補飼精料對冷季放牧牦牛生長性能、瘤胃發酵及菌群結構的影響

王書祥 戴東文* 楊英魁 王 迅 柴沙駝**

(1.青海大學畜牧獸醫科學院，西寧 810016；2.青海省高原放牧家畜營養與飼料科學重點實驗室，西寧 810016；3.青海省牦牛工程技術研究中心，西寧 810016)

牦牛主要棲息在青藏高原及周圍地區，是青藏高原的優勢畜種，也是當地牧民重要的生產生活資料[1]。由于青藏高原獨特的地理環境，一年只有“冷季”與“暖季”之分，冷季長達7～9個月，牧草產量與營養水平不能滿足牦牛營養需要量，導致牦牛掉膘嚴重，養殖效益低下[2-3]。目前，已有大量研究表明，冷季補飼能夠提高放牧牦牛的生長性能，但是鮮有涉及補飼對其瘤胃發酵及菌群結構影響的研究[4-5]，且已有研究表明瘤胃微生物與反芻動物的生長發育有密切的聯系[6-7]。瘤胃是反芻動物消化飼糧的重要場所，其含有大量微生物，包括細菌、真菌、原蟲和古生菌等[8]。影響反芻動物瘤胃菌群結構組成的因素除了動物品種、年齡、生理階段等內部因素外，最主要的外部因素就是飼糧營養水平[9]。周力等[10]研究發現，補飼降低了藏羔羊瘤胃細菌多樣性與豐富度，但提高了相關淀粉降解菌的相對豐度。Mao等[11]研究表明，隨著飼糧精粗比的提高，奶牛瘤胃液總揮發性脂肪酸(TVFA)濃度和淀粉降解菌的相對豐度呈上升趨勢，而瘤胃液pH和纖維降解菌相對豐度呈下降趨勢。由此可見，通過調控飼糧營養水平，能夠改善瘤胃發酵，提高營養物質的利用率，進而提高生產性能。因此，本試驗擬通過16S rDNA高通量測序技術，從微生物角度闡述補飼精料對冷季放牧牦牛生長性能、瘤胃發酵和菌群結構的影響，以期為青藏高原冷季放牧牦牛精準補飼提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗于2019年11月至2020年2月在青海省貴南縣老扎西牧場的冬季草場進行。該草場屬于高寒草甸草地，優勢種有小嵩草、高山嵩草、矮嵩草、線葉嵩草等。

1.2 試驗動物與試驗設計

選取3周歲左右、體重[(204.90±10.65)kg]相近、體況良好的公牦牛24頭，隨機分為2組(每組12頭)：對照組僅放牧，不補飼；試驗組在放牧的基礎上每頭每天精料補飼量為體重的1.2%。試驗期為100 d，其中預試期10 d，正試期90 d。

1.3 飼養管理與試驗飼糧

所有試驗牦牛在同一草場放牧，設置2個面積大小一樣的圍欄小區，每個圍欄小區的面積大小約為300畝(1畝≈667 m2)，08:00出牧，18:00收牧，試驗組在出牧前和收牧后分2次進行補飼，所有試驗牦牛自由飲水。補飼精料參照我國《肉牛飼養標準》(NY/T 815—2004)，結合放牧牦牛采食量[12]配制。牧草營養水平、精料組成及營養水平見表1。

表1 牧草營養水平、精料組成及營養水平(干物質基礎)Table 1 Pasture nutrient levels,composition and nutrient levels of the concentrate (DM basis) %

1.4 樣品采集

1.4.1 牧草樣品

在試驗中期，觀察試驗耗牛所吃的牧草，然后驅離試驗牦牛采集該區域牧草樣品，采集方法采用模擬采摘法。在同一草場隨機選取10個1 m×1 m樣方，齊地面刈割取樣，65 ℃烘干后計算地上生物量，經計算牧草地上生物量為71.46 g/m2。

1.4.2 瘤胃液樣品

在正試期第90天，參考Geishauser[13]的方法，晨飼前采用胃管式采樣器采集瘤胃液150 mL，4層紗布過濾后立即測定pH，剩余的瘤胃液樣品分裝至15 mL離心管中，置于-80 ℃凍存備用。

1.5 指標測定與方法

1.5.1 牧草及精料營養成分的測定

牧草、精料中的干物質(DM)含量采用GB/T 6435—2014中的方法測定，粗蛋白質(CP)含量采用GB/T 6432—2018中的方法測定，鈣(Ca)含量采用GB/T 6436—2002中的方法測定，磷(P)含量采用按照GB/T 6437—2002中的方法測定，中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)含量采用Van Soest等[14]的方法測定，所用儀器為ANKOM 200i半自動纖維分析儀。

1.5.2 生長性能的測定

正試期開始前和結束時于晨飼前連續2 d空腹稱重，計算總增重(TWG)、平均日増重(ADG)。

1.5.3 瘤胃發酵參數的測定

使用HANNA HI221型臺式酸度計測定瘤胃液pH，測定前對該酸度計使用相應標準液進行校正；參照馮宗慈等[15]改進的比色法測定瘤胃液氨態氮(NH3-N)濃度，儀器為紫外可見分光光度計(TU-1810)，預熱30 min，在波長625 nm處測定溶液吸光度(OD)值，利用標準曲線確定樣品的氨態氮濃度；瘤胃液微生物蛋白(MCP)濃度采用考馬斯亮藍法[16]在595 nm波長處比色測定(試劑盒購于南京建成生物工程研究所)；瘤胃液揮發性脂肪酸(VFA)濃度測定參考文獻[17-18]，使用日本島津GC-2014型氣相色譜儀測定，其中揮發性脂肪酸濃度測定條件為：氫火焰離子化(FID)檢測器，色譜柱為毛細管柱(FFAP，30.00 m×0.32 mm×0.50 μm)；升溫條件為初始60 ℃，以10 ℃/min升溫至120 ℃，保留2 min，以15 ℃/min升溫至180 ℃，保留5 min；汽化室溫度250 ℃；FID溫度250 ℃；進樣量1 μL，載氣為高純氮氣(99.99%)，壓力0.7 MPa；氫氣壓力0.4 MPa，空氣壓力0.4 MPa，毛細管柱壓力0.6～0.8 MPa，分流比40∶1。

1.5.4 瘤胃微生物DNA提取、測序

每組隨機選擇4個瘤胃液樣品置于冰上解凍并充分混合，使用CTAB方法提取瘤胃液樣品基因組DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度，取適量的樣本于離心管中，用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL。根據細菌16S rDNA基因的V3～V4區，合成帶有Barcode的特異引物。通用引物序列：515F，5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′；806R，5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR采用25 μL擴增體系；DNA模板5 ng，5 μmol/L的上、下游引物各1 μL，2 ng/μL的牛血清白蛋白(BSA)3 μL，2×Taq Plus Master Mix 12.5 μL，雙蒸水(ddH2O)補加至25 μL；PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環；72 ℃延伸7 min。PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用QIAquickPCR純化試劑盒(德國Qiagen公司)純化回收，符合要求的DNA樣品送至北京奧維森基因科技有限公司測序，測序平臺為Mixed PE 300。

1.5.5 數據分析

測序平臺得到的原始數據使用軟件Trimmomatic(Version 0.36)軟件去除低質量數據，然后通過vsearch軟件和物種數據庫去除嵌合體，得到有效序列。篩選相似性在97%以上的序列歸類為操作分類單元(OTU)，然后對OTU聚類、物種分類學、多樣性指數、群落結構進行統計分析。

1.6 數據統計與分析

試驗數據用Excel 2016初步整理后，采用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析，并用Duncan氏法進行組間的多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，結果均以平均值和均值標準誤(SEM)表示。

2 結果與分析

2.1 補飼精料對冷季放牧牦牛生長性能的影響

由表2可知，試驗開始前對照組和試驗組牦牛體重無顯著差異(P=0.872)，經過90 d的補飼后，冷季傳統放牧條件下，牦牛掉膘嚴重，補飼精料極顯著提高了牦牛的平均日增重(P<0.01)。

表2 補飼精料對冷季放牧牦牛生長性能的影響Table 2 Effects of concentrate supplementation on growth performance of grazing yaks in cold season

2.2 補飼精料對冷季放牧牦牛瘤胃發酵參數的影響

由表3可知，與對照組相比，試驗組瘤胃液氨態氮、總揮發性脂肪酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸濃度極顯著提高(P<0.01)，微生物蛋白和乙酸濃度顯著提高(P<0.05)；pH和乙酸/丙酸值極顯著降低(P<0.01)。上述結果表明，補飼精料能夠促進冷季放牧牦牛瘤胃發酵。

表3 補飼精料對冷季放牧牦牛瘤胃發酵參數的影響Table 3 Effects of concentrate supplementation on rumen fermentation parameters of grazing yaks in cold season

2.3 補飼精料對冷季放牧牦牛瘤胃菌群豐富度與多樣性的影響

由圖1可知，2組共產生2 945個OTU，其中對照組和試驗組分別檢測到2 627、2 415個OTU，相對應的獨有OTU數目分別為528和316個，共有OTU數目為2 099個，占總OTU數目的79.90%。由圖2可知，隨著測序深度的增加，2組瘤胃細菌物種稀釋曲線趨于平緩，說明測序程度已基本覆蓋到樣品中所有的細菌物種。通過alpha多樣性分析(表4)可知，試驗組Shannon指數和譜系多樣性顯著低于對照組(P<0.05)。通過主坐標分析(PCoA，圖3)可知，2組放牧牦牛瘤胃菌群結構具有明顯差異。以上結果表明，補飼精料降低了冷季放牧牦牛瘤胃菌群的多樣性與豐富度。

圖2 稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve

圖3 主坐標分析Fig.3 PCoA

表4 補飼精料對冷季放牧牦牛瘤胃菌群alpha多樣性的影響Table 4 Effects of concentrate supplementation on alpha diversity of rumen microbial community of grazing yaks in cold season

2.4 補飼精料對冷季放牧牦牛瘤胃菌群組成的影響

由表5可知，在門水平上，試驗組瘤胃中擬桿菌門和放線菌門豐度顯著高于對照組(P<0.05)，疣微菌門和螺旋體門豐度極顯著高于對照組(P<0.01)；對照組瘤胃中厚壁菌門豐度顯著高于試驗組(P<0.05)，黏膠球形菌門和纖維桿菌門豐度極顯著高于試驗組(P<0.01)。由表6可知，在屬水平上，試驗組瘤胃中普雷沃菌屬_1和瘤胃球菌科_NK4A214豐度極顯著高于對照組(P<0.01)，克里斯滕森菌科_R-7和解琥珀酸菌屬豐度顯著高于對照組(P<0.05)。以上結果表明，補飼精料對冷季放牧牦牛瘤胃菌群結構有一定的影響。

表5 補飼精料對冷季放牧牦牛瘤胃菌群組成的影響(門水平)Table 5 Effects of concentrate supplementation on rumen microbial community composition of grazing yaks in cold season (at phylum level) %

表6 補飼精料對冷季放牧牦牛瘤胃菌群組成的影響(屬水平)Table 6 Effects of concentrate supplementation on rumen microbial community composition of grazing yaks in cold season (at genus level) %

CK表示對照組，T表示試驗組。下圖同。CK represented control group,and T represented test group.The same as below.圖1 OTU維恩圖Fig.1 OTU Venn diagram

3 討 論

3.1 補飼精料對冷季放牧牦牛生長性能的影響

由于青藏高原獨特的地理環境，一年“無四季之分，只有冷暖之別”，冷季長達7～8個月，冷季牧草產量與營養營養水平極度匱乏，導致牦牛的生長一直處于“夏飽、秋肥、冬瘦、春死亡”的惡性循環中，生長效率低下，經濟效益差[2-3]。本試驗結果表明，傳統放牧條件下，冷季放牧牦牛體重嚴重下降，3個月體重損失率高達10.35%，補飼精料的試驗組牦牛的ADG為453.32 g/d，與對照組相比顯著促進了牦牛的生長，這與徐田偉等[19]、張建勛[20]和王威等[21]的研究結果相一致。其原因主要是：一方面，補飼精料直接為放牧牦牛提高了營養物質的攝入量，營養物質的增加可提高反芻動物抵御冷應激的能力[22]；另一方面，補飼精料一定程度上滿足了放牧牦牛對礦物元素的需要，提高了瘤胃的消化能力，從而提高了牦牛對牧草的消化率[23-24]，有利于促進放牧牦牛的生長發育。

3.2 補飼精料對冷季放牧牦牛瘤胃發酵參數的影響

瘤胃液中的揮發性脂肪酸主要來自飼糧中淀粉、纖維等物質的發酵，其主要包括乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸，是反芻動物的主要能量來源[25]。蔡晶晶等[26]研究發現，隨著飼糧非纖維性碳水化合物(NFC)/中性洗滌纖維(NDF)的提高，奶牛瘤胃液pH顯著降低。本研究結果表明，試驗組牦牛瘤胃液pH極顯著低于對照組，與蔡晶晶等[26]的研究結果相一致。這可能是由于補飼精料后牦牛攝入的NFC的比例增加，在瘤胃中迅速發酵產生大量的揮發性脂肪酸主和乳酸等物質，導致瘤胃液pH下降。瘤胃液氨態氮是瘤胃微生物利用飼料中的蛋白質合成的，也是瘤胃微生物蛋白合成的前體，其濃度反映了瘤胃微生物分解飼糧中含氮物質產生氨態氮的速度及對其攝取利用情況。本試驗條件下，試驗組瘤胃液氨態氮和微生物蛋白濃度顯著或極顯著高于對照組，這與董利鋒等[27]和朱昊鵬等[28]的研究結果基本一致，原因可能是補飼精料中可溶性蛋白質、易消化碳水化合物和非蛋白含氮物含量高，且降解速率緩慢，有利于氨態氮和微生物蛋白的合成。Giger-Reverdin等[29]研究發現，隨著飼糧中精料比例的提高，奶山羊瘤胃液丙酸、丁酸和總揮發性脂肪酸濃度顯著提高，而乙酸濃度和乙酸/丙酸值顯著降低。Murphy等[30]研究也發現，降低飼糧中精料比例降低了奶牛瘤胃液中丙酸、丁酸、戊酸和總揮發性脂肪酸濃度，而提高了乙酸濃度。本試驗中，試驗組牦牛瘤胃液總揮發性脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸濃度顯著或極顯著高于對照組，而乙酸/丙酸值顯著低于對照組，與以上研究結果不一致。其可能原因是冷季牧草產量與營養水平極度降低，不能滿足放牧牦牛正常的采食量需要，無法為瘤胃微生物提供足夠的發酵底物，從而導致瘤胃液中揮發性脂肪酸濃度降低。

3.3 補飼精料對冷季放牧牦牛瘤胃菌群豐富度與多樣性的影響

Chao1指數是衡量菌群豐富度的指標，Shannon指數是衡量菌群多樣性的指標。Chao1指數越大，表明菌群豐富度越高；Shannon指數越大，表明菌群多樣性越高。周力等[10]研究發現，補飼精料降低了藏羔羊瘤胃菌群多樣性與豐富度；Liu等[31]研究也發現，提高飼糧中精料的比例，顯著降低了牦牛瘤胃菌群Chao1和Shannon指數，這可能是增加飼糧中精料比例導致瘤胃液pH下降，而瘤胃液pH降低則會抑制瘤胃液中不耐酸的纖維降解菌的生長與繁殖[32]。本試驗中，試驗組牦牛瘤胃菌群Shannon指數較對照組顯著降低，Chao1指數呈下降的趨勢，與以上研究結果基本一致。

3.4 補飼精料對冷季放牧牦牛瘤胃菌群組成的影響

飼糧結構是影響反芻動物瘤胃微生物區系組成的首要因數，營養組成不同會直接影響瘤胃微生物的種類與數目[33]。大量研究表明，厚壁菌門和擬桿菌門是反芻動物瘤胃中的優勢菌門，擬桿菌門是降解碳水化合物的主要細菌，而厚壁菌門主要參與纖維物質的分解，兩者在瘤胃發酵過程中起著至關重要的作用[34-35]。本研究結果表明，試驗組和對照組牦牛瘤胃液中擬桿菌門和厚壁菌門豐度和占整個細菌門的85%，與以上研究結果相一致。Kim等[36]研究表明，粗料組肉牛瘤胃中厚壁菌門豐度顯著低于高谷物組。李蔣偉等[37]研究也發現，降低飼糧精料比例有提高藏羔羊瘤胃厚壁菌門豐度的趨勢。本試驗中，試驗組牦牛瘤胃擬桿菌門豐度顯著高于對照組，而厚壁菌門豐度顯著低于對照組，這與以上研究結果相一致。放線菌門是一類革蘭氏陽性菌，具有分支的纖維和孢子，其大部分是腐生菌，也有寄生菌，可致病[38]。本試驗中，補飼顯著提高了牦牛瘤胃放線菌門的豐度，表明生產中牦牛精料補飼量不宜過高。疣微菌門在哺乳動物胃腸道免疫中具有重要的作用，其豐度的上升與機體免疫力增強有密切的聯系[39]。本試驗中，試驗組牦牛瘤胃疣微菌門豐度極顯著高于對照組，說明了補飼精料一定程度提高了放牧牦牛的免疫力。研究表明，螺旋體門可以有效地降解果膠和磷酸酯，利用可發酵的碳水化合物合成揮發性脂肪酸，為反芻動物機體提供能量[40]。徐曉鋒等[41]研究發現，高精料飼糧提高了奶牛瘤胃螺旋體門豐度，這與本研究結果相一致。黏膠球形菌門和纖維桿菌門與纖維二糖的降解密切相關，能夠促進瘤胃對纖維物質的降解[42]。本研究結果表明，試驗組牦牛瘤胃黏膠球形菌門和纖維桿菌門豐度較對照組極顯著降低，原因可能是試驗組牦牛瘤胃發酵的纖維物質比例低于對照組。

在屬水平上，普雷沃菌屬是瘤胃中的優勢菌屬，參與瘤胃內的多種代謝活動，主要降解飼糧中的半纖維成分，并且普雷沃菌屬能夠產生大量的復合酶，促進非纖維性多糖和蛋白質的降解[43]。霍俊宏等[44]研究發現，隨著飼糧精粗比的提高，努比亞山羊瘤胃普雷沃菌屬豐度呈上升的趨勢。陳蕓等[45]研究也表明，增加飼糧中精料的比例能顯著提高了山羊瘤胃普雷沃菌屬豐度。本試驗中，試驗組牦牛瘤胃普雷沃菌屬_1豐度極顯著高于對照組，這與以上研究結果相一致；試驗組牦牛瘤胃克里斯滕森菌科_R-7豐度顯著高于對照組，與李嵐捷[46]研究結果相一致。克里斯滕森菌科_R-7與乙酸產量有關，本研究中試驗組牦牛瘤胃液乙酸濃度顯著高于對照組也驗證這一點。瘤胃球菌科_NK4A214屬于瘤胃球菌屬，歸屬于厚壁菌門，主要降解纖維物質。Fernando等[47]研究發現，高精料組奶牛瘤胃中瘤胃球菌屬豐度顯著低于粗料組，與本研究結果不一致。本試驗中，試驗組牦牛瘤胃中瘤胃球菌科_NK4A2豐度極顯著高于對照組，原因可能是冷季牧草產量低，牦牛采食的纖維物質量低，補飼精料一定程度上促進了牦牛對纖維物質的攝入量，導致瘤胃球菌科_NK4A2的豐度有所上升。有研究報道，解琥珀酸菌屬豐度與飼糧纖維成分有密切聯系，可以降解纖維或纖維二糖產生琥珀酸和乙酸等物質[48]。本試驗中，補飼精料顯著提高了牦牛瘤胃解琥珀酸菌屬豐度，試驗組瘤胃液乙酸濃度較對照組上升也驗證這一點。

4 結 論

在本試驗條件下，補飼精料量為體重的1.2%時，能夠顯著提高冷季放牧牦牛的平均日增重，促進瘤胃中微生物蛋白和揮發性脂肪酸的合成，降低瘤胃菌群豐富度與多樣性，提高瘤胃擬桿菌門、放線菌門、疣微菌門和螺旋體門豐度，降低瘤胃厚壁菌門、黏膠球形菌門和纖維桿菌門豐度，提高瘤胃普雷沃菌屬_1、瘤胃球菌科_NK4A214、克里斯滕森菌科_R-7和解琥珀酸菌屬豐度。