不同發酵乳酸菌劑及組合添加對甜高粱青貯營養價值、微生物數量及有氧穩定性的影響

付 薇 陳 偉 王小利 孟軍江 覃濤英 韓永芬*

(1.貴州省草業研究所，貴陽 550006；2.貴州金農富平生態農牧科技有限公司，松桃 554100)

甜高粱(sweet sorghum)是禾本科一年生碳四植物，光和效率高，鮮草產量高達225 000～300 000 kg/hm2，莖稈含糖錘度多在13%～20%，是青貯的優質飼草原料。通過青貯發酵，其粗蛋白質(CP)含量與青貯玉米相當或優于青貯玉米[1]，干物質(DM)降解率、中性洗滌纖維(NDF)消化率在牛、羊體內高于青貯玉米，pH、乳酸含量與青貯玉米相近[2]。甜高粱在夏季生長旺盛，鮮草往往過剩，南方氣候多雨濕潤，不宜干草加工，對其進行青貯調制不僅可以最大程度保留營養成分，還可有效解決南方草料季節性供應不均衡問題。

研究表明，禾本科飼草自然狀態下葉片周圍附著乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)數量較少，酵母菌、霉菌等不利于青貯發酵的微生物較多，適量添加乳酸菌主導青貯發酵，對加速青貯進程、提高青貯營養品質有積極的促進作用[3-4]。乳酸菌主要分為2類，一類是同型發酵乳酸菌，主要包括植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、蒙氏腸球菌(Enterococcusmundtti)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosus)、酪蛋白乳桿菌(Lactobacilluscasein)等，同型發酵乳酸菌具有較快的發酵特性，能有效降低乙醇和氨態氮含量，減少青貯營養損失，較好地保存青綠飼料的營養價值[5-6]，但對青貯開窖后有氧腐敗抑制效果不顯著[7]；另一類為異型發酵乳酸菌，包括布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、短乳桿菌(Lactobacillusbreris)、希氏乳桿菌(Lactobacillushilgardii)、發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)等，Polukis等[8]、Rabelo等[9]研究指出，異型發酵乳酸菌對青貯發酵過程影響不大，但在青貯過程中能產生大量抑制真菌生長的乙酸，對提高青貯有氧穩定性、保存飼料營養價值有促進作用。

單一的乳酸菌添加模式已無法同時兼顧青貯發酵品質與有氧暴露后腐敗抑制的要求，同型/異型乳酸菌混合添加對青貯發酵效果的影響逐步成為青貯菌劑研究的熱點[10-12]。目前，國內外異型發酵乳酸菌的研究主要集中在布氏乳桿菌[13-15]，其他異型發酵乳酸菌與同型發酵乳酸菌的協同效果如何？對青貯有氧暴露前后營養價值與微生物變化規律有何影響？國內尚乏深入研究[16-17]。因此，本研究以貴州省草業研究所前期從禾本科牧草中獲得的異型發酵乳酸菌為材料，通過產酸、生長速率測定，從中篩選pH降低快、產酸效率高的異型發酵乳酸菌進行同型/異型乳酸菌混合青貯，旨在明確不同發酵乳酸菌劑及組合添加對甜高粱青貯營養價值、微生物數量及有氧穩定性的影響，為異型發酵乳酸菌篩選利用和甜高粱青貯復合菌劑的開發研制提供科學依據與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

青貯原料：大力士甜高粱，于2018年4月10日播種于貴州省草業研究所松桃縣高產飼草基地，種植面積1 hm2，種植行距為60 m×20 m，2018年8月3日蠟熟初期收割。

試驗菌種：貴州省草業研究所前期分離獲得的1株植物乳桿菌LP06，1株戊糖片球菌PP02，3株短乳桿菌LBR02、LBR07、LBR10和2株發酵乳桿菌LFE13、LFE19，以上菌株分別記為LP06、PP02、LBR02、LBR07、LBR10、LFE13、LFE19。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌生長活性和產酸特性測定

分別取1環異型發酵乳酸菌(LBR02、LBR07、LBR10、LFE13、LFE19)轉入5 mL MRS液體培養基中，置于37 ℃恒溫培養箱中，期間測定4、8、12、16、20、24 h各菌株培養液的pH和620 nm吸光度(OD620)，重復測定3次。

1.2.2 甜高粱青貯制作

將甜高粱晾曬至水分含量在60%～70%，切碎至3～5 cm長度，裝入聚乙烯袋(塑料袋規格為600 mm×500 mm)。根據菌株篩選結果，設計8個菌劑添加處理：1)CK處理(無乳酸菌)；2)T處理(LP06∶PP02=1∶1)；3)Y1處理(LBR02)；4)Y2處理(LBR07)；5)Y3處理(LFE19)；6)T+Y1處理(LP06∶PP02∶LBR02=1∶1∶2)；7)T+Y2處理(LP06∶PP02∶LBR07=1∶1∶2)；8)T+Y3處理(LP06∶PP02∶LFE19=1∶1∶2)。每個處理3個重復，菌劑添加量均為5×105CFU/g。將制備好的菌劑按10 mL/kg鮮草添加量噴灑至青貯原料表面充分混勻，壓實，密封，青貯60 d。

1.3 指標測定

在青貯第60天測定甜高粱青貯的pH、營養成分含量及微生物數量。營養成分包括DM、CP、可溶性碳水化合物(WSC)、酸性洗滌纖維(ADF)、中性洗滌纖維。微生物包括乳酸菌、酵母菌和霉菌。在有氧暴露后第0、3、6、9天測定甜高粱青貯的pH，DM、WSC含量，有氧穩定性以及乳酸菌、酵母菌和霉菌數量。

1.4 測定方法

pH及營養成分：pH采用酸度計(PHS-25)測定；DM、CP含量參照AOAC(2005)[18]方法測定，其中DM含量采用烘干重量法測定，CP含量采用凱氏定氮法測定；WSC含量采用蒽酮-硫酸比色法測定[19]，ADF和NDF含量采用范氏洗滌纖維法測定[20]。

乳酸菌、酵母菌和霉菌數量：稱取20 g樣品于180 mL無菌生理鹽水中，4 ℃下振蕩1 h后制備系列梯度稀釋液(101～107)[21]。各微生物均采用菌落計數法計數，在MRS固體培養基上涂布稀釋液，于37 ℃下恒溫厭氧培養72 h，統計乳酸菌數量。在馬鈴薯葡萄糖培養基上涂布稀釋液，于25 ℃下恒溫有氧培養72 h，統計酵母菌數量。在馬丁培養基上涂布稀釋液，于25 ℃下恒溫有氧培養72 h，統計霉菌數量。數據換算為以10為底的對數。

有氧穩定性：有氧穩定性主要觀測青貯樣品有氧暴露后的溫度變化，樣品幾何中心溫度超過環境溫度2 ℃所用時長即為有氧穩定性。

1.5 數據統計

使用Excel 2007軟件對基礎數據進行整理，采用SPSS 18.0統計軟件進行單因子方差分析，并用Duncan氏法進行組間差異顯著性分析，P<0.05代表差異顯著，P<0.01代表差異極顯著。采用模糊數學隸屬函數法[22]對8個處理青貯60 d和有氧暴露第9天的10個測定指標進行綜合評價，計算公式如下：

Uxi(+)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)；Uxi(-)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)。

式中：Uxi(+)為各指標正相關隸屬函數值；Uxi(-)為各指標負相關隸屬函數值；Xi為某指標測定值；Xmin和Xmax分別為某指標所有測定值中的最小值和最大值。以全部指標隸屬函數值平均值大小進行排名。

2 結果與分析

2.1 異型發酵乳酸菌生長活性和產酸特性

由圖1所示，LBR02在14 h時進入對數生長期，22 h后OD620穩定在2.1左右。LBR07在12 h時進入對數生長期，20 h后OD620穩定在1.9左右。LFE19的對數生長期為12～18 h，20 h穩定后OD620穩定在1.7左右。LBR02、LBR07、LFE19在生長22 h后，生長活性明顯強于另外2株菌株。

圖1 5株異型發酵乳酸菌生長活性Fig.1 Growth activity of 5 heterofermentative lactic acid bacteria

由圖2所示，LBR02、LBR07、LFE19前期pH下降緩慢，進入各自對數生長期后pH快速下降，24 h時5株菌株的pH從低到高依次排序為：LBR02

圖2 5株異型發酵乳酸菌產酸特性Fig.2 Acid production characteristics of 5 heterofermentative lactic acid bacteria

2.2 不同發酵乳酸菌劑及組合添加對甜高粱青貯60 d后pH、營養價值及主要微生物的影響

如表1所示，青貯前(初始發酵)，甜高粱pH為5.62，DM含量為25.75%，CP含量為6.52%，WSC含量為10.20%，NDF含量為40.47%，ADF含量為30.55%。與青貯前相比，青貯60 d后，各處理pH均顯著降低(P<0.05)，各處理之間差異不顯著(P>0.05)；各處理DM含量有所下降，但差異不顯著(P>0.05)；各處理CP含量均顯著降低(P<0.05)，其中T處理CP含量下降幅度最小，CK處理CP含量下降幅度最大；各處理WSC含量均顯著降低(P<0.05)，其中CK、Y3、T+Y3處理WSC含量顯著高于其他處理(P<0.05)，CK處理WSC含量下降幅度最小(60.39%)，T+Y2處理WSC含量下降幅度最大(70.39%)。青貯前后甜高粱ADF和NDF含量沒有顯著差異(P>0.05)。

表1 不同發酵乳酸菌劑及組合添加對甜高粱青貯60 d后pH、營養價值及主要微生物數量的影響Table 1 Effects of different lactic acid bacteria agents and their combinations on pH,nutritional value and major microorganisms number of sweet sorghum after 60 days silage

青貯前，甜高粱乳酸菌數量為4.06 lg(CFU/g FM)。與青貯前相比，青貯60 d后，各處理乳酸菌數量顯著提高(P<0.05)，其中T處理乳酸菌數量最高，其次為T+Y1、T+Y2處理，3個處理乳酸菌數量均大于8.20 lg(CFU/g FM)，且CK處理乳酸菌數量顯著低于其他處理(P<0.05)；各處理酵母菌和霉菌數量顯著降低(P<0.05)，其中Y1處理霉菌抑制效果最佳，未檢測出霉菌。

2.3 不同發酵乳酸菌劑及組合添加對甜高粱青貯有氧暴露后pH、營養價值和有氧穩定性的影響

如表2所示，有氧暴露第3天，各處理pH穩定在4.3以下；有氧暴露第6天，CK、T和T+Y3處理pH出現了較大幅度上升；有氧暴露第9天，Y1、Y2、T+Y1、T+Y2處理pH顯著低于其他處理(P<0.05)，pH大小依次為：Y2處理

表2 不同發酵乳酸菌劑及組合添加對甜高粱青貯有氧暴露后pH、營養價值和有氧穩定性的影響Table 2 Effects of different lactic acid bacteria agents and their combinations on pH,nutritional value and aerobic stability of sweet sorghum silage after aerobic exposure

續表2項目Items有氧暴露時間Aerobicexposuretime/d處理TreatmentCKTY1Y2Y3T+Y1T+Y2T+Y3P值P-value可溶性碳水化合物WSC/%DM04.04±0.34a3.28±0.25b3.19±0.46b3.14±0.09b3.85±0.13a3.23±0.03b3.02±0.17b3.88±0.59a<0.00134.00±0.03a2.95±0.05d3.19±0.12c2.97±0.14d3.40±0.26b2.98±0.03d2.82±0.31e2.95±0.08d<0.00162.96±0.21a2.28±0.03e2.84±0.18b2.59±0.11c2.48±0.25d2.49±0.02d2.32±0.09e2.10±0.10f<0.00191.76±0.17d1.40±0.22f2.10±0.10b2.20±0.06a1.79±0.03d2.04±0.15b1.94±0.03c1.68±0.12e<0.001有氧穩定性Aerobicstability/h104.92±2.46g102.52±5.21g183.45±3.39a159.04±3.24c131.25±8.07e172.18±2.59b148.71±2.95d115.47±8.00f<0.001

2.4 不同發酵乳酸菌劑及組合添加對甜高粱青貯有氧暴露后主要微生物數量的影響

如表3所示，有氧暴露第3天和第6天，各處理乳酸菌數量變化不大；有氧暴露第9天，各處理乳酸菌數量出現不同程度降低，Y1、Y3、T+Y1處理乳酸菌數量顯著高于其他處理(P<0.05)，乳酸菌數量依次為：Y1處理>Y3處理>T+Y1處理>Y2處理>T+Y3處理>T+Y2處理>T處理>CK處理。有氧暴露后，各處理酵母菌數量不同程度增加；有氧暴露第9天，Y1、Y2、T+Y1、T+Y2處理酵母菌數量顯著低于其他處理(P<0.05)，其中以Y1、T+Y1處理酵母菌數量較低。整個有氧暴露階段，Y1處理霉菌抑制效果較好，有氧暴露至第6天均未檢測出霉菌，Y2、T+Y1、T+Y2處理霉菌抑制效果其次；有氧暴露第9天，Y1、Y2、T+Y1、T+Y2處理霉菌數量顯著低于其他處理(P<0.05)。

表3 不同發酵乳酸菌劑及組合添加對甜高粱青貯有氧暴露后主要微生物數量的影響Table 3 Effects of different lactic acid bacteria agents and their combinations on major microorganisms number of sweet sorghum silage after aerobic exposure lg(CFU/g FM)

2.5 不同發酵乳酸菌劑及組合添加對甜高粱青貯營養價值、主要微生物數量及有氧穩定性影響的綜合評價

如表4所示，為評價不同發酵乳酸菌劑及組合添加對甜高粱青貯營養價值、微生物數量及有氧穩定性的綜合效果，本研究利用隸屬函數法對8個處理青貯60 d和有氧暴露9 d的10個指標進行綜合評價，其中DM、CP、WSC含量和乳酸菌數量以及有氧穩定性為5個正向指標，pH和NDF、ADF含量以及酵母菌、霉菌數量為5個負向指標。根據5個正向指標和5個負向指標的平均隸屬函數值對8個處理進行綜合評定，平均值越高表明該處理綜合應用價值越高，從高到低依次為：T+Y1處理(0.64)>Y1處理(0.59)>T+Y2處理(0.58)>Y2處理(0.52)>Y3處理(0.45)>T處理(0.42)>T+Y3處理(0.37)>CK處理(0.31)。

表4 不同發酵乳酸菌劑及組合添加對甜高粱青貯營養價值、主要微生物數量及有氧穩定性影響的綜合評價Table 4 Comprehensive evaluation of effects of different lactic acid bacteria agents and their combinations on nutritional value,major microorganisms number and aerobic stability of sweet sorghum silage

3 討 論

3.1 優良異型青貯乳酸菌的篩選及同型/異型發酵乳酸菌劑組合的構建

生長活力強、產酸速率高是優良乳酸菌篩選的重要特征。從生長活力上看，LBR02、LBR07和LFE19分別在14和12 h時即可進入對數生長期，20 h左右OD620分別穩定至2.1、1.9和1.7，生長快速，活力較強，這與魏日華[23]對布氏乳桿菌生長活力的研究結果相似。從產酸速率上看，pH快速下降至4.2以下，能夠有效抑制青貯底物中酵母菌、霉菌等有害微生物繁殖，提高發酵成功率。LBR02、LBR07和LFE19的pH分別在22、20和18 h時即可下降至4.2以下，產酸速率較高。根據LBR02、LBR07和LFE19的生長活力和產酸速率特征，初步判定其適合作為青貯添加菌劑試驗。但并非所有菌種都適用于任何一種情況下的青貯添加，受發酵底物品種、菌種類別、菌系協同作用等多種因素影響，不同菌劑添加的青貯發酵效果均有所差異[24-25]。因此，本研究以這3株異型發酵乳酸菌和前期篩選獲得的2株同型發酵乳酸菌構建同型/異型發酵乳酸菌劑組合，進一步探討不同菌劑添加對甜高粱青貯發酵及有氧腐敗抑制效果的影響。

3.2 不同發酵乳酸菌劑及組合添加對甜高粱青貯pH、營養價值及主要微生物數量的影響

青飼草通過青貯發酵能夠快速降低pH，減少損耗，保存飼料營養，一般認為pH在3.8～4.2的青貯飼料品質較好。本研究中，8個處理發酵60 d后pH均低于4.2，其中T處理表現最優，T處理為同型發酵乳酸菌，這與賈婷婷等[7]研究結論相一致，進一步表明在青貯中加入同型發酵乳酸菌更有利于加快青貯進程。營養成分是評價青貯發酵品質的重要指標，一般認為青貯后DM、CP、WSC含量越高，青貯品質越好。青貯60 d后，8個處理DM含量均有所降低，T、T+Y1、T+Y2處理DM含量略高于其他處理，原因可能是這3個處理菌株生長相對較快，青貯快速酸化，抑制了有害細菌生長，減少了DM損失，這一結果與pH測定結果較吻合。青貯60 d后，各處理CP含量較青貯前顯著下降，其原因可能與甜高粱青貯后的呼吸作用、蛋白質降解酶和相關微生物代謝活動有關[26]，7個添加乳酸菌處理的CP含量均顯著高于未添加乳酸菌的CK處理，表明同型、異型和同型/異型復合發酵處理均能較好抑制甜高粱蛋白質降解。青貯發酵時微生物需要能量來源以保證自身生長，WSC作為乳酸菌生長碳源攝取的主要底物，在青貯過程中被乳酸菌代謝消化，其含量可以間接反映乳酸菌生長情況。本試驗中，Y3、T+Y3和CK處理青貯60 d后WSC含量顯著高于其他處理，可能與這3個處理乳酸菌代謝活動相對較弱、WSC分解消耗較慢有關。ADF和NDF是動物飼料精粗比平衡與否的重要評定指標，其通過影響反芻動物的咀嚼時間、唾液分泌量等，間接影響動物的消化率，二者含量越高，可供家畜吸收利用的營養成分反之越少[27]。本研究中，與青貯前相比，青貯60 d后8個處理ADF、NDF含量變化并不顯著，這與紫花苜蓿和甜高粱混合青貯后消化率顯著增加的結論[28]不一致，可能原因是本次試驗所用底物或乳酸菌種類酶含量較少、酶活性較弱，在提高消化率上作用不顯著，具體原因還需繼續探索。

劉晗璐[29]研究指出，新鮮牧草附著的微生物以一般細菌、酵母菌和霉菌為主，想要獲取發酵品質較好的青貯飼料，乳酸菌數量一般需高于5 lg(CFU/g FM)。本研究中，青貯60 d后，8個處理乳酸菌數量大幅增加至7 lg(CFU/g FM)以上，酵母菌和霉菌生長得到有效抑制，其中同型發酵乳酸菌T處理和同型/異型發酵乳酸菌T+Y1、T+Y2、T+Y3處理乳酸菌數量大于8 lg(CFU/g FM)，顯著高于乳酸菌未添加處理和其他3組異型發酵乳酸菌單獨添加處理。Filya[30]在玉米和高粱青貯飼料的研究中指出，不同配比乳酸菌增殖程度不一致，一般同型發酵乳酸菌增殖速度高于異型發酵乳酸菌，本研究結果與Filya[30]報道一致。

3.3 不同發酵乳酸菌劑及組合添加對甜高粱青貯有氧腐敗抑制效果的影響

有氧穩定性是指青貯飼料在有氧暴露后隨著pH、溫度升高依然保持新鮮、氣味酸香的持續時間[14]。對青貯玉米的研究指出，實際生產中青貯有氧暴露后接觸到空氣的部分有氧穩定性不會超過5 d[4,22]。本研究中，LBR02單獨添加或與LP06、PP02復合添加，相對于T處理有氧穩定性顯著增加，其中Y1和T+Y1處理有氧穩定性分別達183.45和172.18 h，比T處理多出80.92和69.66 h。在以黑麥草、扁穗牛鞭草為青貯原料的試驗研究也表明，盡管同型發酵乳酸菌可有效降低青貯過程中的營養損耗，但對增加有氧穩定性沒有明顯優勢[31-32]。

青貯有氧暴露后，pH和DM、WSC含量以及乳酸菌、好氧菌的生長情況等多種因素變化均能反映青貯飼料有氧腐敗程度。本研究中，有氧暴露后，青貯有氧穩定性減弱，Y1、Y2、T+Y1處理的DM含量表現為先上升后下降，可能是這3個處理有氧腐敗和物質損耗相對較少，DM含量因青貯滲出液的流失短暫增加所致。Huisden等[33]研究指出，青貯殘余過多的WSC可供好氧微生物分解利用，也不利于青貯飼料有氧暴露后的品質穩定。本研究中，青貯60 d時WSC含量較高的T、Y3、T+Y3處理，隨著有氧暴露時間延長，WSC含量迅速下降，有氧暴露第9天的WSC含量下降幅度分別高達57.41%、53.55%、56.70%，顯著低于Y1、Y2、T+Y1、T+Y2處理，這與Huisden等[33]的研究結論相吻合。青貯有氧暴露后，酵母菌和霉菌等有害微生物不斷利用營養物質大量增殖，逐步引起青貯飼料腐敗變質[34]。本研究中，有氧暴露第9天，Y1、Y2、T+Y1、T+Y2處理酵母菌和霉菌數量顯著低于其他處理，其中Y1處理有氧暴露第0、3、6天未檢測出霉菌存在，4個處理對酵母菌和霉菌的抑制表現同pH動態變化較為一致，整個有氧暴露階段，Y1、Y2、T+Y1、T+Y2處理的pH上升緩慢，有氧暴露第9天，當T處理的pH升高至5.5時，這4個處理的pH穩定在4.8以下，顯著低于其他處理。對此推測，該結果很可能是由于短乳桿菌異型發酵產生了乙酸等有助提高青貯有氧穩定性的有機酸，盡管這些有機酸對改善青貯發酵品質作用不顯著，但對有氧暴露后有害微生物生長抑制和酸性環境維持上作用明顯有關[7,29]，具體作用機制還需要進一步探索。

目前對于青貯有氧穩定性尚乏國標參考，對于青貯效果的綜合評價主要單純以發酵指標、營養價值指標、飼用指標或采用隸屬函數法進行綜合評價[12,35]。本研究選取甜高粱青貯60 d和有氧暴露9 d的10個指標對各乳酸菌劑青貯效果進行綜合評價，評價結果相對具有全面性，但指標選擇較為主觀片面，且未考慮權重因素，在后續研究中還應明確各指標在青貯中的重要程度，進而作出更為科學客觀的評價。

4 結 論

① 不同發酵乳酸菌劑及組合添加均可不同程度改善甜高粱青貯發酵品質，LBR02單獨添加或與LP06、PP02組合添加在在保存甜高粱營養價值、有效抑制酵母菌和霉菌生長、提高青貯有氧穩定性方面作用效果更好。

② 采用隸屬函數法進行綜合評價，各處理綜合價值從高到低依次為：T+Y1處理>Y1處理>T+Y2處理>Y2處理>Y3處理>T處理>T+Y3處理>CK。