補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬運動性能、糖代謝及抗氧化能力的影響

張文杰 李曉斌 劉 律 馬 艷 魯 豪 楊 昊 歐陽文 楊開倫*

(1.新疆農業大學動物科學學院，新疆肉乳用草食動物營養重點實驗室，烏魯木齊 830052；2.新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇種馬場，昭蘇 835000)

馬匹在進行高強度的訓練或比賽時，往往伴隨著肌肉損傷、運動疲勞和恢復緩慢等生理問題。因此，在保證科學訓練基礎上為專項運動馬補充特殊營養添加劑，對專項運動馬的能源補充和疲勞恢復具有重要意義。胍基乙酸(GAA)是哺乳動物體內肌酸(Cr)及其磷酸化衍生物磷酸肌酸的唯一前體物質[1]，GAA主要在腎臟由L-精氨酸和甘氨酸內源合成，通過血液循環運輸到肝臟，在胍基乙酸-N-甲基轉移酶的催化下再經甲基化生成Cr[2]。外源性補充Cr已被證實對雜交馬[3]、伊犁馬[4]和純血馬[5]運動潛力的提升有顯著的作用。然而，外源性補充Cr時存在不穩定和成本高等缺點，導致生物學效價不能充分的發揮，而GAA具有性質穩定、生物利用度高和成本低等特點，可能是比Cr更適合的運動補充劑。在動物合成Cr的過程中，需要甲基供體，外源性補充GAA更會引起甲基供體需求的增加[6]。此外，外源性補充GAA會導致同型半胱氨酸含量的升高[7]，對動物的健康有潛在的威脅，而使用甲基供體的營養添加劑來抑制GAA生成的同型半胱氨酸是十分有效的[8]。外源性補充GAA和甲基供體的聯合使用或能發揮更大的優勢。

甜菜堿(Bet)是甘氨酸的三甲基衍生物，能為機體提供可用性較高的甲基[9]；GAA合成Cr的過程中需要S-腺苷蛋氨酸作甲基供體，而S-腺苷蛋氨酸來源于蛋氨酸(Met)，適宜補充Bet或Met可使GAA更有效地轉化為Cr。補充GAA及GAA和甲基供體對耐力的提高和肌肉力量的增強主要集中在人的相關研究[10-11]中，而在運動馬研究中卻鮮有報道。因此，本試驗選取伊犁馬為試驗動物，在飼糧中補喂GAA、GAA+Bet以及GAA+Met，探究補喂GAA和不同甲基供體物對伊犁馬運動性能、糖代謝及抗氧化能力的影響，豐富伊犁馬生理代謝學理論，為促進伊犁馬高水平運動訓練和競賽能力的發揮提供科學理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點

試驗于2020年9月16日至2020年10月11日在新疆維吾爾族自治區伊犁哈薩克自治州昭蘇種馬場進行。

1.2 試驗設計及分組

表1 基礎飼糧組成及營養水平(干物質基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

續表1項目Items含量Content磷P0.39消化能DE/(MJ/kg)8.91

GAA補喂量參考Setoue等[12]的研究結果，Bet和Met的補喂量按照GAA轉化為Cr消耗的甲基數來確定(Bet有3個甲基，其中2個可供代謝循環利用，GAA轉化為Cr消耗1個甲基，那么Bet的添加劑量為GAA的1/2，補喂量為30 mg/kg BW；Met有1個甲基可供利用，GAA轉化為Cr消耗1個甲基，那么Met的補喂量與GAA之比為1∶1，由于DL-Met的利用率為50%，則Met的補喂量為152 mg/kg BW)。試驗設計及分組見表2。將各組的GAA、Bet、Met、玉米和次粉制作成顆粒后等分為2份，與精料補充料充分混合后每天08:00和20:00補喂，進行為期25 d的試驗。

表2 試驗設計及分組Table 2 Experimental design and groups

1.3 飼養管理

所有試驗馬匹均單廄飼養在同一環境中，每天每匹馬飼喂8 kg干牧草和4 kg精料補充料，自由飲水。飼喂時，馬匹預先采食1 kg干牧草，再補給精料補充料，待精料補充料采食完畢后，繼續添加干牧草。每天按時打掃馬廄，清除糞便，更換墊草，及時驅蟲。

1.4 訓練方案及場地

試驗馬匹每天進行1次速度訓練，馬匹訓練時間安排在11:00—13:00或者17:30—19:30。首先進行熱身訓練，騎手騎乘試驗馬先在草道上慢步10 min，隨即進入沙道，進行10 min快步訓練，然后15 min慢跳訓練，最后停止訓練，牽遛5～10 min，直至馬匹呼吸平穩。訓練場地為新疆昭蘇種馬場伊犁馬測試調訓中心，賽道由橢圓形沙道和草道組成。內部沙道由細沙構成，深度40 cm，底部為土基，道寬21 m，周長為800 m；外部草道由天然的牧草形成，寬20 m，周長為1 000 m。

1.5 指標測定

1.5.1 比賽成績測定

補喂試驗開始前(第0天)和試驗結束后(第25天)在新疆昭蘇種馬場伊犁馬測試調訓中心進行2 000 m速度賽，賽道周長為1 000 m，用秒表記錄每匹馬的比賽用時，用以下公式計算每秒速度值、平均耗時減少以及成績提高幅度。

每秒速度值(m/s)=2 000(m)/比賽用時(s)；平均耗時減少(s)=試驗第0天比賽用時(s)-試驗第25天比賽用時(s)；成績提高幅度(%)=[平均耗時減少(s)/試驗第0天比賽用時(s)]×100。

1.5.2 心率、呼吸頻率測定

試驗第25天進行2 000 m速度賽，在賽前2 h、賽后即刻和賽后2 h用Polar脈搏儀(購自上海益聯科教設備有限公司)測定每匹馬的心率，同時通過觀察胸廓起伏次數記錄每匹馬的呼吸頻率。

1.5.3 血漿生化指標的測定

于試驗第25天進行2 000 m速度賽，分別在賽前2 h、賽后即刻和賽后2 h采集血樣，通過馬匹頸靜脈采集血液4 mL至氟化鈉抗凝管，3 500 r/min離心15 min，制備血漿，分裝至1.5 mL Eppendorf管中，標記后-20 ℃冷凍保存。

馬匹血漿中GAA、Cr、肌酐(Crn)含量在新疆農業大學動物科學學院動物營養與飼料科學實驗室采用高效液相色譜法測定[13]；血漿過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、肌酸激酶(CK)活性，總抗氧化能力(T-AOC)，丙二醛(MDA)、葡萄糖(GLU)、乳酸(LD)含量送至北京華英生物技術研究所采用比色法測定；血漿胰島素(INS)、胰高血糖素(Gc)含量送至北京華英生物技術研究所采用酶聯免疫吸附法測定。

1.6 統計分析

數據采用Excel 2010進行初步整理，試驗結果以平均值(mean)和均值標準誤(SEM)表示。所有試驗數據采用SPSS 19.0統計軟件的one-way ANOVA進行單因素方差分析，差異顯著則用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05作為差異顯著的判斷標準，0.05

2 結果與分析

2.1 補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬2 000 m比賽成績的影響

由表3可知，各組第0天比賽用時、第25天比賽用時和每秒速度值間均無顯著性差異(P>0.05)。GAA組、GAA+Bet組和GAA+Met組在平均耗時減少方面顯著高于對照組(P<0.05)；GAA組在成績提高幅度方面顯著高于GAA+Met組、對照組(P<0.05)，高于GAA+Bet組，但無顯著性差異(P>0.05)。

表3 補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬2 000 m比賽成績的影響Table 3 Effects of supplemental feeding of guanidine acetic acid and different methyl donors on results of 2 000 m race in Yili horses (n=5)

2.2 補喂胍基乙酸和不同甲基供體對伊犁馬2 000 m比賽心率和呼吸頻率的影響

由表4可知，賽前2 h，各組馬匹心率和呼吸頻率穩定；賽后即刻，各組馬匹心率和呼吸頻率均升高；賽后2 h，各組馬匹心率和呼吸頻率恢復至正常水平。各組馬匹心率和呼吸頻率在賽前2 h、賽后即刻和賽后2 h均無顯著性差異(P>0.05)。

表4 補喂胍基乙酸和不同甲基供體對伊犁馬2 000 m比賽心率和呼吸頻率的影響Table 4 Effects of supplemental feeding of guanidine acetic acid and different methyl donors on heart rate and respiratory rate of 2 000 m race in Yili horses (n=5)

2.3 補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬血漿GAA、Cr及Crn含量的影響

由表5可知，賽前2 h、賽后即刻和賽后2 h，各組馬匹血漿GAA、Cr和Crn含量雖均無顯著性差異(P>0.05)，但各試驗組血漿GAA、Cr和Crn含量在對照組基礎上有一定的提高。

表5 補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬血漿GAA、Cr及Crn含量的影響Table 5 Effects of supplemental feeding of guanidine acetic acid and different methyl donors on plasma GAA,Cr and Crn contents in Yili horses (n=5) μmol/L

2.4 補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬血漿肌酸激酶活性、乳酸含量的影響

由表6可知，GAA組、GAA+Bet組、GAA+Met組血漿肌酸激酶活性在賽前2 h均有增加的趨勢(P=0.094)，乳酸含量也有小幅度升高；各組間血漿肌酸激酶活性和乳酸含量在賽后即刻和賽后2 h均無顯著性差異(P>0.05)。

表6 補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬血漿肌酸激酶活性、乳酸含量的影響Table 6 Effects of supplemental feeding of guanidine acetic acid and different methyl donors on plasma creatine kinase activity and lactic acid content in Yili horses (n=5)

續表6項目Items對照組ControlgroupGAA組GAAgroupGAA+Bet組GAA+BetgroupGAA+Met組GAA+MetgroupSEMP值P-value乳酸LD/(mmol/L)賽前2hPre-race2h0.820.920.880.900.050.154賽后即刻Immediatelyatpost-race1.121.131.111.440.910.385賽后2hPost-race2h0.740.780.730.650.040.739

2.5 補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬血漿糖代謝的影響

由表7可知，各組間血漿葡萄糖含量在賽前2 h、賽后即刻和賽后2 h均無顯著性差異(P>0.05)，GAA組和GAA+Bet組血漿胰島素含量在賽后即刻、賽后2 h顯著高于對照組(P<0.05)，GAA組血漿胰高血糖素含量在比賽前后均顯著高于對照組(P<0.05)，GAA+Bet組在賽前2 h和賽后即刻較對照組有顯著升高(P<0.05)，GAA組總體優于GAA+Bet組。

表7 補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬血漿糖代謝的影響Table 7 Effects of supplemental feeding of guanidine acetic acid and different methyl donors on plasma glucose metabolism in Yili horses (n=5)

2.6 補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬血漿抗氧化指標的影響

由表8可知，賽前2 h，GAA組、GAA+Bet組和GAA+Met組血漿CAT、GSH-Px、SOD活性及T-AOC均高于對照組，MDA含量均低于對照組。其中，GAA組血漿GSH-Px、SOD活性和T-AOC顯著高于對照組(P<0.05)，GAA+Bet組和GAA+Met組血漿SOD活性顯著高于對照組(P<0.05)；賽后即刻，GAA組、GAA+Bet組和GAA+Met組血漿CAT活性顯著高于對照組(P<0.05)，GAA+Bet組血漿MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)；賽后2 h，GAA組血漿T-AOC顯著高于對照組(P<0.05)，MDA含量顯著降低(P<0.05)。

表8 補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬血漿抗氧化指標的影響Table 8 Effects of supplemental feeding of guanidine acetic acid and different methyl donors on plasma antioxidant indices in Yili horses (n=5)

續表8項目Items對照組ControlgroupGAA組GAAgroupGAA+Bet組GAA+BetgroupGAA+Met組GAA+MetgroupSEMP值P-value谷胱甘肽過氧化物酶GSH-Px/(U/mL)賽前2hPre-race2h379.15b487.75a428.19ab398.40b15.550.047賽后即刻Immediatelyatpost-race312.13384.37359.62339.0311.050.113賽后2hPost-race2h276.07328.31299.89291.0912.580.549超氧化物歧化酶SOD/(U/mL)賽前2hPre-race2h73.04c110.43a90.85b85.90b3.43<0.001賽后即刻Immediatelyatpost-race70.5676.4782.1272.484.400.826賽后2hPost-race2h49.1254.8148.6447.871.810.544總抗氧化力T-AOC/(U/mL)賽前2hPre-race2h6.27b7.43a7.01ab6.71ab0.150.023賽后即刻Immediatelyatpost-race7.117.196.846.510.150.405賽后2hPost-race2h6.30ab7.03a6.05ab5.08b0.240.019丙二醛MDA/(nmol/mL)賽前2hPre-race2h3.302.712.472.940.120.064賽后即刻Immediatelyatpost-race3.17a2.68ab2.40b2.87ab0.100.035賽后2hPost-race2h4.30a3.22b3.90ab4.40a0.170.042

3 討 論

3.1 補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬運動性能的影響

補充GAA或Cr具有增強肌肉力量[10]、改善運動表現[14]、緩解運動疲勞[15]、促進肌肉生長和提高抗氧化力[4]等作用。本試驗中，試驗組2 000 m比賽用時較對照組而言均有縮短，特別是在平均耗時減少和成績提高幅度方面，GAA組和GAA+Bet組顯著高于對照組，說明補喂GAA和GAA+Bet均能改善伊犁馬運動速度，其原因可能是由于補喂GAA或GAA和Bet后，增加了儲存在骨骼肌中磷酸肌酸和ATP的含量，并在劇烈運動期間發揮著重要的作用[16]。Teixeira等[3]研究指出，為平均體重為429 kg的雜交馬口服補充0.28 g/kg BW Cr 45 d后，對其比賽成績、心率和脈壓無顯著性影響。李曉斌等[4]發現，給伊犁馬補喂38 g Cr后，可提高伊犁馬1 000 m的運動成績，對賽前1 h、賽后即刻和賽后30 min的心率無顯著影響。結果均與本試驗相似。

3.2 補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬血漿GAA、Cr及Crn含量的影響

GAA是Cr生物合成的唯一前體物質，是能量代謝的重要底物。GAA可以在酶催化反應下由L-Arg和甘氨酸內源性形成，也可從富含動物蛋白質的食物中攝取[17]。GAA轉運到肝臟后甲基化為Cr，Cr作為高能載體在細胞中發揮重要作用[18]。本試驗中，給伊犁馬補喂GAA和不同甲基供體物(Bet、Met)后發現，GAA組、GAA+Bet組和GAA+Met組血漿GAA和Cr含量在賽前2 h、賽后即刻和賽后2 h均高于對照組，說明補喂的GAA經腸道吸收后，通過血液循環進入肝臟和腎臟，在肝臟、腎臟中GAA甲基化生成Cr，隨后又從肝臟釋放到血液循環中，經肌酸轉運蛋白將Cr轉入肌纖維和其他組織[19]。外源性補充GAA可增加GAA和Cr的生物利用度。Sewell等[5]證實，補喂0.05 g/kg BW的Cr后，可增加純血馬血漿中Cr含量。Ostojic等[10]以48名健康志愿者為研究對象，通過口服補充1.2、2.4和4.8 g/d GAA 6周后發現，志愿者血漿GAA、Cr含量均有顯著性升高，且存在劑量效應。與本試驗略有不同，可能是由于物種之間的吸收機制存在差異，馬是草食動物，與人類相比，肌酸的吸收可能會延遲或減少。GAA合成Cr的過程中需要S-腺苷蛋氨酸作甲基供體，而S-腺苷蛋氨酸來源于Met。本試驗前期未對基礎飼糧中Met進行測定，僅考慮在原有飼糧基礎上給伊犁馬補喂GAA時，可能會造成機體甲基的不足，因此，額外補充了甲基供體物(Bet和Met)，然而，GAA+Bet組和GAA+Met組與GAA組結果相近，并未達到顯著提高GAA和Cr含量的效果。在試驗后期對基礎飼糧中Met含量測定后發現，精料補充料Met含量為0.63%，青干草Met含量為0.23%，每匹馬每天采食4 kg精料補充料(Met攝入量為25.2 g)和8 kg青干草(Met攝入量為18.4 g)，試驗組馬匹平均體重為418.40 kg，外源性補喂GAA量為25.10 g，說明在本試驗研究條件下，基礎飼糧中的Met能滿足外源性補喂GAA時所需要的甲基，不需要再額外補充。GAA組、GAA+Bet組和GAA+Met組血漿Crn含量在賽前、即刻和賽后均略高于對照組，與GAA、Cr含量的結果相符。Crn是Cr和磷酸肌酸的代謝產物，Crn含量的小幅度增加與Cr的含量升高有關。該試驗結果與Stead等[20]和Ostojic等[21]給人補充GAA和不同甲基供體物的研究結果一致。

3.3 補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬血漿肌酸激酶活性、乳酸含量的影響

肌酸激酶是催化磷酸肌酸向ADP轉移的最具特征性的肌肉組織酶之一，馬匹在訓練或比賽期間，肌酸激酶活性的高低常作為肌肉細胞損傷的檢測指標[22]。Franciscato等[23]證實，肌酸激酶活性的升高表明肌肉損傷，肌酸激酶活性的下降速度反映肌肉恢復的快慢程度。在本試驗中，GAA組和GAA+Met組血漿肌酸激酶活性在賽后即刻和賽后2 h較對照組均有所降低，說明在給伊犁馬飼糧中補喂GAA或GAA和Met聯合組后，可在一定程度上降低伊犁馬機體肌酸激酶的活性，進而對其肌肉的快速恢復有積極的作用。而在賽前2 h，3個試驗組血漿肌酸激酶活性在對照組基礎上均有升高，說明馬匹在運動前，補充GAA和不同甲基供體物(Bet、Met)后，可小幅度提高伊犁馬血漿肌酸激酶的活性。試驗結果可能與機體Cr含量的升高有關。Dickinson等[24]認為，肌酸激酶活性的增加可通過外源性補充Cr來實現。也有學者認為，血清肌酸激酶活性的小幅增加與運動期間脂質過氧化和肌肉組織缺氧導致的異常細胞膜通透性有關[25]。

馬匹在進行短途、高強度的運動時會產生大量乳酸，造成肌肉酸痛、乏力等疲勞癥狀，影響骨骼肌收縮能力和馬匹的運動性能[26]。在本試驗中，賽前2 h，對照組血漿乳酸含量略低于試驗組，可能是因為試驗組馬匹在完成2 000 m比賽時，由于比賽用時的縮短，導致試驗組馬匹的運動強度高于對照組，進而增加了丙酮酸和乳酸等代謝產物的含量[27]。此外，GAA+Bet組在賽后即刻和GAA+Met組在賽后2 h，血漿乳酸含量有小幅度的降低，說明補喂GAA+Bet和GAA+Met對伊犁馬賽后機體乳酸清除有一定的作用。

3.4 補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬血漿糖代謝的影響

馬匹在進行時高強度運動時，會引起血糖和骨骼肌中的肌糖原加速分解。Eijnde等[28]和Ju等[29]研究發現，補充Cr可改善人和大鼠葡萄糖的代謝，增加肌糖原的積累。在本試驗中，給伊犁馬補喂Cr前體物質GAA和GAA+Bet、Met聯合組后發現，試驗組血漿葡萄糖含量在賽后即刻高于對照組，說明給伊犁馬補喂GAA或GAA+Bet、Met后，增加了伊犁馬血漿的葡萄糖含量，試驗結果可能與馬匹體內Cr含量的增加有關。此外，本試驗的3個試驗組在比賽即刻和比賽后血漿胰島素和胰高血糖素含量均出現增加。導致這一現象的原因可能是馬匹在高強度運動時，血糖被大量消耗，胰高血糖素分泌增多，糖異生作用隨之增強[30]。其次，由于補喂GAA或GAA+Bet后，馬匹機體中血漿氨基酸含量增加，氨基酸生糖引發了胰島素和胰高血糖素含量發生了變化[6]。另外，Van Loon等[31]發現，補充Cr和碳水化合物會顯著提高胰島素含量，刺激胰島素的分泌和增加葡萄糖的受體。Rooney等[32]和李曉斌等[4]也證實，長期補充Cr會提高大鼠和馬的血漿胰島素和葡萄糖的含量。因此，本試驗胰島素和胰高血糖素含量的升高也可能與Cr含量的增加有關。

3.5 補喂胍基乙酸和不同甲基供體物對伊犁馬血漿抗氧化能力的影響

運動會造成大量的活性氧(ROS)和自由基的積累[33]。在馬匹運動訓練中，如何快速清除機體產生的自由基，增加CAT、SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性和降低脂質過氧化反應中MDA含量來緩解氧化應激，對運動能力的提高有著重要的意義。在本試驗中，GAA組、GAA+Bet組和GAA+Met組均能提高賽前2 h和賽后即刻血漿中CAT、GSH-Px、SOD活性，說明補喂GAA、GAA+Bet和GAA+Met均可使伊犁馬血漿抗氧化能力增強。試驗結果可能與GAA和不同甲基供體物進入伊犁馬機體后，被迅速代謝為Cr有關，而Cr已被證實可作為外源性抗氧化劑來提高伊犁馬和焉耆馬的抗氧化能力[4,34]。此外，GAA組在馬匹血漿抗氧化能力提高方面，優于GAA+Bet組和GAA+Met組，說明本試驗條件下，基礎飼糧中的Met可為馬匹機體提供足夠的甲基，不需要額外補充甲基供體物便可使抗氧化能力顯著提高。本試驗結果與Wang等[35]給生長育肥豬補喂不同水平GAA的結果相一致。因此，GAA也可作為一種良好的抗氧化劑來清除馬匹體內的ROS和自由基，提高其運動能力。

4 結 論

本試驗條件下，可以得出以下結論：

① 補喂GAA和不同甲基供體物(Bet、Met)可提高伊犁馬2 000 m比賽運動成績、比賽前后血漿胰島素和胰高血糖素含量以及抗氧化能力，以GAA效果最好。

② 補喂GAA和不同甲基供體物(Bet、Met)對伊犁馬比賽前后血漿GAA、Cr、Crn、乳酸、葡萄糖含量和肌酸激酶活性無顯著影響。

③ 給伊犁馬飼糧補喂60 mg/kg BW GAA時，基礎飼糧中所含的Met可為機體提供足夠的甲基，不需要再額外補充甲基供體物。