SSd)及深入探究其作用機(jī)制，本試驗(yàn)建立體外熱應(yīng)激BMECs模型，探討SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs氧化應(yīng)激的保護(hù)作用及對(duì)熱休克蛋白基因表達(dá)的影響，為研制抗氧化及緩解奶牛熱應(yīng)激的飼料添加劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基懸浮BMECs，置于38 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，并以1×104個(gè)/cm2的數(shù)量接種于6孔板中。陰性對(duì)照組：在接種BMECs的6孔板中加入含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，于38 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。陽(yáng)性對(duì)照組：在接種BMECs的6孔板中加入含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，于42 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1、4、8、12和24 h。處理組：BMECs在含0.1、1.0 μmol/L SSa或0.01、0.10 μmol/L SSd的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中38 ℃培養(yǎng)4 h(SSa和SSd作用細(xì)胞時(shí)間)后，42 ℃分別處理1、4、8、12和24 h，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 細(xì)胞中抗氧化物酶活性的測(cè)定

收集細(xì)胞和培養(yǎng)液，采用比色法測(cè)定陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和各處理組BMECs中SOD、GSH-Px、CAT活性和培養(yǎng)液中MDA含量，分別在560、420、405和532 nm處檢測(cè)吸光度(OD)值。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)BMECs中熱休克蛋白基因表達(dá)

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用2-△△Ct法對(duì)BMECs熱休克蛋白基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件中的GLM進(jìn)行分析。采用Duncan氏法進(jìn)行均值多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱誘導(dǎo)對(duì)BMECs抗氧化能力的影響

42 ℃熱誘導(dǎo)對(duì)BMECs中抗氧化酶活性及培養(yǎng)液中MDA含量的影響見(jiàn)表2。在陽(yáng)性對(duì)照組中，BMECs中SOD和GSH-Px活性均顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.05)；BMECs中CAT活性在熱誘導(dǎo)1、4和8 h時(shí)較正常培養(yǎng)條件下的陰性對(duì)照組未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，在熱誘導(dǎo)12和24 h時(shí)則顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.05)。當(dāng)42 ℃培養(yǎng)24 h時(shí)，BMECs培養(yǎng)液中MDA含量急劇上升，顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.05)。

表2 熱誘導(dǎo)對(duì)BMECs中抗氧化酶活性及培養(yǎng)液中MDA含量的影響Table 2 Effects of heat induction on activities of antioxidant enzymes and content of MDA in culture medium

2.2 SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs氧化應(yīng)激的緩解

2.2.1 SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs中SOD、GSH-Px和CAT活性的影響

不同濃度的SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs中SOD活性的影響見(jiàn)表3。與相同熱誘導(dǎo)時(shí)間的陽(yáng)性對(duì)照組相比，在熱誘導(dǎo)1 h時(shí)，0.1、1.0 μmol/L SSa和0.10 μmol/L SSd處理組BMECs中SOD活性顯著提高(P<0.05)；在熱誘導(dǎo)4 h時(shí)，0.1 μmol/L SSa處理組BMECs中SOD活性顯著提高(P<0.05)；在熱誘導(dǎo)8 h時(shí)，0.1 μmol/L SSa對(duì)BMECs中SOD活性無(wú)顯著影響(P>0.05)，但1.0 μmol/L SSa和0.01、0.10 μmol/L SSd可使BMECs中SOD活性顯著降低(P<0.05)；在熱誘導(dǎo)24 h時(shí)，各處理組BMECs中SOD活性均顯著降低(P<0.05)。

表3 不同濃度SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs中SOD活性的影響 Table 3 Effects of different concentrations of SSa and SSd on SOD activity in heat induced BMECs U/mL

不同濃度SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs中GSH-Px活性的影響見(jiàn)表4。與相同熱誘導(dǎo)時(shí)間的陽(yáng)性對(duì)照組相比，在熱誘導(dǎo)1 h時(shí)，1.0 μmol/L SSa和0.01、0.10 μmol/L SSd處理組BMECs中GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)；在熱誘導(dǎo)4 h時(shí)，任意濃度的SSa和SSd均能顯著提高BMECs中GSH-Px活性(P<0.05)；在熱誘導(dǎo)12和24 h時(shí)，0.01 μmol/L SSd組BMECs中GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)，而1.0 μmol/L SSa處理組BMECs中GSH-Px活性則顯著降低(P<0.05)。

表4 不同濃度SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs中GSH-Px活性的影響Table 4 Effects of different concentrations of SSa and SSd on GSH-Px activity in heat induced BMECs U/mL

不同濃度SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs中CAT活性的影響見(jiàn)表5。與相同熱誘導(dǎo)時(shí)間的陽(yáng)性對(duì)照組相比，0.01 μmol/L SSd在熱誘導(dǎo)1 h時(shí)顯著提高了BMECs中CAT活性(P<0.05)；在熱誘導(dǎo)4 h時(shí)，1.0 μmol/L SSa處理組BMECs中CAT活性顯著提高(P<0.05)；在熱誘導(dǎo)8 h時(shí)，0.1 μmol/L SSa和0.01 μmol/L SSd處理組BMECs中CAT活性顯著提高(P<0.05)，而1.0 μmol/L SSa和0.10 μmol/L SSd處理組BMECs中CAT活性則顯著降低(P<0.05)。

表5 不同濃度SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs中CAT活性的影響Table 5 Effects of different concentrations of SSa and SSd on CAT activity in heat induced BMECs U/mL

2.2.2 不同濃度SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs培養(yǎng)液中MDA含量的影響

不同濃度SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs培養(yǎng)液中MDA含量的影響見(jiàn)表6。與相同熱誘導(dǎo)時(shí)間的陽(yáng)性對(duì)照組相比，在熱誘導(dǎo)1和8 h時(shí)，任意濃度的SSa和SSd對(duì)培養(yǎng)液中MDA含量均無(wú)顯著影響(P>0.05)；在熱誘導(dǎo)12 h時(shí)，0.10 μmol/L SSd顯著提高了培養(yǎng)液中MDA含量(P<0.05)；在熱誘導(dǎo)24 h時(shí)，0.01 μmol/L SSd顯著降低了培養(yǎng)液中MDA含量(P<0.05)。

表6 不同濃度SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs培養(yǎng)液中MDA含量的影響 Table 6 Effects of different concentrations of SSa and SSd on MDA content in culture medium of heat induced BMECs mmol/L

2.3 SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs中熱休克蛋白基因表達(dá)的影響

如圖1所示，在42 ℃熱誘導(dǎo)條件下，BMECs中HSF-1和HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量較陰性對(duì)照組在不同熱誘導(dǎo)時(shí)間下均顯著上調(diào)(P<0.05)，并且隨著熱誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在熱誘導(dǎo)4 h后相對(duì)表達(dá)量不再升高，但與陰性對(duì)照組相比仍然顯著上調(diào)(P<0.05)，直至熱誘導(dǎo)24 h時(shí)。在熱誘導(dǎo)8 h時(shí)，0.1 μmol/L SSa處理組BMECs中HSF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量較陽(yáng)性對(duì)照組顯著提高(P<0.05)；任意濃度的SSa和SSd在熱誘導(dǎo)12 h時(shí)對(duì)BMECs中HSF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著影響(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫(xiě)字母表示差異不顯著(P>0.05)。圖2同。Data columns with different small letters indicated significant difference (P<0.05),while with the same small letters indicated no significant difference (P>0.05).The same as Fig.2.圖1 不同濃度SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs中HSF-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of SSa and SSd on mRNA relative expression level of HSF-1 in heat induced BMECs

如圖2所示，與陰性對(duì)照組相比，在熱誘導(dǎo)1 h時(shí)，任意濃度的SSa和SSd均能夠顯著提高BMECs中HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)；在熱誘導(dǎo)4和8 h時(shí)，0.1 μmol/L SSa和0.10 μmol/L SSd能夠顯著提高BMECs中HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)；在熱誘導(dǎo)12和24 h時(shí)，0.01 μmol/L SSd處理組BMECs中HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

圖2 不同濃度SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs中HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of SSa and SSd on mRNA relative expression level of HSP70 in heat induced BMECs

3 討 論

3.1 熱處理對(duì)BMECs抗氧化能力的影響

熱應(yīng)激會(huì)引起機(jī)體代謝增強(qiáng)，產(chǎn)生過(guò)量的ROS而發(fā)生氧化應(yīng)激[18-19]。機(jī)體內(nèi)存在一套復(fù)雜的抗氧化防御系統(tǒng)，SOD是重要的內(nèi)源性抗氧化物酶，SOD催化ROS生成H2O2和氧氣(O2)[20]，GSH-Px和CAT進(jìn)一步將H2O2分解生成H2O和O2，從而使細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[21-22]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，通常用MDA含量來(lái)評(píng)價(jià)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在陽(yáng)性對(duì)照組BMECs中SOD和GSH-Px活性較陰性對(duì)照組顯著降低，熱誘導(dǎo)8 h時(shí)，BMECs中CAT活性也顯著降低。隨著熱誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，BMECs培養(yǎng)液中MDA含量逐漸增加，在42 ℃處理24 h時(shí)，培養(yǎng)液中MDA含量達(dá)到最大值，表明42 ℃熱處理能夠誘導(dǎo)BMECs發(fā)生氧化應(yīng)激。

3.2 SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs抗氧化能力的影響

研究表明，植物提取物不僅對(duì)動(dòng)物的免疫功能發(fā)揮調(diào)控作用，還能通過(guò)減少ROS的產(chǎn)生而作為抗氧化劑使用[24-25]。關(guān)于柴胡皂苷的藥理作用的研究發(fā)現(xiàn)，SSa和SSd具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡等作用[13]。基于純化的柴胡皂苷單體的研究表明，SSa[26]和SSd[27]可提高細(xì)胞抗氧化能力，清除ROS，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。Chen等[28]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射SSa能夠緩解香煙煙霧引起的小鼠肺臟組織損傷，抑制MDA的生成，且激活肺組織中與氧化應(yīng)激相關(guān)的核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)信號(hào)通路。SSa具有良好的抗炎和抗氧化作用，SSa可顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS的產(chǎn)生及炎癥因子的表達(dá)[29]。何燕等[30]研究表明，SSd可顯著降低肝纖維化大鼠血清和肝臟中MDA的含量，緩解大鼠的脂質(zhì)過(guò)氧化現(xiàn)象。SSd能夠通過(guò)抑制MDA的產(chǎn)生和提高SOD的活性來(lái)發(fā)揮抗氧化作用，減輕四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的急性肝細(xì)胞損傷[31]。GSH-Px是具有一種較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激作用的酶，可提高細(xì)胞抗氧化和清除自由基的能力，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。李素婷等[32]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加不同濃度的SSd可以緩解乙醇誘導(dǎo)的原代大鼠肝細(xì)胞損傷，顯著提高細(xì)胞中GSH-Px活性，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力。SSd顯著降低H2O2誘導(dǎo)的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞(PC12)MDA的釋放，提高SOD活性和總抗氧化能力，并且SSd能夠抑制ROS積累，阻斷絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)依賴性氧化損傷而緩解H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[33]。熱應(yīng)激奶牛生產(chǎn)試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加柴胡提取物可降低奶牛直腸溫度，改變奶牛血液代謝，提高熱應(yīng)激奶牛產(chǎn)奶量和乳蛋白產(chǎn)量，降低乳中體細(xì)胞數(shù)[17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與陽(yáng)性對(duì)照組相比，培養(yǎng)基中添加任意濃度的SSa均能夠顯著提高熱誘導(dǎo)1 h時(shí)BMECs中SOD活性；在熱誘導(dǎo)4、8和24 h時(shí)，0.1 μmol/L SSa組BMECs中CAT活性較陽(yáng)性對(duì)照組顯著提高；培養(yǎng)基中添加0.01 μmol/L SSd在熱誘導(dǎo)1、4、8、12和24 h時(shí)均能顯著提高BMECs中GSH-Px活性。上述結(jié)果表明適宜濃度的SSa和SSd可以通過(guò)提高BMECs中抗氧化酶活性而增強(qiáng)抗氧化能力。在熱誘導(dǎo)24 h時(shí)，0.01 μmol/L SSd顯著降低了BMECs培養(yǎng)液中MDA含量。本研究中所利用的細(xì)胞模型與上述研究不同，但本質(zhì)都是探究SSa和SSd對(duì)細(xì)胞抗氧化能力的影響，本試驗(yàn)證明較低劑量的SSa(0.1 μmol/L)和SSd(0.01 μmol/L)對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs氧化應(yīng)激有較好的緩解作用，可能是由于SSa和SSd能夠增強(qiáng)BMECs中抗氧化物酶的活性并且抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用。

研究表明，柴胡皂苷的藥理學(xué)和毒理學(xué)效應(yīng)與劑量相關(guān)[34]，腹腔注射較大劑量的SSa后小鼠出現(xiàn)毒性反應(yīng)[35]。Chen等[36]研究了SSd對(duì)人肝細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果表明，SSd呈劑量依賴性抑制細(xì)胞活力，0.4 μmol/L SSd顯著抑制細(xì)胞增殖，該濃度下細(xì)胞線粒體膜電位降低，B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)基因表達(dá)下調(diào)，標(biāo)志細(xì)胞凋亡的Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)基因表達(dá)上調(diào)。SSa會(huì)以劑量依賴的方式增加表皮角質(zhì)細(xì)胞(HEKa)中ROS的產(chǎn)生，降低線粒體膜電位，誘導(dǎo)HEKa凋亡[37]。Wang等[38]也發(fā)現(xiàn)，10 μmol/L SSa會(huì)誘導(dǎo)癌細(xì)胞產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，且SSa較SSd細(xì)胞毒性更強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間、多次為大鼠灌服柴胡皂苷粗提物會(huì)導(dǎo)致大鼠肝臟毒性損傷，且損傷途徑與氧化損傷機(jī)制有關(guān)[39]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在熱誘導(dǎo)12和24 h時(shí)，培養(yǎng)基中添加1.0 μmol/L SSa和0.10 μmol/L SSd對(duì)BMECs中SOD、GSH-Px和CAT活性無(wú)顯著改善作用，或者顯著降低了以上抗氧化酶的活性，說(shuō)明高濃度的SSa和SSd可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。在熱誘導(dǎo)12 h時(shí)，0.10 μmol/L SSd組培養(yǎng)液中MDA的含量顯著升高，表明SSa和SSd對(duì)BMECs氧化應(yīng)激的緩解作用存在劑量依賴性，較高濃度的SSa或SSd可能會(huì)隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)BMECs產(chǎn)生不利影響。本研究進(jìn)一步證實(shí)了SSa和SSd 既是柴胡發(fā)揮功效的主要化學(xué)單體成分，又是其產(chǎn)生毒性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.3 SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs中熱休克蛋白基因表達(dá)的影響

熱休克反應(yīng)是細(xì)胞應(yīng)對(duì)高溫的適應(yīng)性機(jī)制，對(duì)于熱應(yīng)激下細(xì)胞的存活至關(guān)重要[40]，若不及時(shí)采取緩解措施，持續(xù)熱應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在體外，暴露于高溫環(huán)境會(huì)導(dǎo)致BMECs增殖停滯并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[41]。HSF-1是調(diào)節(jié)熱休克蛋白(HSPs)基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞遭受熱應(yīng)激時(shí)，HSF-1啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，促進(jìn)HSPs的表達(dá)，從而對(duì)錯(cuò)誤折疊蛋白進(jìn)行修復(fù)，提高細(xì)胞抵抗熱應(yīng)激的能力[42-43]。HSPs的大量表達(dá)是熱應(yīng)激狀態(tài)下一種重要的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，HSF-1和HSPs表達(dá)的上調(diào)可增強(qiáng)細(xì)胞的穩(wěn)定性，并在熱應(yīng)激條件下形成耐熱性[41]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在42 ℃熱處理下，BMECs中HSF-1和HSP70基因的表達(dá)均顯著上調(diào)，并且隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，表明BMECs在熱處理?xiàng)l件下啟動(dòng)了HSPs的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，并且BMECs產(chǎn)生了熱耐受性。

Guo等[44]研究發(fā)現(xiàn)，HSP70可通過(guò)調(diào)節(jié)GSH-Px的活性以應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，并且提出這可能是HSPs在應(yīng)激狀態(tài)下發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞功能的一種作用機(jī)制。Choi等[45]探討HSP70與抗氧化酶的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，敲除HSP70基因后小鼠中SOD活性和SOD蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組小鼠相比顯著降低，推測(cè)HSP70可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后修飾參與了SOD的表達(dá)調(diào)控。HSPs可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化狀態(tài)來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受熱和氧化應(yīng)激的損傷，同時(shí)，一些外源性的添加物有助于調(diào)控?zé)嵝菘讼嚓P(guān)基因的表達(dá)，從而改善細(xì)胞的抗氧化能力[46]。天然植物來(lái)源的化合物可能通過(guò)其生物和藥理活性來(lái)誘導(dǎo)應(yīng)激條件下HSPs的表達(dá)，從而增強(qiáng)機(jī)體或者細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的抗氧化能力[47]。Zhang等[48]用SSd處理高溫誘導(dǎo)的豬腎近端小管上皮細(xì)胞，HSP72 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加，且呈劑量依賴性。本試驗(yàn)中，在熱誘導(dǎo)1 h時(shí)，0.01 μmol/L SSd能顯著提高BMECs中HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)BMECs中SOD和GSH-Px活性較陽(yáng)性對(duì)照組顯著升高；在熱誘導(dǎo)12和24 h時(shí)，0.01 μmol/L SSd能夠顯著提高BMECs中HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量，BMECs中GSH-Px活性較陽(yáng)性對(duì)照組也顯著提高，但高濃度的SSa和SSd卻對(duì)HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響，說(shuō)明隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，高濃度的SSa和SSd不能起到緩解BMECs熱應(yīng)激的作用，反而會(huì)對(duì)熱誘導(dǎo)條件下的BMECs產(chǎn)生不利影響，該結(jié)論與Zhang等[48]的研究結(jié)果相似。本試驗(yàn)僅研究了SSa和SSd對(duì)熱誘導(dǎo)的BMECs中HSF-1和HSP70基因表達(dá)的影響，其作用通路及影響機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

42 ℃高溫會(huì)誘導(dǎo)BMECs發(fā)生氧化應(yīng)激，并引發(fā)細(xì)胞熱休克反應(yīng)。在BMECs培養(yǎng)基中添加不同濃度的SSa和SSd會(huì)以劑量依賴性的方式提高熱誘導(dǎo)條件下BMECs中SOD、GSH-Px和CAT的活性，降低培養(yǎng)液中MDA的含量；同時(shí)，較低濃度的SSa和SSd可顯著提高HSF-1和HSP70 mRNA相對(duì)表達(dá)量，且HSP70基因表達(dá)上調(diào)可能與細(xì)胞中抗氧化物酶活性增強(qiáng)存在關(guān)聯(lián)。綜上可知，0.1 μmol/L SSa和0.01 μmol/L SSd對(duì)熱誘導(dǎo)條件下BMECs的氧化應(yīng)激損傷有較好的緩解作用。