飼草青貯微生物多樣性研究進展及對策

劉 悅 字學娟* 陳 婷 李 茂

(1.海南大學林學院，儋州 571737；2.中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所，儋州 571737)

青貯是一種利用乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)進行發酵，長期保存新鮮青綠飼料作物、牧草等飼草的存貯方式[1]。青貯技術已有3 000多年的歷史[2]，隨著保存技術的不斷改進、管理技術的發展以及對發酵過程中微生物種類和作用認識的增強，目前已成為最常用的飼草保存技術。優質青貯飼料具備適口性好、養分含量高、消化率較高等優點，在粗飼料供應不足的冬春季是反芻動物優質飼料的重要來源[3]，是動物維持生產性能的重要保障。

青貯飼料發酵過程由微生物參與，原料表面的微生物區系主要由醋酸菌屬(Acetobacter)、梭菌屬(Clostridium)、腐敗菌、霉菌、酵母菌和LAB等構成。LAB起主導作用，主要通過以下2個途徑實現：一是利用可溶性碳水化合物產生乳酸來降低pH；二是LAB與不良微生物競爭營養物質，還可以產生細菌素等具有抑菌活性的代謝產物，來抑制其生長[4]。據報道，每克青貯原料中LAB數量必須在105個以上才能保證青貯質量，然而自然條件下，青貯原料表面附著的好氧細菌數量要遠遠高于LAB數量[5]，因此青貯調制時需通過使用添加劑來直接或間接增加LAB數量，從而保證青貯發酵品質。

從本質上來講，飼草表面微生物區系影響青貯細菌群落的演替，進而影響了發酵產物。而由于飼草表面微生物特性存在差異，從而使發酵過程多樣化。例如由于地理和氣候因素，不同地區的飼草微生物多樣性存在明顯差異；由于植物對外界環境差異的適應性，當植物種類不同或是植物種類相同地區不同時，其表面附著的微生物群落都大不相同。因此，對飼草表面微生物和青貯發酵過程中微生物多樣性的變化進行研究，從青貯微生態系統的角度調控青貯發酵品質具有重要的研究和實踐價值。近年來，國內外研究人員將青貯微生物群落作為關注的重點，開展了大量研究。本文試圖就飼草青貯微生物多樣性研究進行階段總結，以期為基于青貯微生物群落的青貯發酵品質調控提供科學依據。

1 青貯過程中微生物的演替

許多細菌在飼草表面可以存活，但在選擇性培養基上不能培養，因此對其認知可能存在偏差。隨著高通量測序技術的發展和應用，使我們得以認識發酵過程中微生物群的組成和動態[6]。在起始階段，大腸桿菌(Escherichiacoli)大量繁殖，好氧細菌在前幾小時活躍，直到氧氣被消耗殆盡，LAB逐漸代替大腸桿菌，接著乳球菌屬(Lactococcus)開始大量繁殖，發酵體系pH隨之下降，從而抑制了酵母菌、霉菌及好氧細菌繁殖，隨著發酵進行，發酵體系pH進一步降低，更耐酸的乳桿菌屬(Lactobacillus)大量繁殖并主導發酵過程[7-8]。最后是有氧腐敗階段(二次發酵)，由于空氣的進入，使得青貯飼料的pH、溫度升高，促使霉菌、梭菌及其他好氧菌生長繁殖，從而影響青貯品質。青貯發酵過程中常見的微生物見表1。通常為了加快發酵進程、促進乳酸發酵，青貯添加劑被廣泛使用[3]。

表1 青貯發酵過程中常見的微生物Table 1 Normally micro-organisms in silage fermentation process[9]

2 飼草青貯微生物多樣性

2.1 不同區域飼草青貯微生物多樣性差異

由于地理、氣候條件的差異，使得飼草本身附著微生物群落結構有著極大的不同。因此青貯發酵體系中微生物群落的動態變化也各不相同。

青藏高原極端而獨特的生態環境及其在局部地區的變化可能導致牧草附生微生物適應性進化并產生多樣性，低海拔地區青貯中LAB包括戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、腸系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和棒狀乳酸菌(Lactobacilluscoryniformis)，而高海拔地區LAB則包括腸系膜乳桿菌(Lactobacillusmesenteroides)和短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)[10]。在青藏高原優勢物種垂穗披堿草(Elymusnutans)青貯飼料中的LAB主要包括6個屬，分別為腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬、片球菌屬(Pediococcus)、明串珠屬(Leuconostoc)、魏斯氏菌屬(Weissella)和乳球菌屬[11]；而熱帶氣候條件下的青貯飼料乙酸發酵能力較強，主要微生物可能由乳桿菌屬和腸桿菌屬(Enterobacter)組成，而研究人員已證實這2種微生物是熱帶青貯飼料中最可能的優勢菌屬[12-13]。

在我國的其他地區也有相關研究報道，且乳桿菌屬在大多數情況下為優勢菌群。如在北方地區采集的47個玉米(ZeamaysL.)青貯樣品中擇優選擇33個樣品，豐富度在屬水平排序依次為乳桿菌屬和醋酸菌屬[14]。在內蒙古自治區，盧強等[15]發現，苜蓿青貯不含添加劑的時候，除乳桿菌屬外，腸球菌屬、乳球菌屬也起主要作用。且隨著青貯發酵的發展，不同時期LAB的種類和豐度不同[15]。任海偉等[16]研究表明，甘肅白酒糟或菊芋渣混合發酵時優勢菌也為乳桿菌屬。劉蓓一等[17]在江蘇的相關研究表明，乳桿菌屬是大麥(HordeumvulgareL.)青貯的優勢菌屬，有氧暴露增加了有害菌不動桿菌屬(Acinetobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)的相對豐度。梁辛等[18]在廣西南寧的研究發現，在甘蔗梢自然青貯初期以乳桿菌屬、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)為主，發酵后期乳桿菌屬占據絕對優勢。但乳桿菌屬并非在所有飼草中都占據優勢地位，Li等[19]發現熱帶牧草柱花草青貯中優勢菌群為魏斯氏菌屬、腸桿菌屬和泛菌屬(Pantoea)。另外，有報道三江源試驗區燕麥及其組合飼草的葉部優勢菌群也以腸桿菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonas)及歐文氏菌屬(Erwinia)為主，篩選得到的優良菌株為腸桿菌屬的屎腸球菌(Enterococcusfaecium)[20]。

2.2 不同青貯原料青貯微生物多樣性差異

通常情況下，植物表面主要附著的細菌是好氧細菌，真菌是酵母菌和霉菌，對青貯發酵有利的LAB數量較少[21]。植物表面微環境如濕度、太陽輻射強度、植物表面結構以及營養元素分布等會影響附著微生物的構成。

2.2.1 不同牧草

一般來說，牧草表面附著的酵母菌數量為1～7 lg(CFU/g)FM，LAB數量為1～7 lg(CFU/g)FM，霉菌數量為1～6 lg(CFU/g)FM，有很大的變化范圍[22-26]。因種類、生長環境和生育期的不同而異。禾本科牧草上不僅附著LAB數量少，且不良微生物數量較多。例如青貯前虉草(PhalarisarundinaceaL.)上附著的LAB數量較少[1.4～1.8 lg(CFU/g)FM]，有大量的不良微生物，包括需氧細菌[4.6～5.9 lg(CFU/g)FM]、酵母菌[5.2～5.7 lg(CFU/g)FM]和霉菌[3.8～4.8 lg(CFU/g)FM][24]；而在典型的木本飼草辣木(Moringaoleifera)和團花樹(Neolamarckiacadamba)之中，研究人員發現青貯前藍細菌(Cyanobacterium)占優勢[24]。

2.2.2 同種牧草不同環境

苜蓿是一種豆科牧草，栽培面積大且營養豐富。馬召穩[27]發現苜蓿的青貯微生物群落中海洋桿菌屬(Oceanobacillus)、乳桿菌屬和芽孢桿菌屬(Bacillis)為優勢菌屬。與之不同的是，Ridwan等[28]發現苜蓿青貯生物群落優勢菌為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、干酪乳桿菌、短乳桿菌、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、黃桿菌(Flavobacterium)。造成這種差異的原因可能是地理位置的不同導致植物表面小氣候不同，影響了微生物區系，也可能是因為品種的不同。另外，由于青貯是一個動態的過程，自然新鮮的牧草表面附著微生物在組成和數量上都與青貯期間及完成之后差異明顯，而且附著的LAB數量在萎蔫過程中會增加一些[29]，但有研究表明，苜蓿萎蔫過程沒有改變LAB數量，但影響了多樣性，植物乳桿菌是未萎蔫青貯和萎蔫青貯中的優勢菌種[12]。

2.3 不同青貯添加劑對青貯微生物多樣性的影響

牧草表面的LAB以異型發酵菌為主，其數量無法達到優質青貯LAB數量的最低標準(105CFU/g FM)[30]，因此使用青貯添加劑來直接或間接增加LAB數量成為近幾十年來飼草保存中研究最廣泛的方向之一，其本質是通過調控微生物區系來改善飼草青貯發酵品質及營養特性。

2.3.1 LAB接種劑

長期以來，LAB作為青貯飼料接種劑，可與牧草附著的有害菌競爭營養物質并產生乳酸、乙酸及細菌素等代謝物質，抑制有害菌的活動與繁殖，有效地改善發酵品質、保存營養、避免腐敗[31]。因此，接種外源LAB后會抑制牧草本身附著的不利于青貯發酵的真菌及好氧細菌，抑制效果與牧草本身附著菌的特性及青貯條件有關。

有報道燕麥青貯接種耐低溫LAB增加了乳桿菌屬的相對豐度，并抑制了不良微生物梭菌的生長，更好地保存了高水分燕麥青貯的養分[32]。大麥青貯飼料接種微生物菌劑也有類似的效果，不良細菌不動桿菌屬和普羅威登菌屬(Providencia)等以及酵母菌中的伊薩酵母屬(Issatchenkia)和哈薩克斯坦酵母(Kazachstania)都受到抑制[33]。在莧菜(AmaranthusspinosusL.)和稻草(OryzasativaL.)混合青貯中加入植物乳桿菌，使LAB的相對豐度增加，腸桿菌科的相對豐度降低[34]；在綠麥和燕麥青貯的研究中發現，隨著青貯發酵的進行，早期優勢菌群腸球菌的地位在發酵后期被添加劑中的植物乳桿菌所替代，這有利于在青貯中后期建立穩定的LAB群落，長期保存青貯飼料[35]。抗菌肽具有有益于消化吸收的氨基酸成分，因此可作為一種替代抗生素的新型青貯飼料添加劑，以減少其對動物造成的危害。抗菌肽產生菌可作為調控牧草青貯發酵的新型添加劑[36]，有報道在苜蓿中添加產抗菌肽枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，發酵后提高了LAB的相對豐度，降低了腸球菌的相對豐度，改善青貯發酵品質并改變了青貯期間和好氧暴露后的細菌群落[37]。環境因素會對外源菌群產生一定的影響，添加劑和較低的室內環境溫度組合可以有效提高辣木葉青貯質量[38]。

蘆葦金絲雀草(PhalarisarundinaceaL.)接種布氏乳桿菌青貯后降低細菌α多樣性指數，改變青貯飼料中細菌群落的組成，但對青貯發酵和細菌群落組成的影響有限，說明LAB接種劑的效果存在差異[39]。虉草青貯飼料接種植物乳桿菌和布氏乳桿菌后細菌多樣性顯著下降，細菌組成發生改變，但乳桿菌屬的相對豐度并未受到影響，同樣也表明接種LAB影響有限[40]。

2.3.2 牧草附生微生物區系的移植

糞菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)是指健康供體糞便的微生物群落被整體轉移到受體體內的過程。因而受體可獲得有益細菌，改變腸道菌群組成[41]。其應用較為廣泛，最近的研究發現移植健康成年豬的糞便微生物群落可以明顯改變受體仔豬回腸中的菌群結構，增加結腸菌群的α多樣性。FMT組仔豬回腸中乳桿菌屬的相對豐度減少，棒狀桿菌屬(Corynebacterium)等的相對豐度增加。這說明早期FMT能夠調節腸道菌群的組成[42]。而將健康牛犢的糞菌移植到腹瀉的牛犢中，可以緩解腹瀉，并具有恢復其腸道微生物組成的能力[43]。

在改善青貯飼料微生物區系方面，菌群移植也可發揮正面作用。移植青貯玉米和本地紅三葉草附生菌群均有利于紅三葉草青貯發酵品質和微生物群落結構的改善，因此，移植并重建飼草附生微生物區系是一種有效、環保的青貯方法[44]。用蒸餾水和蘇丹草(Sorghumsudanense)、飼用高粱(Sorghumbicolor)、象草(Pennisetumpurpureum)和全株玉米(ZeamaysL.)4種牧草附著微生物對滅菌蘇丹草進行青貯，結果表明飼料高粱的附生菌群對蘇丹草青貯的微生物群落和發酵特性有積極影響[23]。

2.3.3 混合青貯

混合青貯是指2種及以上青貯原料混合后制作的青貯飼料。混合青貯的營養成分含量豐富，有利于LAB生長繁殖，可以更好地保存青貯飼料營養價值[45-48]。

添加富含可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrates，WSC)的多年生黑麥草可以降低富含蛋白質的構樹青貯的pH和附生微生物數量，對細菌群落有顯著影響，有益微生物如乳桿菌和魏斯氏菌在整個青貯時間內占主導地位，腸桿菌的數量顯著減少。Spearman秩相關分析表明，構樹青貯乳酸含量與乳桿菌和嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas)的相對豐度呈正相關，而氨態氮(NH3-N)含量與腸桿菌的相對豐度呈正相關[45]。混合玉米秸稈增加了啟封時乳桿菌的相對豐度(12.96%～50.82%)和暴露于空氣后伊薩酵母屬的相對豐度(2.02%～36.03%)，且一定程度上提高了有氧穩定性。研究表明，混合調制玉米秸稈可以改善稻草青貯飼料的發酵品質和營養成分[46]。Wang等[47]在華北平原進行了類似的研究，玉米與苜蓿混合，隨著玉米比例從0增加到40%，理想LAB的相對豐度增加，不良根瘤菌和甲基菌數量減少，并使菌群向更便于青貯飼料保存的方向轉移。使用發酵全混合日糧(fermentation total mixed ration，FTMR)是一種很有前途的保存飼料的方法，但發酵過程中的變化以及與FTMR菌群的聯系尚不完全清楚。添加22%燕麥青貯(oat silage，OS)的FTMR，發酵質量顯著提高，表現為丁酸濃度降低，乳酸/乙酸降低，LAB數量增加，腐敗酵母死亡速度加快；添加11%和22% OS后，出現了更多的異型發酵LAB，如布氏乳桿菌、短乳桿菌和魏氏乳桿菌；此外，添加22%的OS導致細菌相對豐度和多樣性顯著增加，以乳桿菌屬復合物為主。在LAB復合體的物種中，棒狀乳桿菌數量與乳酸、粗蛋白質和氨態氮含量呈正相關，表明其在改變發酵結構方面的潛在作用[48]。

2.3.4 酶接種劑

除了細菌接種劑，酶如纖維素酶(cellulase，CE)、半纖維素酶、果膠酶和淀粉酶等也常常添加在青貯飼料中，尤其是CE的應用最為廣泛。單獨使用CE和半乳糖苷酶(galactosidase，GA)以及與植物乳桿菌組合使用的處理大大增加了苜蓿青貯中乳桿菌屬的相對豐度[49]；CE和木聚糖酶用于甜高梁的青貯，可促進乳酸發酵，降低pH和微生物多樣性，抑制不良微生物，保證青貯質量[50]。在豆渣與玉米秸稈混合青貯中加入LAB、CE和LAB+CE，發現其細菌組成與對照組差異顯著，其中LAB +CE組乳桿菌屬數量顯著高于其他組，不良菌數量顯著低于其他組[51]。當植物乳桿菌和/或CE對高水分莧菜、稻秸混合青貯時，添加劑提高了乳桿菌屬的相對豐度，降低了魏斯氏菌屬、片球菌屬、乳球菌的相對豐度。綜合來看，以植物乳桿菌和纖維素酶混合處理青貯品質最好[52]。

2.3.5 有機酸

青貯飼料厭氧發酵過程中可產生乳酸、乙酸等有機酸，抑制腐敗相關細菌和真菌的生長，并有效保存青貯營養物質[3]，但有機酸作為青貯添加劑對青貯微生物的影響報道較少。有研究比較了一年生黑麥草和苜蓿青貯中添加LAB接種劑(LABi，106CFU/g)和甲酸(FA，3 mL/kg)的效果，結果發現2種添加劑均能降低其微生物多樣性，提高青貯品質[53]；He等[46]研究發現，丙酸的加入可以抑制辣木葉青貯和暴露在空氣中的微生物群落和脫酰胺活性。檸檬酸(citric acid，CA)是一種食品添加劑，添加CA可以提高砂仁葉片青貯飼料中LAB、片球菌和乳桿菌的相對豐度，降低大腸埃氏菌屬-志賀氏菌屬、腸桿菌屬和泛菌屬等不良微生物的相對豐度[54]；在對王草(king grass，KG)的研究中發現，植物乳桿菌和CA處理使KG青貯細菌多樣性降低，乳桿菌屬的相對豐度增加，不良菌屬假單胞菌屬的相對豐度降低，進而提高發酵品質[55]；在青貯木薯葉(cassava foliage，CF)中添加CA、蘋果酸(malic acid，MA)及其與植物乳桿菌混合添加，發現青貯飼料品質改善，微生物群落中類芽孢桿菌(平均27.81%)和芽孢桿菌含量(平均16.04%)提高，說明CA和MA可提高CF青貯品質，且與植物乳桿菌組合效果更佳[56]。沒食子酸(gallic acid，GA)可以作為一種綠色添加劑，在桑葉和柱花草(Stylosanthesguianensis)青貯飼料中添加GA，梭菌屬和腸桿菌屬的相對豐度降低，乳酸桿菌屬的相對豐度增加[57]；另外還發現GA提高了辣木葉的青貯品質、氨肽酶活性和抗氧化能力，其青貯微生物組成也隨之發生變化[58]。單寧酸(tannic acid，TA)是一種廣泛存在于植物中的多酚，具有抗菌特性和與蛋白質結合的能力，在桑葉和柱花草青貯中添加不同比例TA，均改善了桑葉和柱花草青貯的品質，增加了魏斯氏菌屬、不動桿菌屬的相對豐度，降低了梭菌屬的相對豐度，其中以2% TA為適宜的添加濃度[59]；在團花樹樹葉(Neolamarckiacadambaleaf，NCL；富含TA)單獨青貯或添加聚乙二醇(單寧失活劑)青貯的研究中發現，添加聚乙二醇處理優勢微生物群落為乳桿菌屬取代。這表明添加聚乙二醇使該原料本身的單寧失活，促進了青貯飼料的乳酸發酵并抑制蛋白質降解[60]。

3 小結與展望

無論是飼草本身附著的還是外源添加的微生物，其組成和數量都決定著發酵過程中的青貯微生物群落結構和演替，進而影響青貯發酵品質。不同區域的環境因素、飼草種類以及青貯添加劑類型都不同程度地影響著飼草青貯微生物多樣性。目前的研究集中在常規青貯添加劑產生的影響，未來應更多的研究新型綠色添加劑，如具有活性成分的植物提取物、具有抑菌活性的代謝產物以及鄉土益生微生物資源及其組合利用。另外，青貯研究手段隨著三代測序、代謝組、宏基因組和宏轉錄組等技術的成熟與應用，在種水平鑒定優良青貯微生物，通過差異代謝物、差異基因表達、功能基因和代謝調控網絡的構建等，闡明微生物在青貯發酵中的作用及其對青貯添加劑的響應機制，為青貯發酵品質的調控、新型青貯添加劑的研發提供科學依據。