不同剩余采食量下灘羊能量代謝分析

張 倩 王俊奎 羅 芳 和東遷 陳麗堯 盧童童 吳少飛 張瑞雪 陶金忠

(寧夏大學農學院，銀川 750021)

剩余采食量(RFI)是衡量反芻動物飼料轉化率的主要指標，是指畜禽實際采食量和預期采食量的差值，可以用來有效評價動物飼料轉化率、群體代謝水平以及選育標準[1]。關于RFI的相關研究涉及到諸多方面，如干物質采食量(DMI)、飼料消化率、機體合成與分解代謝、運動量以及體溫調節等[2]。Patience[3]發現育成豬的每日干物質采食量中34%的能量用于機體維持需要。從節約飼養成本的角度來看，降低動物的維持需要，能夠提高飼料的轉化效率。Arthur等[4]和Richardson等[5]用超聲波掃描技術測定了安格斯牛皮下脂肪厚度，結果發現低RFI的個體體脂含量更低，體蛋白質含量更髙，且背膘厚度與RFI顯著相關。RFI的高低反映了動物的飼料利用率，即RFI越高的個體，其飼料轉化效率越低、代謝越快、采食次數越多、活動量越大[6-7]。能量代謝的途徑是從葡萄糖開始，由己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸酶介導生成葡萄糖-6-磷酸[8]，再由磷酸己糖異構酶的催化形成果糖-6-磷酸，之后生成丙酮酸進入三羧酸循環(TCA)供能。飼料轉化效率和體內能量代謝是否相關，目前還不清楚。

反芻動物的RFI是根據個體體重和生長[平均日增重(ADG)]的需求估算的。RFI在表型上與體重和ADG無關，但與采食量有關，因此對RFI的表型測定是一項亟待解決的問題，因為它需要測量每個個體2～3個月的采食量，需要投入巨大的時間、金錢、物力和人力，并且受到記錄方法和設備儀器等的限制[9]。

代謝組學是一種運用高通量、高靈敏度的現代分析技術[10]，是以相對分子質量在1 000以下的小分子代謝物為研究對象，包括內源性和外源性分子，可以反映個體、器官組織及細胞代謝所產生的小分子代謝圖譜，能更為直接地反映當前代謝的復雜網絡，將代謝途徑同生物機制相聯系，從而對疾病的診斷、發病機制的研究以及疾病的治療和預防提供新的技術和手段[11]。代謝組學研究揭示的不僅僅是遺傳學或基因組學提供的信息，更揭示了動物遺傳學和生理表型之間的關系[12]。Clemmons等[13]研究表明，泛酸鹽、谷氨酰胺、肉堿和半胱氨酸等差異代謝物與黑安格斯的營養代謝密切相關，可以以泛酸鹽、谷氨酰胺、肉堿和半胱氨酸等差異代謝物作為生物標志物來解釋黑安格斯的RFI。運用代謝組學研究反芻動物RFI，不但可以提高反芻動物的飼料轉化效率，還可以識別血漿中的潛在生物標志物，但目前在羊上沒有看到相關的研究。因此，本試驗擬采用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)技術分析不同RFI下灘羊血漿中能量代謝相關代謝物的變化，篩選出對灘羊RFI有影響作用的差異代謝物，以探究在不同RFI下灘羊能量代謝情況，并為使用差異代謝物作為標志性物質預測RFI提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

于寧夏某灘羊保種場選用345只[公羊163只、母羊182只(在飼養過程中會淘汰生病、體重不合格的羊只)]具有詳細系譜信息、出生日期相近、生長狀況良好、體重[(30±5)kg]相近的6月齡灘羊，統一飼養管理，每天早晚各投喂1次顆粒料，控制采食時間范圍，自由飲水。試驗分為過渡期15 d，預試期10 d，正試期50 d。準確記錄每只羊每天的剩料量，并于正試期第1、10、20、30、40、50天晨飼前空腹稱重，定期對圈舍進行清掃消毒。

1.2 試驗分組

飼養階段結束后，利用Koch等[14]提出的預測RFI模型計算個體全期RFI值(第1～50天的RFI)，按照群體RFI的平均值(mean)和標準差(SD)將試驗羊群分成極低RFI組(RFImean+0.5SD，16只)，采集血液，其中采樣灘羊的RFI情況如表1所示。然后按照性別和RFI高低將所采集的灘羊血液樣品分為3組(極低RFI母羊vs極高RFI母羊組、極低RFI公羊vs極高RFI公羊組和極低RFI羊vs極高RFI羊組)。

表1 采樣灘羊的RFI數據Table 1 RFI data of sampling Tan sheep

1.3 樣品采集

飼養試驗結束后，對所選的極低和極高RFI灘羊進行頸部采血，將10 mL血液置于抗凝管(含肝素鈉)中。對采集后血液樣品進行3 000 r/min離心10 min，將上層血漿分裝，保存于-80 ℃冰箱。

1.4 儀器與試劑

表2 所需試劑Table 2 Required reagents

1.5 樣品預處理

因部分樣品發生溶血現象，故共檢測到26份血漿樣品，其中公羊、母羊各檢測13份。將血漿樣品從-80 ℃冰箱中取出，在冰上解凍后，渦旋10 s混勻，4 ℃、3 000 r/min離心5 min；取上清液50 μL加入到對應的已編號的離心管中，加入150 μL純甲醇內標提取液；渦旋5 min后4 ℃、12 000 r/min離心10 min；取140 μL上清液裝入對應進樣瓶內襯管中，用于LC-MS/MS分析。

1.6 LC-MS/MS分析

電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)溫度450 ℃，質譜電壓5 500 V(正)、-4 500 V(負)，離子源氣體Ⅰ(GSⅠ)40 psi，氣體Ⅱ(GSⅡ)55 psi，氣簾氣(curtain gas，CUR)35 psi，碰撞誘導電離(collision-activated dissociation，CAD)參數設置為中。在三重四極桿(QTRAP)中，每個離子對是根據優化的去簇電壓(declustering potential，DP)和碰撞能(collision energy，CE)進行掃描檢測[15]。

1.7 數據處理與分析

將質譜檢測的原始數據在R Studio軟件平臺，采用XCMS軟件對數據進行特征峰提取，峰對齊，保留時間(retention time，RT)校正以及數據過濾，提取峰面積。將經XCMS軟件提取的數據進行完整性檢查，對組內缺失值進行刪除或補充，刪除極值及組內缺失值超過50%的代謝物離子峰，數據以內標校正后進行總峰面積歸一化處理，以確保各樣品間和代謝物之間的可平行比較。對數據進行總峰面積歸一化后，使用SIMCA-P 14.1軟件中對數據進行pareto-scaling處理后，進行多元統計分析，包括主成分分析(principal component analysis,PCA)和正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA)；同時，在建模過程中對模型數據進行置換檢驗(permutation test)并計算變量投影重要度(variable important for the projection，VIP)。在此基礎上對數據進行單變量統計分析，包括Student’st檢驗和變異倍數(fold change，FC)分析，根據各代謝物P值和FC值篩選差異代謝物。

2 結果與分析

2.1 灘羊血漿樣品質控(QC)分析

將QC樣品在正、負離子檢測模式下的質譜總離子流(TIC)圖進行譜圖疊加比較(圖1)，結果表明，代謝物檢測總離子流的曲線重疊性高，即保留時間和峰強度均一致，表明質譜對同一樣品不同時間檢測時，信號穩定性較好。整個試驗過程中儀器誤差引起的變異較小，數據質量可靠。

圖1 QC樣品在正離子(A)和負離子模式(B)下TIC重疊圖譜Fig.1 TIC overlapping patterns of QC samples in positive (A)and negative ion modes (B)

2.2 多元統計分析

PCA模型參數R2X、Q2分別表示模型對X變量的解釋率和模型預測能力。通過對不同組樣品數據進行PCA(圖2)可知，極低RFI母羊vs極高RFI母羊組、極低RFI公羊vs極高RFI公羊組、極低RFI羊vs極高RFI羊組的模型解釋率(R2X)分別為0.235、0.351、0.145，聚類較好，有一定的分離趨勢，說明代謝物檢測系統的穩定性較好。

ELF與EHF分別表示極低RFI母羊與極高RFI母羊，ELM與EHM分別表示極低RFI公羊與極高RFI公羊，EL與EH分別表示極低RFI羊與極高RFI羊。下圖同。圖A、B、C分別為極低RFI母羊vs極高RFI母羊組、極低RFI公羊vs極高RFI公羊組和極低RFI羊vs極高RFI羊組PCA得分圖。ELF and EHF denoted very low RFI ewes and very high RFI ewes,respectively;ELM and EHM denoted very low RFI rams and very high RFI rams,respectively;EL and EH denoted very low RFI sheep and very high RFI sheep,respectively.The same as below.Figures A,B and C represented PCA score plots of very low RFI ewes vs very high RFI ewes group,very low RFI rams vs very high RFI rams group and very low RFI sheep vs very high RFI sheep group,respectively.圖2 3組灘羊PCA得分圖Fig.2 PCA score plots of Tan sheep in three groups

為了提高模型的有效性，直接區分組間變異進行了OPLS-DA，結果見圖3。在OPLS-DA得分圖下，各組樣品區分良好。由置換檢驗模型(圖4)可知，極低RFI母羊vs極高RFI母羊組Q2截距=-0.432(Q2截距<0)，極低RFI公羊vs極高RFI公羊組Q2截距=-0.346(Q2截距<0)，極低RFI羊vs極高RFI羊組Q2截距=-0.516(Q2截距<0)，表明OPLS-DA模型未過度擬合，說明各樣品間存在差異。

圖A、B、C分別為極低RFI母羊vs極高RFI母羊組、極低RFI公羊vs極高RFI公羊組和極低RFI羊vs極高RFI羊組OPLS-DA得分圖。Figures A,B and C represented OPLS-DA score plots of very low RFI ewes vs very high RFI ewes group,very low RFI rams vs very high RFI rams group and very low RFI sheep vs very high RFI sheep group,respectively.圖3 3組灘羊OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score plots of Tan sheep in three groups

R2 intercept和Q2 intercept表示R2與Q2回歸直線與Y軸的截距，Q2 intercept<0表明OPLS-DA模型未過度擬合。橫坐標代表隨機分組的Y與原始分組的Y的相關性，縱坐標代表R2與Q2得分。圖A、B、C分別為極低RFI母羊vs極高RFI母羊組、極低RFI公羊vs極高RFI公羊組和極低RFI羊vs極高RFI羊組置換檢驗分析圖。R2 intercept and Q2 intercept represented the Y-intercept of R2 and Q2 regression lines.Q2 intercept<0 indicated that the OPLS-DA model was not overfitting.The abaxial axis represented the correlation between the random group Y and the original group Y,and the vertical axis represented the scores of R2 and Q2.Figures A,B and C represented replacement test analysis diagrams of very low RFI ewes vs very high RFI ewes group,very low RFI rams vs very high RFI rams group and very low RFI sheep vs very high RFI sheep group,respectively.圖4 3組灘羊OPLS-DA置換檢驗Fig.4 OPLS-DA replacement test of Tan sheep in three groups

2.3 差異代謝物篩選

本試驗結合多元統計分析，利用OPLS-DA計算所得VIP，以VIP>1、P<0.05及FC>1.30或<0.77為標準篩選差異代謝物，并對其進行鑒定，結果如表3所示。本試驗在極低RFI公羊vs極高RFI公羊組中共篩選鑒定出2種差異代謝物，為D-木酮糖-5-磷酸和L-鳥氨酸鹽酸鹽，均下調；在極低RFI母羊vs極高RFI母羊組中共篩選鑒定出4種差異代謝物，其中3種上調，上調物質分別為腺嘌呤、檸檬酸、L-天冬氨酸，1種下調，下調物質為L-瓜氨酸；在極低RFI羊vs極高RFI羊組中共篩選鑒定出4種差異代謝物，其中2種上調，上調物質分別為腺嘌呤、檸檬酸，2種下調，下調物質分別為L-蘇氨酸、D-木酮糖-5-磷酸。

表3 已鑒定差異代謝物Table 3 Identified differential metabolites

2.4 差異代謝物聚類分析

將篩選出的差異代謝物利用Metabo Analyst 5.0在線分析平臺進行層次聚類，結果如圖5所示。結果表明，多數樣品能很好地聚集在一起，但個別樣品仍然存在分離情況，表明組內有差異，但具有相似變化的代謝物可以聚集在同一族內。因此，進一步采用受試者工作特征(ROC)曲線對篩選出的差異代謝物進行進一步分析，篩選出ROC曲線下面積(AUC)>0.90的差異代謝物。圖6顯示，極低RFI母羊vs極高RFI母羊組中檸檬酸AUC達到0.90以上，P<0.05，說明檸檬酸是識別母羊組的主要指標，但不能作為識別灘羊整體的主要指標。利用液相色譜-四級桿-飛行時間質譜(LC-Q/TOF-MS)峰強箱式圖對極低RFI母羊vs極高RFI母羊組的檸檬酸含量進行進一步分析，結果如圖7所示，檸檬酸能明顯分開極高RFI母羊和極低RFI母羊。

圖A、B、C分別為極低RFI母羊vs極高RFI母羊組、極低RFI公羊vs極高RFI公羊組和極低RFI羊vs極高RFI羊組聚類熱圖。Figures A,B and C represented clustering heat maps of very low RFI ewes vs very high RFI ewes group,very low RFI rams vs very high RFI rams group,and very low RFI sheep vs very high RFI sheep group,respectively.圖5 3組灘羊差異代謝物聚類熱圖Fig.5 Clustering heat maps of differential metabolites of Tan sheep in three groups

圖A、B依次為極低RFI羊vs極高RFI羊組和極低RFI母羊vs極高RFI母羊組ROC曲線。AUC：ROC曲線下面積。The ROC curves of very low RFI sheep vs very high RFI sheep group and very low RFI ewes vs very high RFI ewes group were shown successively in figures A and B.AUC:area under curve.圖6 極低RFI羊vs極高RFI羊組和極低RFI母羊vs極高RFI母羊組ROC曲線Fig.6 ROC curves of very low RFI sheep vs very high RFI sheep group and very low RFI ewes vs very high RFI ewes group

圖7 極低RFI母羊vs極高RFI母羊組峰強度箱式圖Fig.7 Peak intensity boxplot of very low RFI ewe vs very high RFI ewe group

3 討 論

Elolimy等[16]研究結果表明性別的差異會影響瘤胃上皮基因溶質載體家族9成員A1(SLC9A1)、缺氧誘導因子1亞單位A(HIF1A)和烏頭酸酶2(ACO2)的表達，并且公牛相較于母牛來說mRNA的表達更高，而羥基丁酸脫氫酶1(BDH1)、溶質載體家族9成員A2(SLC9A2)和丙酮酸脫氫酶E1亞單位A1(PDHA1)的表達更低；盧果等[17]通過代謝組學的方法研究36組人尿液樣品，研究表明由于性別的不同從而分離出不同的生物標志物，女性尿液中檸檬酸的含量顯著高于男性；陳建軍[18]研究結果表明抑郁癥診斷由于性別差異標志物也有所差異，甘醇酸(glycolate)、次黃嘌呤(hypoxanthine)可作為女性潛在的生物標志物，酪氨酸(tyrosine)、檸檬酸鹽(citrate)和琥珀酸鹽(succinate)可作為男性潛在的生物標志物，為篩選抑郁癥性別差異性診斷標示物提供了進一步研究數據；更有研究表明性別差異會影響藥物代謝[19]。本試驗利用靶向代謝組學的方法對3組灘羊進行血漿代謝物分析，在極低RFI母羊vs極高RFI母羊組中，共篩選出4種差異代謝物，分別為腺嘌呤、檸檬酸、L-天冬氨酸和L-瓜氨酸；而在極低RFI公羊vs極高RFI公羊組中，共篩選出2種差異代謝物，分別為L-鳥氨酸鹽酸鹽和D-木酮糖-5-磷酸，結果顯示，公、母羊血漿代謝物種類不同是由于性別因素造成的。因此，性別的差異可能會導致血漿代謝物的差異。

在能量代謝過程中檸檬酸是三羧酸循環中的重要物質。Kim等[20]研究發現，檸檬酸可顯著降低高脂飲食小鼠肝臟中脂肪的含量。Cheng等[21]研究發現，人類連續7 d服用500 mg/d劑量的檸檬酸，可顯著提高骨骼肌中糖原合成率。此外，檸檬酸還可用于脂肪和膽固醇合成，有利于物質消化和營養吸收，維持機體生長發育[22]。本研究發現極低RFI母羊vs極高RFI母羊組和極低RFI羊vs極高RFI羊組篩選的差異代謝物中檸檬酸均上調，即檸檬酸表達量增加，進入能量代謝途徑的相關物質含量也相應升高，能量轉化的效率也不斷增加，釋放更多的能量。低RFI灘羊檸檬酸表達量升高，因此低RFI灘羊產生的能量相較于高RFI灘羊更多。這說明低RFI動物在生長潛力方面優于高RFI動物。在本研究中極低RFI母羊vs極高RFI母羊組檸檬酸的AUC大于0.9，說明檸檬酸是識別母羊組的主要指標，有望成為母灘羊RFI的生物標志物。

腺嘌呤核苷酸(三羧酸循環過程中的輔助因子，不在代謝網絡圖里表現)是機體重要的能量物質[23]，L-天冬氨酸是生成草酰乙酸的前體物質。腺嘌呤和L-天冬氨酸在極低RFI母羊vs極高RFI母羊組中均上調。腺嘌呤表達量增加，意味著整個能量代謝的進程加快，釋放更多的能量；L-天冬氨酸表達量增加，能夠提高整個代謝途徑中能量的轉化效率，影響著整個能量代謝進程。

瓜氨酸同組氨酸、脯氨酸、鳥氨酸和精氨酸一樣都是能量通路中轉化為谷氨酸的前體物質，本試驗極低RFI母羊vs極高RFI母羊組中L-瓜氨酸下調，雖然對谷氨酸的合成代謝有影響作用，但無法直接影響整個能量代謝過程。因腺嘌呤、L-天冬氨酸和瓜氨酸的AUC均小于檸檬酸，因此不能作為影響母羊組的生物標志物。

D-木酮糖-5-磷酸是磷酸戊糖代謝途徑中的代謝物之一，通過磷酸戊糖途徑生成葡萄糖進入三羧酸循環。本研究發現在極低RFI公羊vs極高RFI公羊組中D-木酮糖-5-磷酸下調。D-木酮糖-5-磷酸下調是由于核酮糖-5-磷酸在生成D-木酮糖-5-磷酸的同時生成了核糖-5-磷酸(圖8)，D-木酮糖-5-磷酸進入磷酸戊糖途徑的含量減少，但核糖-5-磷酸是用于合成核苷酸的主要前體物，雖然D-木酮糖-5-磷酸表達量的下降并不能直接影響到能量轉化效率，但對磷酸戊糖途徑有一定的影響。L-鳥氨酸鹽酸鹽下調，與上述母羊L-瓜氨酸下調表述一致。但由于D-木酮糖-5-磷酸和L-鳥氨酸鹽酸的AUC均較低，故不能用作公羊組的生物標志物。

圖8 差異代謝物代謝網絡圖Fig.8 Metabolic network map of differential metabolites

4 結 論

本研究發現不同RFI公與母灘羊的血漿代謝物種類不同，可能是由于性別因素造成的，因此性別也會影響灘羊能量代謝。在極低RFI母羊vs極高RFI母羊組和極低RFI羊vs極高RFI羊組中，極低RFI母羊和極低RFI羊的檸檬酸均上調，而檸檬酸作為三羧酸循環的關鍵代謝物，可成為影響母灘羊RFI的重要生物標志物。