lncRNA RAB11B-AS1上調(diào)miR-628-3p抑制人胃癌細(xì)胞系增殖和遷移

楊寧波，賈曉東，寇 耀

(遂寧市中心醫(yī)院 胃腸外科，四川 遂寧 629000)

胃癌是常見的消化道腫瘤之一，化學(xué)藥物治療(簡(jiǎn)稱化療)是胃癌的重要治療方式之一，然而化療耐藥是導(dǎo)致化療效果不佳或失敗的重要原因，因此，提高癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性對(duì)提高臨床化療療效意義重大[1]。而深入研究腫瘤細(xì)胞的耐藥分子機(jī)制可為提高胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性提供有效策略。lncRNA廣泛地參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，且參與調(diào)控胃癌的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥發(fā)生等[2]。如lncRNA RAB11B-AS1在胃癌組織中高表達(dá)，可作為胃癌診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在分子標(biāo)志物[3]。lncRNA RAB11B-AS1在體外可增加乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并促進(jìn)腫瘤血管生成和乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。然而lncRNA RAB11B-AS1對(duì)胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響及機(jī)制尚不清楚。研究顯示，miRNA與胃癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后及化療耐藥等密切相關(guān)[5]。提高miR-628-3p表達(dá)水平能抑制HGC-27細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期阻滯于G1期及S期，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。而miR-628-3p對(duì)胃癌HGC-27細(xì)胞順鉑耐藥性的影響尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究lncRNA RAB11B-AS1是否通過調(diào)控miR-628-3p影響胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及順鉑耐藥性。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃黏膜細(xì)胞系GES-1和胃癌細(xì)胞系HGC-27(ATCC公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(上海浩然生物技術(shù)有限公司)；順鉑(上海北諾生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(TaKaRa公司)；RIPA蛋白裂解液、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；Transwell小室、Matrigel(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 順鉑耐藥胃癌細(xì)胞系的建立：HGC-27用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)增殖期HGC-27細(xì)胞，依次用濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L的順鉑培養(yǎng)存活細(xì)胞，每一濃度連續(xù)傳代3次；將在0.4 mg/L濃度下存活的細(xì)胞命名為HGC-27/DDP。

1.2.2 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與分組：取對(duì)數(shù)生長期HGC-27/DDP的細(xì)胞，將si-NC、si-RAB11B-AS1轉(zhuǎn)染至HGC-27/DDP細(xì)胞中，分別記為si-NC組、si-RAB11B-AS1組；正常培養(yǎng)的HGC-27/DDP細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率：取分別用0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L順鉑培養(yǎng)的HGC-27、HGC-27/DDP細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞不作任何處理，按試劑盒說明操作，檢測(cè)490 nm處吸光度值(A)。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組A值的比值為細(xì)胞存活率；其他各組細(xì)胞存活率均按上述方法進(jìn)行。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)RAB11B-AS1和miR-628-3p的表達(dá)水平：提取培養(yǎng)48 h細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以GAPDH和U6為內(nèi)參進(jìn)行PCR，相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：培養(yǎng)各組細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，并制備單細(xì)胞懸液，按試劑盒說明操作，上機(jī)檢測(cè)激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，重復(fù)3次。用流式細(xì)胞儀和DNA細(xì)胞周期分析軟件進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.2.6 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲：遷移實(shí)驗(yàn)：將無血清培養(yǎng)的200 μL細(xì)胞懸液加入到Transwell上室，下室加含血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，然后用結(jié)晶紫染色，顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：用Matrigel包被Transwell上室，其余同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測(cè)Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)：提取細(xì)胞總蛋白，定量后進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗和二抗孵育，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影，定影，成像，檢測(cè)蛋白條帶吸光度，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RAB11B-AS1和miR-628-3p的靶向關(guān)系：使用PCR擴(kuò)增包含miR-628-3p結(jié)合位點(diǎn)的RAB11B-AS1序列片段，并構(gòu)建至熒光素酶表達(dá)載體中，獲得RAB11B-AS1野生型載體(WT-RAB11B-AS1)，將RAB11B-AS1序列AC UUACUAGA突變?yōu)锳GCACAAGCC，獲得RAB11B-AS1突變型載體(MUT-RAB11B-AS1)，將其分別與miR-NC和miR-628-3p共轉(zhuǎn)染至HGC-27/DDP細(xì)胞中，按說明書檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 順鉑藥物對(duì)HGC-27和HGC-27/DDP細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組相比，0.2、0.4 mg/L順鉑處理后HGC-27細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，而0～0.4 mg/L順鉑處理后HGC-27/DDP細(xì)胞存活率無顯著變化(表1)。表明胃癌順鉑耐藥細(xì)胞建立成功。

表1 順鉑藥物對(duì)HGC-27和HGC-27/DDP細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effect of cisplatin drugs on the survival rate of HGC-27 and HGC-27DDP

2.2 RAB11B-AS1在HGC-27、HGC-27/DDP中的表達(dá)

與GES-1相比，胃癌細(xì)胞HGC-27和胃癌順鉑耐藥細(xì)胞HGC-27/DDP中RAB11B-AS1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，且HGC-27/DDP中RAB11B-AS1表達(dá)水平顯著高于胃癌細(xì)胞HGC-27(P<0.05)(表2)。

表2 RAB11B-AS1在HGC-27、HGC-27/DDP細(xì)胞中的表達(dá)Table 2 Expression of RAB11B-AS1 in HGC-27 and

2.3 干擾RAB11B-AS1對(duì)HGC-27/DDP增殖、遷移、侵襲的影響

與對(duì)照組組和si-NC組相比，si-RAB11B-AS1組G0-G1期細(xì)胞所占比例顯著升高，S期細(xì)胞所占比例顯著降低(P<0.05)，G2-M期細(xì)胞所占比例無變化；細(xì)胞存活率顯著降低，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)(表3)。

表3 干擾RAB11B-AS1對(duì)HGC-27/DDP增殖遷移侵襲的影響Table 3 Effect of RAB11B-AS1 interference on proliferation,migration and invasion of

2.4 干擾RAB11B-AS1對(duì)HGC-27/DDP細(xì)胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin表達(dá)的影響

與對(duì)照組組和si-NC組相比，si-RAB11B-AS1組RAB11B-AS1表達(dá)水平顯著降低，Ki67、N-cadherin表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(表4,圖1)。

圖1 Western blot檢測(cè)Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達(dá)Fig 1 Western blot detection of Ki67,E-cadherin and N-cadherin protein expression

表4 干擾RAB11B-AS1對(duì)HGC-27/DDP細(xì)胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin表達(dá)的影響Table 4 Effect of interference with RAB11B-AS1 on the expression of Ki67,E-cadherin and N-cadherin

2.5 RAB11B-AS1靶向調(diào)控miR-628-3p

RAB11B-AS1與miR-628-3p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。miR-628-3p與WT-RAB11B-AS1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)(表5)。si-RAB11B-AS1組miR-628-3p表達(dá)水平為2.77±0.07，顯著高于0.98±0.05(P<0.05)。

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)Table 5 Dual luciferase report

圖2 RAB11B-AS1靶向miR-628-3pFig 2 RAB11B-AS1 targeted miR-628-3p

3 討論

順鉑(cisplatin，DDP)是臨床上應(yīng)用廣泛的化療藥物，其存在一定副作用，且其耐藥性的產(chǎn)生使其療效大大減弱[7]。胃癌細(xì)胞也易對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性，為研究胃癌細(xì)胞的順鉑耐藥性的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)建立胃癌順鉑耐藥細(xì)胞株HGC-27/DDP，在順鉑濃度大于0.2 mg/L時(shí)胃癌細(xì)胞HGC-27的存活率顯著降低，而HGC-27/DDP細(xì)胞的存活率在順鉑濃度為0.4 mg/L時(shí)也無顯著變化，說明HGC-27/DDP相比HGC-27細(xì)胞更耐藥，耐藥細(xì)胞株建立成功。

LncRNA參與調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，且lncRNA還可影響胃癌的順鉑耐藥性，如lncRNA UCA高表達(dá)會(huì)促進(jìn)胃癌順鉑耐藥[8-9]。LncRNA MEG3過表達(dá)可增加胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RAB11B-AS1在胃癌細(xì)胞HGC-27和HGC-27/DDP中高表達(dá)，且HGC-27/DDP細(xì)胞中RAB11B-AS1表達(dá)水平高于HGC-27細(xì)胞；提示RAB11B-AS1或與胃癌細(xì)胞順鉑耐藥性相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過干擾RAB11B-AS1，結(jié)果顯示，G0/G1期細(xì)胞所占比例升高，S期細(xì)胞所占比例降低；細(xì)胞存活率降低，遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)降低，Ki67、N-cadherin表達(dá)水平降低，E-cadherin表達(dá)水平升高。Ki67是一種細(xì)胞增殖核抗原，與細(xì)胞增殖息息相關(guān)，且研究還發(fā)現(xiàn)Ki67的表達(dá)與胃癌患者TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[11]。E-cadherin、N-cadherin是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志物，其表達(dá)水平與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明干擾RAB11B-AS1可抑制HGC-27/DDP細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，且阻滯細(xì)胞周期，表明干擾RAB11B-AS1可提高HGC-27細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。

本實(shí)驗(yàn)研究RAB11B-AS1對(duì)胃癌細(xì)胞的影響的進(jìn)一步的可能作用機(jī)制，通過Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)其可能的靶miRNA，結(jié)果顯示，RAB11B-AS1與miR-628-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，且證實(shí)RAB11B-AS1可靶向調(diào)控miR-628-3p的表達(dá)。研究報(bào)道m(xù)iR-628-3p可抑制HGC-27細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[6]。且miR-628-3p可促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡并抑制肺癌A549細(xì)胞遷移[13]。miR-628可抑制急性髓性白血病細(xì)胞增殖，并在體外誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡[14]。提示，RAB11B-AS1對(duì)胃癌細(xì)胞的影響可能與miR-628-3p表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，抑制lncRNA RAB11B-AS1可能通過上調(diào)miR-628-3p抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并提高對(duì)順鉑的敏感性。