姜黃素提高人前列腺癌細胞系PC-3放療敏感性

程 繼，付 國，趙華才，王志剛，高 丹，董青川

(陜西省人民醫院 泌尿外科,陜西 西安 710068)

前列腺癌(prostate cancer)是常見的惡性腫瘤，放射治療是常規手段，但輻射抵抗是目前面臨的臨床難題，降低患者臨床治療效果，嚴重影響患者康復和生活質量[1-2]。多酚類物質姜黃素(curcumin)是姜黃中最重要的有效活性成份，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等的藥理作用[3-4]。研究發現[5-6]，姜黃素可調控p53、Nrf2等信號通路，抑制結胰腺癌、乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤的病理進程。姜黃素可降低IκB 激酶磷酸化水平，抑制NF-κB活性，減少IL-6和IL-11等細胞因子分泌，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖等[7]。但是否姜黃素可作為一種放射增敏劑，提高前列腺癌放射治療的敏感性，其具體分子機制和信號通路如何？目前仍需進一步實驗依據來證實。本實驗中，前列腺癌細胞PC-3給予體外放射治療處理，同時聯合應用姜黃素，觀察前列腺癌細胞增殖和細胞周期的變化，明確姜黃素是否具有放射增敏效應，同時分析和闡明其具體作用的分子機制，為前列腺癌臨床放射治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

人前列腺癌細胞系PC-3(ATCC公司)；姜黃素(curcumin，Sigma-Aldrich公司)；caspase活性檢測試劑盒(江蘇碧云天公司)；MTT試劑盒(Abcam公司)；血清、Annexin V、PI(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組和處理：將細胞分為對照組、放射組(4 Gy，1次/2 d，共2次，劑量率2.4 Gy/min)，姜黃素組(10 μmol/L，3 d)，放射+姜黃素組(4 Gy + 10 μmol/L)。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖：將細胞接種于96孔培養板，5×103個/孔，收集細胞，通過MTT法觀察上述處理方式對PC-3細胞增殖的影響。

1.2.3 RT-qPCR檢測mRNA：分別給予4 Gy劑量的放射處理和10 μmol/L的姜黃素。收集上述細胞，提取RNA，通過定量PCR觀察PCNA mRNA表達變化，分析各組間差異。

1.2.4 流式細胞儀測定細胞周期：收集細胞，70%的乙醇固定和碘化丙啶染色，通過流式細胞儀測定各組細胞周期的變化。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡：收集各組細胞，與Annexin V/PI溶液室溫孵育30 min，流式細胞儀檢測不同處理組細胞凋亡率。

1.2.6 Caspase活性的檢測：按caspase活性檢測試劑盒操作規范要求，處理細胞，離心20 min，2 000 r/min，上清孵育60 min，測定各組樣品吸光度值的變化。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 姜黃素聯合放射治療對細胞增殖的影響

放射治療和姜黃素處理組細胞，其細胞存活率均低于對照組(P<0.05)；而姜黃素聯合放射治療組，其細胞存活率低于放射組(P<0.05)(表1)。放射治療和姜黃素組處理組細胞，其細胞中PCNA mRNA水平低于對照組(P<0.05)；而姜黃素聯合放射治療組，其細胞中PCNA mRNA水平低于放射組細胞(P<0.05)(圖1)。

表1 姜黃素聯合放射治療對細胞增殖率的影響Table 1 Effect of curcumin combined with irradiation on cell proliferation n=6)

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with irradiation group圖1 姜黃素聯合放射治療對PCNA mRNA水平的影響Fig 1 Effect of curcumin combined with irradiation on PCNA mRNA

2.2 姜黃素聯合放射治療對細胞周期的影響

放射治療和姜黃素處理組細胞，其S期和G2/M期細胞比例均高于對照組(P<0.05)；而姜黃素聯合放射治療組，其S期和G2/M期細胞比例高于單獨放射治療組(P<0.05)(表2，圖2)。Cdc2分子mRNA水平直接反應腫瘤細胞G2/M期水平，放射治療和姜黃素處理組細胞，其細胞中Cdc2 mRNA水平均低于對照組PC-3細胞(P<0.05)；而姜黃素聯合放射治療組，其細胞中Cdc2 mRNA水平低于放射組細胞(P<0.05)(圖3)。

圖2 姜黃素聯合放射治療對細胞周期的影響Fig 2 Effect of curcumin combined with irradiation on cell cycle

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with irradiation group圖3 姜黃素聯合放射治療對Cdc2 mRNA水平的影響Fig 3 Effect of curcumin combined with irradiation on Cdc2 mRNA

表2 姜黃素聯合放射治療對細胞周期的影響Table 2 Effect of curcumin combined with irradiation on cell cycle n=6)

2.3 姜黃素聯合放射治療對細胞凋亡的影響

放射治療和姜黃素處理組細胞，其細胞凋亡率高于對照組(P<0.05)；姜黃素聯合放射治療組，其細胞凋亡率高于單獨放射治療組(P<0.05)(表3，圖4)。放射治療和姜黃素處理組細胞，其細胞中caspase-9和caspase-3活性高于對照組(P<0.05)；姜黃素聯合放射治療組，其細胞中caspase-9和caspase-3活性高于單獨放射治療組(P<0.05)(圖5)。

圖4 姜黃素聯合放射治療對細胞凋亡率的影響Fig 4 Effect of curcumin combined with irradiation on cell apoptosis

表3 姜黃素聯合放射治療對細胞凋亡率的影響Table 3 Effect of curcumin combined with irradiation on cell apoptosis

3 討論

腫瘤是目前發達國家位居第一位的死亡因素，但腫瘤耐藥性和放射抵抗性等因素，嚴重影響腫瘤治療的臨床效果[8]。前列腺癌是常見惡性腫瘤，研究其分子機制，尋找新的治療靶點和手段，提高臨床療效，減輕常規化療藥物和放射治療引起的副作用，對于改善患者生存質量，具有重要的臨床意義。

姜黃素作為一種傳統植物藥物，因其抗氧化和抗炎效應，已被認定為天然健康保健品[9]。在炎性反應、風濕、代謝紊亂、肝臟疾病、肥胖、神經退行性疾病和惡性腫瘤等疾病中，姜黃素的藥理效應具有廣泛的應用[10]。姜黃素可顯著降低IκB 激酶磷酸化水平，抑制NF-κB活性，阻止NF-κB亞單位p65核轉錄作用，抑制腫瘤細胞增殖[11]。

PCNA 分子mRNA水平可反應腫瘤細胞增殖的狀態[12]，研究發現：經姜黃素聯合放射治療處理的前列腺癌細胞，其存活率低于放射組細胞，同時其細胞中PCNA mRNA水平低于放射組細胞，表明姜黃素可通過抑制前列腺癌細胞中PCNA 分子水平，增加腫瘤細胞對放射治療的敏感性。細胞周期變化和放射敏感性有關，Cdc2分子mRNA水平可直接反映腫瘤細胞周期變化[13]，姜黃素聯合放射治療處理后，可增加S期和G2/M期細胞比例，降低Cdc2 mRNA水平，提示姜黃素可通過調控細胞周期，引起G2/M期阻滯效應，增加腫瘤細胞放射敏感性，發揮放射增敏效應。Caspase-3和caspase-9是調控細胞凋亡信號傳導的關鍵分子，在腫瘤細胞凋亡進程中發揮著關鍵作用[14]。Caspase-3和caspase-9分別通過啟動死亡受體途徑和線粒體途徑，誘導腫瘤細胞凋亡。FasL、TRAIL等信號分子可激活caspase-3途徑，而細胞線粒體跨膜電位變化和細胞色素C是caspase-9途徑的活化因素[15]。研究發現：經姜黃素聯合放射治療處理后，可增加前列腺癌細胞中caspase-9和caspase-3活性，同時提高PC-3細胞凋亡率，表明姜黃素可通過調控細胞凋亡相關的因素，提高腫瘤細胞放射敏感性。

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with irradiation group圖5 姜黃素聯合放射治療對caspase活性的影響Fig 5 Effect of curcumin combined with irradiation

本研究結果表明，姜黃素具有明顯的放射增敏效應，可抑制前列腺癌細胞增殖、調控caspase活性、誘導腫瘤細胞凋亡、影響細胞周期，增加腫瘤細胞的放射治療效果。姜黃素的這一放射增敏效應，可作為潛在的放射增敏劑，提高臨床放射治療效果，將為前列腺癌放射治療提供新策略。