卵內注射亮氨酸對慢性熱應激雌性肉雞生長性能、腸道組織形態和抗氧化能力的影響

崔洋洋 韓國鋒 李延森 李春梅

(南京農業大學動物科技學院，家畜環境控制與智慧生產研究中心，南京 210095)

近年來，全球變暖已造成許多地區高溫季節時間延長，對人類健康和農業生產造成負面影響。現代肉雞養殖企業多采用自動化和高密度的飼養模式，同時肉雞具有代謝率高、無汗腺、對熱敏感等特點，這就使得肉雞很容易受到高溫影響而產生熱應激[1-2]。熱應激根據應激時間分為“急性熱應激”和“慢性熱應激”。急性熱應激是指環境溫度的短暫而快速的升高，慢性熱應激是指長時間(≥3 d)內環境溫度升高。此外，慢性熱應激根據是否存在間歇性又分為周期慢性熱應激和連續熱應激。周期性慢性熱應激指動物在一段時間內暴露于熱環境中，其他時間則處于舒適溫度，而連續性熱應激是指動物持續面臨高溫環境[3]。目前動物養殖生產中最常發生的是周期性慢性熱應激[4]。據報道，每年因高溫引起的熱應激造成的家禽產業經濟損失達12 800萬美元[5]。近年來，世界肉類消費結構逐漸從牛、羊肉向禽肉轉移，雞肉生產增長遠高于牛肉、豬肉，2020年商品代白羽肉雞出欄總量51.55億只，漲幅高達13.25%[6]。同時，由于非洲豬瘟導致豬肉產量下降，豬肉價格升高，雞肉消費需求進一步升高[7]。因此，尋找有效緩解家禽生產中熱應激問題的策略日益引起研究人員關注。目前主要是利用飼料添加劑和控制環境溫度來緩解熱應激對家禽造成的損傷[8]，但這些方法都是被動的來緩解熱應激造成的損傷，具有效率低和成本高等缺點[9]。

前人研究表明，胚胎期熱操縱(thermal manipulation,TM)技術可使孵化后的雛雞具有耐熱性[10-11]。我們先前研究結果發現TM可改變肉雞胚胎期肝臟和大腦中的亮氨酸濃度[12]。根據Ohta等[13]試驗研究和本試驗先前研究結果，我們選擇在胚胎期第7天于卵黃囊內注射亮氨酸，結果發現卵內注射亮氨酸能提高熱應激條件下雄性肉雞的耐熱性[14]和生長性能[15]；此外，Erwan等[16]報道，飼糧中添加亮氨酸對肉雞的采食量、體增重和飼料轉化率并無顯著影響。這就說明在提高肉雞耐熱性方面，卵內注射亮氨酸顯著優于飼糧添加。

卵內注射技術具有安全性高、接種速度快、劑量準確、便于機械化操作和節省人力等優點，并且該技術在家禽早期免疫調控的應用方面取得了較大成功[17]。目前已經報道的卵內注射的物質主要有氨基酸及其代謝物類、維生素、電解質、益生菌、碳水化合物以及一些小肽類物質等[18]，這些外源性物質具有改善胚胎期營養狀況，促進胚胎發育，提高雛雞出殼后免疫功能、生長性能、抗熱應激能力、肉品質等功能[12,19]。卵內注射技術作為一項新技術，目前仍面臨許多挑戰，如禽蛋品種，注射液的種類、濃度、劑量等都會影響卵內注射的效果，以及卵內注射對后代影響持續時間等都需要進一步研究。我們相信在未來會有更多的新型營養物質或其他補充劑應用于卵內注射技術的研究中，從而挖掘出更多高效的卵內注射補充劑進一步促進禽類產業健康發展。

熱應激引起肉雞體溫升高、采食量降低，最終降低肉雞的生產性能[20]。熱應激還會破壞腸道組織形態，造成腸道上皮細胞壞死、脫落，降低肉雞的生長性能和抗氧化能力[21]。此外，熱應激也會影響法氏囊、脾臟等免疫器官的發育，降低肉雞的免疫功能[22]。亮氨酸是一種必需氨基酸，參與蛋白質的從頭合成，還參與維持和調控動物多種生理功能[23-24]。本課題組前期研究已經證實，肉雞胚胎期亮氨酸營養干預可以通過激活脂代謝和氨基酸代謝提高肉雞對熱應激的耐受[14,25]。胚胎期注射亮氨酸水溶液(0.5 mL/枚，含4.03 mgL-亮氨酸)可以降低急性熱應激肉雞間腦中熱休克蛋白基因表達水平[26]。此外，飼糧中長期補充亮氨酸可以提高金鯧魚的生長性能和抗氧化能力[27]。最新研究發現，胚胎期亮氨酸營養干預能顯著提高慢性熱應激雄性肉雞的生長性能[28]，但是目前關于卵內注射亮氨酸對慢性熱應激雌性肉雞生長性能和抗氧化能力的研究未見報道。因此，本研究旨在探討胚胎期亮氨酸營養干預對慢性熱應激雌性肉雞生長性能和抗氧化能力的影響，明確卵內注射亮氨酸是否能恢復慢性熱應激對雌性肉雞生長性能、腸道形態結構和抗氧化能力造成的損傷，為卵內注射亮氨酸在家禽抗熱應激領域的進一步應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗選取日齡相同、蛋重相近的羅斯308種蛋200枚，隨機分為2組(每組平均蛋重64.9 g)，在胚胎期第7天進行卵內注射，將亮氨酸水溶液和超純水注射入卵黃囊內，根據Ohta等[13]和本課題組先前試驗結果[15]，本試驗選擇對照組注射超純水(0.5 mL/枚)，亮氨酸組注射亮氨酸水溶液(0.5 mL/枚，含9.06 mgL-亮氨酸)。卵內注射過程參照Ohta等[13]的報道。

雛雞飼養至15日齡，2組各隨機選擇體重相近的24只雌性雛雞，分成8個重復，每個重復3只。2組雌性肉雞從21日齡開始至39日齡結束，連續19 d進行熱處理[(30±2)℃]，處理時間為每天10:00—16:00，熱應激期結束后，進入恢復期，即熱應激結束后在正常溫度環境下飼養1周至46日齡。

1.2 雌性肉雞飼養

1日齡雛雞出殼后立即轉移到南京農業大學動物試驗中心動物房飼養，2日齡時通過雌雄鑒別(羽速快慢鑒別法)篩選出雌性雛雞進行分籠飼養，每籠20只。飼養管理遵循《羅斯308飼養管理手冊》，自由采食(飼糧營養水平滿足：代謝能>12.6 MJ/kg，粗蛋白質含量>23%)和飲水。當飼養試驗進行到39和46日齡時，分別以重復為單位進行屠宰試驗。每個重復選1只雌性肉雞解剖，麻醉后頸動脈采血于離心管中，然后分離出十二指腸、空腸和回腸，在每段腸道中段取3 cm左右樣品，用生理鹽水把腸道內容物沖洗干凈。一部分于4%多聚甲醛常溫保存，以制備石蠟切片，另一部分保存于-80 ℃冰箱。最后分離出心臟、肝臟、脾臟、法氏囊等器官，用濾紙吸取表層血液，剪去表面脂肪和系膜，放置在電子天平上稱重。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生長性能測定

記錄各組(以重復為單位)熱應激期間的采食量和死淘數，每3 d記錄各組體重(以重復為單位)，計算21～39日齡、40～46日齡的平均日增重、平均日采食量、飼料轉化率，并計算39和46日齡的心臟、肝臟、法氏囊、脾臟指數。免疫器官指數計算公式如下：

免疫器官指數(%)=[免疫器官重(g)/體重(g)]×100。

1.3.2 腸道組織形態測定

腸道切片制作過程大致分為固定、梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(HE)染色和中型樹脂封片。采用虛擬顯微鏡(Nikon公司)并結合Image J 1.6.0圖像分析軟件觀察腸道形態結構，測定絨毛高度和隱窩深度。

1.3.3 血清抗氧化指標檢測

采用酶標儀測定血清中丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和總抗氧化能力(T-AOC)，所用試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.3.4 腸道組織抗氧化指標檢測

將存于-80 ℃冰箱的腸道組織用預冷的生理鹽水按1∶9(質量∶體積=g∶mL)稀釋，然后勻漿，將勻漿液于離心機中離心(4 ℃，3 500 r/min，15 min)后，小心吸取上清液，使用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定上清液中CAT、SOD、GSH-Px活性和MDA含量。

1.4 數據統計與分析

血清抗氧化指標的數據使用GraphPad Software公司開發的GraphPad Prism 8.2.1統計軟件進行雙因素方差分析(two-way ANOVA)，若存在顯著交互作用，繼續采用Turkey-Kramer test進行組間多重比較；生長性能、器官指數、腸道組織形態和腸道組織抗氧化指標等的數據使用GraphPad Prism 8.2.1獨立樣本t檢驗(ttest)分析。試驗數據以“平均值±標準誤”表示，P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 卵內注射亮氨酸對慢性熱應激雌性肉雞生長性能的影響

由表1可知，與對照組相比，卵內注射亮氨酸對熱應激期和恢復期雌性肉雞的平均日增重、平均日采食量和料重比沒有產生顯著影響(P>0.05)，而且也未顯著影響39和46日齡心臟、肝臟和法氏囊指數(P>0.05)，但極顯著提高了39日齡雌性肉雞脾臟器官指數(P<0.01)。

表1 卵內注射亮氨酸對慢性熱應激雌性肉雞生長性能的影響Table 1 Effects of in ovo leucine injection on growth performance of female broilers under chronic heat stress

續表1階段Phases指標Indexes日齡Daysofage對照組Controlgroup亮氨酸組LeucinegroupP值P-value恢復期Recoveryperiod平均日增重ADG/g40～4673.63±19.9062.14±16.700.226平均日采食量ADFI/g40～46549.36±111.19493.21±90.550.389料重比F/G40～469.11±2.7110.49±2.300.467體重BW/g462409.00±80.502221.00±54.780.073心臟指數Heartindex/%460.45±0.010.42±0.020.181肝臟指數Liverindex/%462.17±0.112.24±0.130.684法氏囊指數BursaofFabriciusindex/%460.17±0.020.21±0.030.276脾臟指數Spleenindex/%460.11±0.000.14±0.020.200

2.2 卵內注射亮氨酸對熱應激雌性肉雞血清抗氧化指標的影響

由表2可知，與對照組相比，39日齡時亮氨酸組血清T-AOC活性極顯著下降(P<0.01)，其他血清抗氧化指標無顯著差異(P>0.05)；然而，46日齡時亮氨酸組血清MDA含量極顯著下降(P<0.01)，SOD活性則極顯著提高(P<0.01)。

表2 卵內注射亮氨酸對慢性熱應激雌性肉雞血清抗氧化指標的影響Table 2 Effects of in ovo leucine injection on serum antioxidant indexes of female broilers under chronic heat stress

2.3 卵內注射亮氨酸對慢性熱應激雌性肉雞腸道組織形態的影響

由圖1和圖2可知，與對照組相比，卵內注射亮氨酸極顯著提高了39日齡雌性肉雞十二指腸絨毛高度和回腸隱窩深度(P<0.01)，顯著降低空腸絨毛高度(P<0.05)，極顯著降低了空腸隱窩深度(P<0.01)；卵內注射亮氨酸顯著提高了46日齡雌性肉雞回腸絨毛高度(P<0.05)，極顯著提高了空腸絨毛高度(P<0.01)，極顯著降低了十二指腸絨毛高度和空腸隱窩深度(P<0.01)。

2.4 卵內注射亮氨酸對慢性熱應激雌性肉雞腸道組織抗氧化指標的影響

由表3可知，與對照組相比，亮氨酸組的39日齡雌性肉雞空腸組織MDA含量降低了46.7%(P=0.134)，且空腸組織CAT和GSH-Px的活性分別提高了4.9%(P=0.886)和53.2%(P=0.102)。

表3 卵內注射亮氨酸對慢性熱應激39日齡雌性肉雞腸道組織抗氧化指標的影響Table 3 Effects of in ovo leucine injection on intestinal tissue antioxidant indexes of 39-day-old female broilers under chronic heat stress

續表3項目Items組別Groups十二指腸Duodenum空腸Jejunum回腸IleumP值P-value<0.0010.0250.348過氧化氫酶對照組Controlgroup7.2±1.68.1±1.810.1±1.0CAT/(U/mgprot)亮氨酸組Leucinegroup5.9±0.98.5±1.311.6±0.8P值P-value0.6100.8660.239谷胱甘肽過氧化物酶對照組Controlgroup70.0±6.5102.7±13.0205.9±4.8GSH-Px/(U/mgprot)亮氨酸組Leucinegroup60.2±4.9157.3±18.2199.1±6.0P值P-value0.2810.1020.271

3 討 論

3.1 卵內注射亮氨酸對慢性熱應激雌性肉雞生長性能的影響

大量研究已經證實，足夠的采食量是動物生長和發揮生產潛力的必要保證，而慢性熱應激會降低雌性肉雞的采食量，導致機體代謝發生紊亂，體重下降，嚴重時甚至會導致死亡[29]。本課題組先前研究發現卵內注射亮氨酸后，在慢性熱應激條件下雄性肉雞體重與對照組相比顯著提高，這說明卵內注射亮氨酸能夠提高雄性肉雞的生長性能[14]。然而，有研究顯示雌性肉雞對高溫的敏感性要低于同日齡的雄性肉雞[30]。Han等[25]研究也發現卵內注射亮氨酸可使急性熱應激條件下雄性雛雞獲得耐熱性，而雌性雛雞并未獲得耐熱性，進一步說明肉雞在獲得耐熱性能方面存在性別差異。本試驗結果表明，卵內注射亮氨酸并未對慢性熱應激雌性肉雞的生長性能產生顯著影響。這可能與雌性和雄性肉雞自身的耐熱性差異有關，也可能與卵內注射亮氨酸誘導耐熱性的性別差異有關，未來研究將會關注這一問題。

圖I、J、K分別為對照組46日齡雌性肉雞十二指腸、空腸和回腸組織切片(40×)，圖L、M、N分別為亮氨酸組46日齡雌性肉雞十二指腸、空腸和回腸組織切片(40×)。圖O和P分別為絨毛高度和隱窩深度數據柱狀圖。數據表示為平均值±標準誤(n=4)，*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。Figures I,J and K were the tissue sections of duodenum,jejunum and ileum of 46-day-old female broilers in the control group (40×),and figures L,M and N were the tissue sections of duodenum,jejunum and ileum of 46-day-old female broilers in the leucine group,respectively (40×).Figures O and P were the histograms of villus height and crypt depth,respectively.The values showed as the mean±SE (n=4),* mean significant difference compared with the control group (P<0.05),and ** mean extremely significant difference compared with the control group (P<0.01).圖2 46日齡雌性肉雞腸道組織形態Fig.2 Intestinal tissue morphology of 46-day-old female broilers

慢性熱應激可阻礙雌性肉雞免疫器官發育，免疫器官指數尤其是脾臟指數顯著降低[31]。免疫器官指數是評價機體免疫系統發育狀況的關鍵性指標，其大小直接影響機體免疫調節能力[32]。脾臟是機體最大的外周淋巴器官，參與機體損傷和老化細胞清除等。諸多報道證實，慢性熱應激會使肉雞脾臟水腫、出血、萎縮和相對重量降低等，影響其正常發育[31,33]。亮氨酸不僅可為動物免疫細胞供能，同時還可促進動物免疫細胞增殖。Siwicki等[34]在普通鯉魚和虹鱒的試驗中發現，體外培養的頭腎淋巴細胞加入亮氨酸代謝物β-羥基-β丁酸甲酯(HMB)后，其頭腎免疫淋巴細胞密度顯著高于對照組。本研究結果發現，卵內注射亮氨酸可以提高慢性熱應激雌性肉雞的脾臟指數，這說明卵內注射亮氨酸可能通過促進雌性肉雞早期脾臟淋巴細胞增殖，提高脾臟指數，從而提高雌性肉雞的免疫功能。

3.2 卵內注射亮氨酸對慢性熱應激雌性肉雞腸道組織形態的影響

大量研究已經證實，慢性熱應激影響腸道組織結構完整性，導致肉雞腸道通透性增加和局部炎癥[33]。腸道形態結構在維持腸道物理屏障功能發揮著重要的作用，并且與營養物質的消化和吸收密切相關[35]。亮氨酸作為必需氨基酸，不僅可促進蛋白質合成，還可維持和保護腸道形態完整性。Jiang等[36]研究發現，飼糧補充亮氨酸可以改善草魚腸道形態結構和功能，促進免疫相關基因表達，增強機體免疫功能。黃強[37]研究發現，飼糧添加0.35%亮氨酸可以改善早期宮內發育遲緩仔豬的腸道組織形態，保護腸道形態完整性。本試驗結果表明，卵內注射亮氨酸可極顯著提高雌性肉雞39日齡十二指腸和46日齡空腸絨毛高度，同時極顯著降低了39和46日齡空腸隱窩深度。這就說明卵內注射亮氨酸在一定程度上可以改善由熱應激引起的腸道組織形態的破壞，維持腸道形態完整性，這與前人研究結果一致。對于卵內注射亮氨酸是否對雌性肉雞早期腸道發育及其免疫功能產生了影響及機制尚不清楚，我們將在未來試驗中進一步探索。

3.3 卵內注射亮氨酸對慢性熱應激雌性肉雞血清抗氧化能力的影響

熱應激條件下，機體產生大量自由基，并通過各類反應破壞機體氧化還原平衡，使機體代謝發生紊亂。同時，機體存也在多種抗氧化酶，包括CAT、SOD和GSH-Px等，它們協調統一構成了清除體內自由基的第1道酶防御機制。鐘光等[38]研究表明，慢性熱應激能夠降低肉雞血清中CAT和SOD活性，破壞機體氧化還原平衡。王松波等[39]試驗發現，慢性熱應激顯著升高肉雞血清中MDA含量，降低血清GSH-Px活性。亮氨酸除作為蛋白質合成的單體，還可以緩解由過氧化氫導致的動物細胞膜過氧化損傷。Zhou等[27]研究發現，在飼糧中長期補充亮氨酸可以降低金鯧魚血清中MDA含量，進一步提高金鯧魚的抗氧化能力。本試驗結果表明，卵內注射亮氨酸極顯著提高了慢性熱應激雌性肉雞46日齡時血清SOD活性，極顯著降低了血清MDA含量。這說明卵內注射亮氨酸可以通過降低血清脂質過氧化物的產生，同時提高血清SOD活性使得肉雞在熱應激后更快恢復機體內氧化還原平衡。

3.4 卵內注射亮氨酸對慢性熱應激雌性肉雞腸道組織抗氧化能力的影響

熱應激損傷肉雞腸道組織結構完整性，破壞腸道抗氧化功能，最終引起機體代謝紊亂。熱應激作用時間、方式以及溫度高低不同對肉雞抗氧化功能的影響也不一樣[40-41]。Quinteiro-Filho等[42]研究顯示，急性熱應激可以通過下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活造成機體抗氧化功能紊亂，提高肉雞急性腸炎的發生率。Quinteiro-Filho等[33]研究發現，隨著熱應激作用時間的延長，肉雞腸道氧化程度減輕，腸炎發生率降低。體外研究表明，與對照組相比，亮氨酸處理可顯著抑制人結腸上皮細胞氧化應激模型中白細胞介素-8(IL-8)的分泌并提高谷胱甘肽硫轉移酶(GST)和CAT的活性[43]。本研究結果表明，卵內注射亮氨酸未能提高雌性肉雞腸道組織抗氧化能力。其原因一方面可能是慢性熱應激使得雌性肉雞逐步適應熱環境并建立了新的氧化還原平衡，機體的抗氧化功能逐漸恢復；另一方面可能是不同組織對熱應激的敏感性不同。由于肉雞代謝率高，生長速度快，其肌肉的增重速度相比其他組織更快。肌肉富含大量線粒體，不僅是產熱的主要器官，也是為機體提供能量的主要組織。然而在高代謝率和高溫條件下，肌肉組織相比腸道組織更易產生氧化應激[44]。關于卵內注射亮氨酸是否能緩解熱應激雌性肉雞肌肉氧化應激的損傷尚不清楚，仍需進一步探索。

4 結 論

卵內注射亮氨酸可以提高慢性熱應激雌性肉雞的脾臟指數，有效改善腸道組織形態，保持腸道完整性；同時，卵內注射亮氨酸在一定程度上還可以提高慢性熱應激雌性肉雞的血清抗氧化能力。