維生素A對過氧化氫誘導的奶牛乳腺上皮細胞內乳脂合成的影響

郝 穎 趙艷麗 閆素梅 郭曉宇 郭詠梅 齊敬宇

(內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古自治區高校動物營養與飼料科學重點實驗室，呼和浩特 010018)

乳脂肪是構成牛奶的重要組成成分之一，也是衡量乳品質的關鍵指標，其含量與組成是奶業核心競爭力重要標志。在泌乳期間的奶牛，尤其是高產奶牛，由于合成和分泌大量的乳汁，乳腺組織代謝增強，對能量和氧的需求與利用增加，奶牛乳腺上皮細胞(BMECs)內呼吸作用加強，導致奶牛體內產生過多的活性氧(ROS)，當奶牛體內產生的大量ROS與機體抗氧化防御系統的清除能力不平衡時，會導致乳腺組織發生氧化應激[1-2]。乳腺組織是泌乳動物體內代謝最強的組織之一，BMECs是乳腺組織的主要實質細胞，是合成和分泌乳汁中乳脂和乳蛋白的主要場所。氧化應激的發生會對乳腺組織造成損傷，使其易遭受病原微生物的感染，易患乳房炎，并且會降低乳脂和乳蛋白的合成，影響乳產量和乳品質[3]，使奶牛的淘汰率增加，對奶業的健康發展造成重大損失。因此，緩解BMECs氧化應激的發生，進而改善乳腺健康和保證乳品質對奶業的健康持續發展具有非常重要的意義。本課題組前期研究得出，飼糧添加高于推薦劑量的維生素A可提高奶牛抗氧化功能和產乳性能[4]，體外研究也發現，維生素A的添加可促進BMECs內谷胱甘肽過氧化物酶1(GPx1)、谷胱甘肽過氧化物酶4(GPx4)和硫氧還蛋白還原酶1(TrxR1)的活性及其基因表達，促進乳脂合成相關基因的表達，對氧化損傷細胞具有緩解作用[4-6]，但其機制尚不清楚。過氧化氫(H2O2)是屬于ROS的一種體內代謝產物，可消耗抗氧化物質使機體抗氧化能力降低，對細胞有一定的毒害作用，其極容易穿過細胞膜，在細胞內與Fe2+反應生成高活性的自由基。Jin等[7]研究發現，過量H2O2可引起BMECs氧化損傷，降低細胞抗氧化能力。由于H2O2性質較穩定并容易獲得，所以目前很多研究都將其作為氧化損傷模型的誘導劑[8]。鑒于此，本試驗以H2O2為誘導劑，研究不同濃度的維生素A對H2O2誘導的BMECs內乳脂合成的影響，為合理調控乳腺內氧化還原平衡，進而改善乳腺健康、提升原料乳質量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本試驗采用單因子完全隨機試驗設計，將第3代BMECs隨機分成對照組(CON組)、H2O2損傷組(H2O2組)和7個維生素A預保護組，每個組6個重復。其中，CON組BMECs不進行維生素A與H2O2處理，用生長培養基于5% CO2、37 ℃條件下培養30 h；H2O2組BMECs進行H2O2損傷處理，即用CON組培養基于5% CO2、37 ℃條件下培養24 h，再加入H2O2繼續培養6 h；7個維生素A預保護組BMECs預添加維生素A后進行H2O2損傷處理，即在CON組培養基中添加不同濃度維生素A后于5% CO2、37 ℃條件下培養24 h，再加入H2O2繼續培養6 h，維生素A濃度分別為0.05(0.05VAH組)、0.10(0.1VAH組)、0.20(0.2VAH組)、0.50(0.5VAH組)、1.00(1VAH組)、2.00(2VAH組)和4.00 μg/mL(4VAH組)。培養結束后收集培養液和細胞用于分析測定。維生素A濃度以及H2O2濃度與處理時間依據本課題組前期研究結果[4,7]設定，H2O2濃度與處理時間分別為800 μmol/L和6 h。

1.2 試劑配制

生長培養基：在DMEM/F12基礎培養基中添加10%胎牛血清(FBS，Gibco公司，美國)、0.5%胰島素轉鐵蛋白硒鈉(ITS，Gibco公司，美國)、10 ng/mL表皮生長因子(EGF，Sigma公司，美國)、2.5 μg/mL兩性霉素(Sigma公司，美國)、2%雙抗(Gibco公司，美國)、1 μg/mL氫化可的松(Sigma公司，美國)。

維生素A貯備液：稱取100 mg的視黃酸(RA，Sigma公司，美國)溶解于5 mL的二甲基亞砜(DMSO，Amresco公司，美國)溶液中，配制成20 mg/mL的維生素A原液，然后再用DMSO溶液將維生素A原液稀釋成0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00和4.00 mg/mL的維生素A貯備液，用0.22 μm過濾器過濾，避光保存。

H2O2工作液：3%的H2O2(Sigma公司，美國)濃度約為0.88 mol/L，用超純水將0.88 mol/L的H2O2原液稀釋成800 mmol/L的H2O2貯備液，最后用不加FBS的生長培養基將H2O2貯備液配制成880 μmol/L的工作液。

1.3 BMECs的培養

BMECs原代培養采用膠原酶消化法，操作方法參考Sheng等[9]的方法進行。將從屠宰場采回的健康奶牛乳腺去除組織表層，再剪成約1 cm3大小的組織塊，用3×雙抗磷酸鹽緩沖溶液(PBS，HyClone公司，美國)清洗。在超凈臺里用PBS、75%酒精分別清洗后從乳腺內部剪取腺泡豐富的部位剪碎至糊狀，再加入等體積的0.5%膠原酶Ⅱ(Gibco公司，美國)，37 ℃消化1 h。最后用80目濾網過濾，濾液262×g離心5 min后棄上清，用PBS清洗細胞，在相同條件下離心3 min，棄上清，加入生長培養基懸浮細胞并接種于25 cm2細胞培養瓶中，于37 ℃、5% CO2條件下培養。當細胞貼壁度達到80%～90%時，使用0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(Gibco公司，美國)進行細胞純化并傳代。原代細胞含有少量的成纖維細胞，但在純化與傳代培養過程中，成纖維細胞很少被傳入第3代細胞中，詳見圖1。

圖1 原代(a)和第3代(b)奶牛乳腺上皮細胞的顯微鏡圖像Fig.1 Microscopic images of primary (a)and F3 (b) bovine mammary epithelial cells (100×)

1.4 測定指標與方法

1.4.1 細胞活力

BMECs的細胞活力采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法測定，使用相對增殖率(RGR)表示。將細胞懸液接種到96孔細胞板內，按試驗設計處理后加入20 μL的CCK-8溶液(北京碧云天生物技術研究所)，繼續培養1 h，使用全自動酶標儀檢測各孔450 nm波長處的吸光度值(OD450 nm)。

RGR(%)=(試驗組OD450 nm/CON組OD450 nm)×100。

1.4.2 甘油三酯(TG)含量、抗氧化指標以及乳脂合成相關酶活性

按照試驗設計培養結束后棄上清，用PBS清洗2次，每孔加入200 μL裂解液混勻后室溫靜置10 min，收集裂解液于1.5 mL無酶無菌離心管中，70 ℃加熱10 min，室溫下622×g離心5 min后取上層清液進行TG含量測定。TG含量使用酶法，按照試劑盒說明書(北京普利萊基因技術有限公司)進行測定。

細胞培養液總抗氧化能力(T-AOC)采用鉬酸銨顯色法測定，總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用比色法測定，谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性采用二硫代二硝基苯甲酸法測定，試劑盒購于南京建成生物工程研究所，具體測定方法按照試劑盒說明書進行。細胞裂解液中ROS和TrxR1以及乳脂合成相關酶——脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)和脂蛋白酯酶(LPL)活性采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定，試劑盒購自美國R&D公司，具體測定方法按照試劑盒說明書進行。細胞裂解液中GPx和TrxR1活性換算為蛋白質基礎，蛋白質含量采用二喹啉甲酸法測定。

1.4.3 細胞內抗氧化和乳脂合成相關基因的相對表達量

表1 引物序列及參數Table 1 Primer sequences and parameters

1.5 數據統計與分析

試驗數據利用SAS 9.0軟件的ANOVA程序進行單因素方差分析，采用Duncan氏法進行多重比較。統計結果以P≤0.05表示組間差異顯著，P>0.05表示組間差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 維生素A對H2O2誘導的BMECs內RGR、抗氧化指標和ROS活性的影響

由表2可知，H2O2組的RGR顯著低于CON組(P≤0.05)；與H2O2組相比，0.1VAH～4VAH組的RGR顯著增加(P≤0.05)，以1VAH組最高。與CON組相比，H2O2組的GPx、T-AOC、T-SOD、CAT、TrxR活性顯著降低(P≤0.05)，但ROS活性顯著增加(P≤0.05)。與H2O2組相比，0.2VAH～4VAH組的GPx活性顯著升高(P≤0.05)，以1VAH組最高；0.2VAH～2VAH組的T-AOC顯著增加(P≤0.05)，其他維生素A預保護組變化不顯著(P>0.05)；1VAH～4VAH組的TrxR活性顯著增加(P≤0.05)，其他維生素A預保護組變化不顯著(P>0.05)；1VAH組的T-SOD和CAT活性顯著增加(P≤0.05)，但ROS活性顯著下降(P≤0.05)。

表2 維生素A對H2O2誘導的BMECs內RGR、抗氧化指標和ROS活性的影響Table 2 Effects of VA on RGR,antioxidant indexes and ROS activity of BMECs induced by H2O2

續表2項目Items組別GroupsCONH2O20.05VAH0.1VAH0.2VAH0.5VAH1VAH2VAH4VAH均值標準誤SEMP值P-value硫氧還蛋白酶TrxR1/(U/mgprot)4.65a3.29c3.37c3.40c3.90bc3.78bc4.11ab4.11ab4.08ab0.1590.002活性氧ROS/(U/mL)67.20c78.40a70.20bc77.70a77.40a75.33ab66.73c76.13ab69.73bc1.8420.003

2.2 維生素A對H2O2誘導的BMECs內TG含量和乳脂合成相關酶活性的影響

由表3可知，H2O2組的TG含量顯著低于CON組(P≤0.05)。與H2O2組相比，1VAH組的TG含量顯著升高(P≤0.05)。與CON組相比，H2O2組的ACC、LPL和SCD活性顯著降低(P≤0.05)，FASN活性無顯著變化(P>0.05)。與H2O2組相比，0.5VAH和1VAH組的FASN活性顯著升高(P≤0.05)；0.1VAH～4VAH組的ACC活性顯著升高(P≤0.05)；0.1VAH、1VAH、2VAH和4VAH組的LPL活性顯著升高(P≤0.05)；0.2VAH、1VAH、2VAH和4VAH組的SCD活性顯著升高(P≤0.05)。

表3 維生素A對H2O2誘導的BMECs內TG含量和乳脂合成相關酶活性的影響Table 3 Effects of VA on TG content and enzyme activities related to milk fat synthesis of BMECs induced by H2O2

2.3 維生素A對H2O2誘導的BMECs內抗氧化和乳脂合成相關基因表達的影響

由表4可知，與CON組相比，H2O2組的GPx1、GPx4、TrxR1、FASN、ACC和PPARγ相對表達量顯著降低(P≤0.05)。與H2O2組相比，0.05VAH～4VAH組的GPx1、SCD和PPARγ相對表達量顯著升高(P≤0.05)，GPx1相對表達量以1VAH組最高；1VAH～4VAH組的GPx4相對表達量顯著升高(P≤0.05)，以4VAH組最高；0.1VAH～4VAH組的TrxR1相對表達量顯著升高(P≤0.05)；0.2VAH～4VAH組的FASN和LPL相對表達量顯著升高(P≤0.05)，FASN相對表達量以1VAH組最高；0.1VAH和0.2VAH組的ACC相對表達量顯著升高(P≤0.05)；0.05VAH～2VAH組的SREBP1相對表達量顯著升高(P≤0.05)；0.05VAH～0.5VAH組的FABP3相對表達量顯著升高(P≤0.05)。

表4 維生素A對H2O2誘導的BMECs內抗氧化和乳脂合成相關基因表達的影響Table 4 Effects of VA on expression of genes involved in antioxidation and milk fat synthesis in BMECs induced by H2O2

3 討 論

動物機體在正常的生理代謝情況下會產生具有氧化性的自由基，例如ROS和H2O2等，但ROS過量產生并積累可對動物組織和細胞產生實質性損害，導致細胞氧化應激[10-11]?？寡趸窯Px、TrxR、T-SOD和CAT在催化還原H2O2和一些脂溶性過氧化物方面發揮了重要的作用，可以清除組織細胞由氧化損傷而產生的自由基[1,12]。在人體肝細胞及BMECs上的研究表明，H2O2損傷細胞后，細胞內GPx1、CAT和超氧化物歧化酶(SOD)的活性顯著降低，而ROS活性顯著升高[5,11]。本課題組前期研究得出，奶牛飼糧添加高于推薦劑量的維生素A(220 IU/kg飼糧)可以提高血清抗氧化酶GPx、TrxR、T-SOD、CAT等的活性，降低ROS活性，減緩機體及細胞氧化損傷[5]，體外研究也得出了相似的結果[7]。本試驗從體外進一步驗證了H2O2會導致細胞活力和抗氧化功能的降低，抗氧化酶活性及抗氧化相關基因GPx1、GPx4和TrxR表達的下調，ROS活性顯著增加；采用0.20～2.00 μg/mL維生素A進行預保護會減緩細胞氧化損傷，抑制ROS活性的增加，尤以1.00 μg/mL的維生素A效果最好。

TG含量約占乳脂總量的98%，其含量高低可以反映乳脂的合成情況。TG主要在哺乳動物的乳腺組織中積累形成脂質滴，其主要成分是脂肪酸[13]。乳中脂肪酸有2個來源途徑：一是中短鏈脂肪酸的從頭合成；二是從血液中吸收的長鏈脂肪酸。FASN和ACC是乳腺內短鏈(C4～C8)和中鏈(C10～C14)以及一部分C16脂肪酸從頭合成的2個關鍵酶[13]，并且ACC也是牛乳脂合成的限速酶。LPL和FABP3參與BMECs內多種組織脂肪酸的攝取和轉運，LPL將血液中攝取的乳糜微粒和TG水解成甘油和分子質量較小的脂肪酸，然后FABP3將脂肪酸從細胞膜運送到TG和磷脂合成與氧化的位點上[14]。SCD在乳脂合成過程中具有脫氫去飽和作用，FABP3主要作用是為SCD提供脫氫底物[14]。有研究表明，用氧化誘導劑作用BMECs后，細胞內抗氧化酶活性降低，導致細胞氧化損傷，進而引起乳脂合成相關酶活性降低[3,13]，抑制乳脂的合成[15]。本研究發現，添加維生素A預保護后可減緩H2O2引起的細胞內TG含量、與脂肪酸從頭合成相關基因FASN和ACACA的表達和其對應酶活性及其與脂肪酸攝取相關酶LPL和SCD活性的下降。

PPARγ和SREBP1是脂肪合成中重要的轉錄因子和核受體，可以調節乳腺內FASN、ACACA、SCD、LPL和FABP3等靶基因的表達。奶山羊乳腺細胞中敲除PPARγ會導致上述基因的表達量顯著下降[16]，表明PPARγ調節乳腺細胞中脂肪酸的從頭合成和去飽和過程。Wang等[13]研究指出，脂多糖(LPS)誘導的BMECs會使SREBP1活性及其基因相對表達量下降，導致TG合成和分泌減少。H2O2誘導損傷神經元細胞后，使PPARγ磷酸化并使其失活[17]，而PPARγ激活可以抑制ROS和脂質過氧化物產生，提高SOD活性和谷胱甘肽(GSH)含量，減少細胞氧化損傷[18]。本課題組前期研究指出，在BMECs中添加PPARγ抑制劑GW9662后，細胞內PPARγ和TrxR的相對表達量顯著降低[19]。過氧化酶體增殖物激活受體(PPAR)與配體結合激活后能和類維生素A的X受體(RXR)形成異源二聚體，然后和靶基因上的PPAR反應元件相互作用調控靶基因的轉錄和表達，而維生素A的代謝產物9-順式維甲酸(9-cisRA)是RXR的有效配體[20]。本研究結果得出，添加維生素A預保護逆轉了H2O2誘導引起的BMECs中PPARγ、FASN、ACC和LPL相對表達量的降低，并上調了SREBP1、SCD和FABP3的表達，提示維生素A可能通過抑制轉錄因子PPARγ和SREBP1表達的下降，促進脂肪酸從頭合成和脂肪酸攝取來緩解氧化損傷引起的細胞內TG合成的下降；但維生素A在減緩氧化損傷的細胞內TG合成降低的同時，是否對乳脂肪中各種脂肪酸的組成產生影響尚需在后續的研究中進一步探討。

大鼠發生脂肪肝炎后，脂肪組織內TrxR、GPx的活性與TrxR的基因表達量顯著降低，氧化應激加劇，引起肝組織中游離脂肪酸含量增加，PPARγ的基因表達量顯著減少[21]。在小鼠上的研究發現，增加血清GPx活性可以促進PPARγ活化，減輕動脈炎癥并降低體內氧化應激水平[22]。本課題組前期研究指出，沉默BMECs中GPx基因可降低PPARγ基因的表達[20]。上述結果提示維生素A緩解H2O2引起的BMECs內乳脂合成的降低可能是通過增強TrxR、GPx活性引起PPARγ的活性升高，因此有必要利用基因沉默或過表達技術從該領域繼續進行深入研究。本試驗從體外研究了維生素A對氧化損傷后BMECs內乳脂合成減少的緩解效果，并得出1.00 μg/mL維生素A的效果較好。在實際生產中，飼糧中維生素A的添加量具體為多少可以對乳腺組織氧化損傷具有較好的減緩效果，還需要在體內進一步驗證。

4 結 論

維生素A對H2O2誘導的氧化損傷引起的BMECs抗氧化能力的降低，乳脂合成、轉錄因子PPARγ和SREBP1以及從頭合成基因FASN、ACC與脂肪酸攝取基因LPL、SCD和FABP3表達的下降具有減緩作用，并呈劑量依賴性，以0.20～2.00 μg/mL維生素A的效果較好，尤以1.00 μg/mL維生素A的效果最好。