植物乳桿菌對全株雜交構樹青貯品質、有氧穩定性及瘤胃體外產氣特性的影響

張玉琳 楊澤毅 李超程 黃星宇 張凡凡* 馬春暉*

(1.石河子大學動物科技學院，石河子 832000；2.新疆科構生物科技有限公司，石河子 832000)

構樹(Broussonetiapapyrifera)又稱殼樹、褚樹等，為多年生落葉喬木，營養價值高，適應性強，其葉片中粗蛋白質、粗脂肪含量高，粗纖維含量低，且富含各種氨基酸，是一種優質的非常規飼料資源。雜交構樹是由中國科學院植物研究所通過現代農業育種技術培育出的優質樹種[1-2]，目前主要包括中科1號、中科2號、中科3號、雜交構樹101、雜交構樹201等品種，各品種在保持構樹原有優良特性的同時，兼具耐貧瘠、耐刈割、營養價值高等特點，極具開發價值[3]。當前，我國諸多地區都相繼開展了雜交構樹的栽培和利用研究，而新疆地區未見相關研究報道。因此，開展雜交構樹加工研究和實際生產對本地區實現“經濟-社會-生態”協調持續發展和鄉村振興具有重要現實意義。

目前雜交構樹莖葉分離機械作業成本高，不易實現，因此其主要以全株刈割進行利用，雖全株構樹的營養價值低于葉片，但諸多研究通過發酵手段對全株構樹進行加工利用也能使育肥豬、肉牛、奶牛等表現出較好的生產性能[4-6]。雜交構樹的原料特征與苜蓿類似，表面附著乳酸菌數量較少(<1×105CFU/g)，干物質和可溶性碳水化合物含量較低，緩沖能高，直接青貯較難成功[7]，而添加外源微生物制劑尤其是乳酸菌制劑是改善青貯品質最為便捷和有效的方式[8-10]，其主要作用是通過調節青貯原料微生物區系，確保青貯營養成分的保存，保證青貯飼料的發酵品質和穩定性；同時促進多糖和纖維的轉化，提高青貯的消化率及適口性[11]。其中，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarumas)屬同型發酵乳酸菌，其生長繁殖較快，對于發酵底物利用率高、競爭力強，在發酵初期能夠產生大量乳酸，使得發酵體系迅速形成酸性環境，抑制有害微生物的生長繁殖，最大程度地保存青貯原料的營養物質[12]。

有研究報道稱，在雜交構樹葉中接種植物乳桿菌，隨著其添加量的增加青貯品質更佳[13]；或將植物乳桿菌、異型發酵乳酸菌布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、各類纖維素酶(纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶)、糖蜜聯合接種時，青貯品質最優[14]；但也有報道稱，雜交構樹青貯單獨添加糖蜜青貯品質最優[15]。那么在實際生產中，單獨接種植物乳桿菌對裹包全株雜交構樹的青貯品質有何影響？從經濟角度出發，是否添加最低劑量(1×105CFU/g)的植物乳桿菌即可達到改善青貯品質的目的？目前尚無定論。鑒于此，本研究在實際生產作業中添加低劑量植物乳桿菌，研究其對全株雜交構樹青貯發酵品質、微生物數量、瘤胃體外產氣特性及有氧暴露過程中青貯發酵品質和微生物數量的影響，為加工調制優質雜交構樹青貯飼料提供指導，同時促進本地區雜交構樹的高效加工利用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青貯原料于2020年9月份采自新疆維吾爾自治區石河子地區143團雜交構樹種植示范基地(N44°52′，E85°50′，海拔335 m)，人工種植的雜交構樹(雜交構樹201)待株高長至1.5 m左右，利用青飼料收獲機進行全株收割粉碎(圖1-A)，留茬高度為15～20 cm，粉碎長度1～2 cm。植物乳桿菌購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)。

1.2 試驗設計

試驗分為2個處理，分別為對照處理(CK處理，不添加任何菌劑)和植物乳桿菌處理(LP處理，添加1×105CFU/g植物乳桿菌)。將菌種在MRS液體培養基中培養，平板計數后確定其數量，按比例配制菌液，以鮮重為基礎進行添加。用水槍均勻地噴灑至待貯青貯原料表面(CK處理噴灑等量的水)(圖1-B)。噴灑完畢后立刻混勻進行裹包青貯(圖1-C)，原料含水量76.35%，裹包密度500 kg/m3，每個處理10包。裹包規格半徑50 cm，高100 cm，裹包膜厚度0.1 mm，裹包層數8～10層，裹包完成后放置于室外發酵60 d后開包(圖1-D)，隨后測定全株雜交構樹青貯的發酵品質、微生物數量和瘤胃體外產氣模型參數，并在開包后的第0(開包當天)、4、8、12天檢測全株雜交構樹青貯的發酵品質和微生物數量。

A：克拉斯收割機收割作業；B：噴灑菌劑；C：全株雜交構樹青貯拉伸膜裹包作業；D：全株雜交構樹青貯感官情況。A:the harvesting operation of Crass harvester;B:spraying microbial inoculum;C:the stretching film wrapping operation of whole-plant hybrid Broussonetia papyrifera silage;D:the sensory condition of whole-plant hybrid Broussonetia papyrifera silage.圖1 全株雜交構樹生產加工過程Fig.1 Production and processing process of whole-plant hybrid Broussonetia papyrifera

1.3 測定指標及方法

1.3.1 營養成分分析

全株雜交構樹鮮樣及青貯營養成分主要測定干物質(DM)、粗蛋白質(CP)、可溶性碳水化合物(WSC)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash)含量。其中，DM含量采用105 ℃烘干法測定(DHG-9620A鼓風干燥機，上海合恒儀器設備有限公司)；CP含量采用凱氏定氮法測定(Kjeltec 8400 FOSS全自動凱氏定氮儀，美國福斯公司)；WSC測定采用蒽酮比色法測定(722可見分光光度計，上海精密科學儀器有限公司)；NDF和ADF含量采用范氏洗滌纖法測定(自制纖維袋，專利號：ZL201621382211.7和ZL201621382214.0)；EE含量采用索氏提取法測定(玻璃索氏提取器，上海壘固有限公司)；Ash含量采用550 ℃灼燒法測定(XL-3000型高效節能智能一體馬弗爐，上海合恒儀器設備有限公司)[16]。

1.3.2 發酵特征指標分析

發酵特性指標主要測定pH、氨態氮(NH3-N)、乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propanoic acid，PA)、丁酸(butyric acid，BA)。pH用酸度計測定(PHSJ3F酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司)；LA、AA、PA、BA含量采用液相色譜法(Agilent1260高效液相色譜儀HPLC，美國安捷倫科技公司)測定；NH3-N含量采用苯酚-次氯酸比色法測定[16-17]。

1.3.3 微生物數量分析

微生物主要測定好氧細菌(aerobic bacteria，AB)、乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)、酵母菌(yeast)和霉菌(mold)數量。AB、LAB、酵母菌、霉菌數量分別采用營養瓊脂培養基、MRS培養基、麥芽糖浸粉瓊脂培養基和高鹽察氏培養基進行培養，所有培養基均購自北京路橋集團有限公司，培養結束后進行平板計數，并計算微生物數量[18]。

1.3.4 綿羊瘤胃體外產氣分析

選擇3只健康、體重接近的哈薩克羊作為瘤胃液供體。試驗飼糧由200 g精料(玉米51.0、麩皮24.0%、豆粕18.0%、碳酸氫鈣2.5%、預混料2.0%、尿素1.5%、食鹽1.0%)和1.8 kg青貯玉米組成，每天晨飼(08:00)，自由飲水，持續飼喂1個月。飼喂結束后，在晨飼前宰殺采集瘤胃液，采集時將瘤胃液以4層紗布初步過濾到預熱過的保溫瓶中，迅速帶回實驗室處理，再次用4層紗布過濾瘤胃液后棄去過濾后的殘渣，置于39 ℃水浴鍋中待使用。參照Menke等[19]的方法配制人工瘤胃液，將人工瘤胃液與瘤胃液以2∶1的比例進行混合，用分液器分別向所有培養管注入30 mL混合培養液，將培養管進液端豎直向上排盡管內氣體，用止水夾夾住前端硅橡膠管，并記錄相應的初始刻度值(mL)。將培養管迅速放入已預熱(39 ℃)的水浴箱中，待加液完畢后所有培養管同時轉入人工瘤胃培養箱中進行培養。按照盧德勛等[20]的方法測定第0(初始發酵時)、2、4、6、8、10、12、18、24、30、36、42、48 h的產氣量，同時分析有機物消化率(OMD)和代謝能(ME)，計算公式如下：

OMD=0.986×GP+0.060 6×CP+11.03；ME=0.1639×GP+0.007 9×CP+0.023 9×EE+0.04。

式中：GP為24 h的產氣量(mL)；CP為粗蛋白質含量(%)；EE為粗脂肪含量(%)[21]。

1.4 數據處理與分析

試驗數據采用SPSS 20.0統計軟件進行單因素方差分析，差異顯著者用Duncan氏法進行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。瘤胃體外產氣模型參數采用DPS V7.05軟件中一元非線性回歸模型(Gompertz模型)進行計算。采用Origin 2017軟件進行繪圖。計算公式[22]如下：

X2=C1×exp[-C2×exp(-C3×X1)]。

式中：X2為產氣量(mL)；C1為理論最大產氣量(mL)；C2為產氣速率(mL/h)；C3為產氣延滯時間(h)；X1為體外培養時間(h)。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌對全株雜交構樹青貯發酵品質及微生物數量的影響

由表1可知，發酵60 d時，LP和CK處理的pH和CP、WSC、NDF、ADF含量及酵母菌、霉菌、AB數量均顯著低于青貯原料(P<0.05)，NH3-N、Ash、LA、AA含量及LAB數量均顯著高于青貯原料(P<0.05)，DM、EE含量與青貯原料差異不顯著(P>0.05)。發酵60 d時，LP處理的pH、ADF含量、AB數量顯著低于CK處理(P<0.05)，而LA含量、LAB數量顯著高于CK處理(P<0.05)，PA、BA在發酵結束時均未檢測出。CK處理和LP處理之間NH3-N、DM、Ash、CP、WSC、NDF、AA含量及酵母菌、霉菌數量均差異不顯著(P>0.05)。

表1 植物乳桿菌對雜交構樹發酵品質及微生物數量情況的影響Table 1 Effects of Lactobacillus plantarum on fermentation quality and microbial quantity of whole-plant hybrid Broussonetia papyrifera silage

2.2 植物乳桿菌對全株雜交構樹青貯產氣量、有機物消化率、代謝能和產氣模型參數的影響

如圖2所示，隨著體外產氣時間的延長，各處理產氣量逐漸升高，在48 h達到頂峰。在發酵的0～48 h，各處理在不同時間點的產氣量均差異不顯著(P>0.05)。

由表2可知，LP處理的OMD、產氣速率顯著高于青貯原料和CK處理(P<0.05)；青貯原料、CK處理和LP處理之間理論最大產氣量、產氣延滯時間和ME均差異不顯著(P>0.05)。各處理產氣模型為：

表2 植物乳桿菌對雜交構樹青貯有機物消化率、代謝能和產氣模型參數的影響Table 2 Effects of Lactobacillus plantarum on OMD,ME and gas production model parameters of Broussonetia papyrifera silage

青貯原料，X2=72.01×exp[-1.08×exp(-0.18×X1)](F=329.89，P=0.001，R2=0.99)；CK處理，X2=72.22×exp[-1.03×exp(-0.17×X1)](F=286.93，P=0.001，R2=0.98)；LP處理，X2=72.44×exp[-1.11×exp(-0.16×X1)](F=343.69，P=0.001，R2=0.99)。

式中：X2為產氣量(mL)；X1為體外培養時間(h)。

數據點無標注表示差異不顯著(P>0.05)。Value points with no label mean no significant difference (P>0.05).圖2 各處理0～48 h體外產氣規律Fig.2 Gas production in vitro of 0 to 48 h in each treatment

2.3 植物乳桿菌對開包后全株雜交構樹青貯發酵品質和微生物數量的影響

由表3可知，LP和CK處理的pH、NH3-N含量及4類主要微生物(AB、LAB、酵母菌、霉菌)數量在開包后逐漸增加，AA、PA含量呈先上升后下降的趨勢，僅LA含量隨開包后時間的延長逐漸減少。其中，LP處理的pH在開包后第0、4、8、12天顯著低于CK處理(P<0.05)。LP處理的LA含量在開包后第0天顯著高于CK處理(P<0.05)，AA含量在開包后第8天顯著高于CK處理(P<0.05)。LP處理的LAB數量在開包后第0、8天顯著高于CK處理(P<0.05)，而AB數量則顯著低于CK處理(P<0.05)。BA在開包后未檢測出。CK處理和LP處理之間開包后NH3-N、PA含量和酵母菌、霉菌數量差異均不顯著(P>0.05)。

表3 植物乳桿菌對開包后雜交構樹青貯發酵品質和微生物數量的影響Table 3 Effects of Lactobacillus plantarum on fermentation quality and microbial quantity of whole-plant hybrid Broussonetia papyrifera silage after bags opened

3 討 論

3.1 植物乳桿菌對雜交構樹青貯發酵品質和微生物數量的影響

青貯飼料干物質的損失始于細胞的呼吸作用，需氧微生物利用碳水化合物產生水、熱量和二氧化碳，破壞分解養分[14]。本研究中，接種低劑量植物乳桿菌未顯著影響發酵底物干物質含量，即一定程度減少了發酵底物營養物質損失。青貯飼料中CP含量的變化與pH高低密切相關[23]。本研究開包時LP處理pH顯著低于CK處理，但CK處理和LP處理之間CP和NH3-N含量均無顯著差異，這與以往研究結果[13]相同，表明接種植物乳桿菌未顯著影響發酵體系蛋白質的腐敗。LP和CK處理的CP和NH3-N含量較初始發酵時有顯著變化，其原因可能由于梭菌(Clostridiumspp.)未被完全抑制，導致蛋白質分解所致[6]。另外，本研究LP和CK處理的WSC含量較初始發酵時顯著下降，其主要原因為青貯體系微生物對底物糖類物質的利用所致[4]；LA、AA含量較初始發酵時顯著上升，這說明雜交構樹表面附著乳酸菌可基本滿足厭氧發酵條件；而LP處理的LA含量顯著高于CK處理，且CK處理和LP處理之間WSC含量差異不顯著，這說明青貯中被消耗的WSC主要被植物乳桿菌等同型發酵乳酸菌用以產生LA[24]，且低劑量的植物乳桿菌接種可消耗更少WSC產生LA。

以往研究表明，添加劑對青貯NDF和ADF含量均有不同程度改善效果[25-26]，主要由于大多數添加劑如LAB、纖維素酶、糖蜜等不僅能為飼料中的微生物提供底物，同時能加速其利用底物，能快速產生豐富的具有溶解纖維活性的微生物酶，降解植物中NDF和ADF[27]。這與本研究的結果一致。本研究中，LP和CK處理的NDF和ADF含量較初始發酵時顯著降低，LP處理的ADF含量顯著低于CK處理，說明接種低劑量植物乳桿菌即可顯著降低ADF含量。EE、Ash含量較發酵前有所升高，原因可能是由于水分、營養物質等的損失，造成青貯底物總質量下降，使得這些成分的比例有略微升高。此外，發酵60 d時，酵母菌、霉菌、AB數量均較初始發酵時顯著降低，僅LAB數量顯著升高，且LP處理的LAB數量顯著高于CK處理，這說明低劑量植物乳桿菌的接種即可達到提高發酵體系LAB數量的目的，以促使LA和AA的生成，迅速形成酸性環境和厭氧環境，抑制好氧致腐微生物的生長繁殖[11]。發酵結束時未檢測到PA與BA，這是由于發酵底物充足，LAB占主導地位形成了較低pH環境抑制了有害微生物的增殖[28]，同時也可能與構樹本身具有黃酮類物質，而黃酮類物質具有抑菌作用有關[29]。

3.2 植物乳桿菌對雜交構樹青貯瘤胃體外產氣特性的影響

瘤胃體外產氣法可有效地通過飼料降解過程中的產氣量較準確地評價飼料在動物體內的消化率，是反映青貯飼用價值的重要體現[11,18]。本研究中接種低劑量植物乳桿菌即能使得OMD顯著提高；此外，LP處理的產氣速率顯著高于CK處理，這說明植物乳桿菌的接種有助于加速瘤胃微生物的活動，從而改善消化能力，在泌乳奶牛生產中也得到相似結論[6]。飼料在瘤胃體中發酵時產氣的來源主要是有機物中的CP、EE、NDF、WSC等，這些物質在瘤胃中被分解代謝從而產生CO2、CH4等氣體后引起反應空間的體積變化[30]。全株雜交構樹CP、EE、NDF含量均較高，WSC含量低，因此在本研究中，隨著發酵時間的延長，各處理產氣量逐漸增加，這與部分學者的研究結果[31-32]相一致，主要反映出發酵底物中營養物質的消化和瘤胃微生物代謝情況。

3.3 植物乳桿菌對開包后全株雜交構樹青貯發酵品質和微生物數量的影響

有氧暴露后，pH的增加是衡量青貯飼料是否變質的一個重要指標[33]。本研究中pH在發酵結束和開包過程中始終未降到優質青貯的標準(pH<4.4)，其原因主要由于青貯體系含水量和緩沖能高[14]。此外，本研究中所有處理的pH均隨開包時間的延長逐漸增加，而接種低劑量植物乳桿菌可維持pH在較低水平，這與前人研究結果[34-35]類似，主要由于植物乳桿菌在發酵過程中產生較多LA，開包后雖然有所損失，但仍可以維持較低pH環境[36]；此外，可能由于植物乳桿菌的接種促進了開包后異型發酵乳酸菌產AA的含量。有氧暴露后，使得NH3-N含量有所增加，主要由于pH升高，不良微生物開始活動，氨基酸被分解成氨、硫化氫和胺類，降解率增大[37]，而接種低劑量的植物乳桿菌可減少NH3-N的產生，這與以往研究結果[33,38]一致。青貯中有機酸含量的變化反映碳水化合物的轉化情況。本研究中LA含量隨開包時間的延長逐漸減少，而AA含量隨開包時間的延長呈現先上升后下降的趨勢，其原因可能是在有氧暴露期間LA易被酵母菌利用，導致青貯的二次發酵；另外，青貯本身附著的異型發酵乳酸菌分解LA產生AA，在一定程度上維持雜交構樹青貯中低pH水平[39]。有氧暴露后，無論是否添加植物乳桿菌，發酵體系的PA含量逐漸增加，其原因可能為有氧環境使好氧微生物的活動性增強，其利用青貯發酵底物產生水、CO2和熱量[40]，從而產生少量PA。

青貯發酵過程中乳酸菌起主導作用。本研究發現雜交構樹青貯中接種低劑量的植物乳桿菌有助于增加開包過程中LAB數量，維持其繼續利用底物進行生長繁殖，而有氧環境使得LAB生長速度減緩，這與以往研究結果[24]。相同。由于植物乳桿菌產生的能夠抑制酵母菌、霉菌等生長繁殖的短鏈脂肪酸的數量非常少，導致開包后酵母菌、霉菌的數量逐漸增加，這與以往研究結果[41]相同，其也認為好氧微生物數量的增長主要由于LA源為同化型酵母菌提供了生長繁殖所需的底物。開包過程中，無論植物乳桿菌添加與否，AB數量都有不同程度的增加，主要由于pH的升高為好氧微生物創造了有利的環境，同時好氧微生物直接接觸青貯底物，造成青貯營養成分的進一步損失[24]。

4 結 論

在實際裹包作業中接種1×105CFU/g植物乳桿菌可提高全株雜交構樹青貯發酵中乳酸菌數量和乳酸含量，降低pH，抑制好氧細菌增殖，從而利于青貯營養物質的有效保存；且可通過促進開包8 d內乳酸菌的生長和乙酸的生成，以維持酸性環境，減少好氧細菌生長，延緩二次發酵；同時可顯著降低酸性洗滌纖維含量，提高有機物消化率。