miR-146a減輕心肌缺血/再灌注損傷(MI/RI)大鼠的心肌細胞凋亡

鄭 新，于海波

(佳木斯大學附屬第一醫院 心血管內三科，黑龍江 佳木斯 154002)

缺血性心臟病是一種全球性、對人類健康危害極大的心臟疾病。治療過程中血流急速再灌注導致心肌負荷過大在很大程度上損傷了心肌細胞，致使細胞凋亡數量大大增加造成組織損傷進行性加重，此過程被稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI)[1]。研究顯示，在該病患者的血液中檢測發現心肌酶水平明顯升高[2]。Toll樣受體(TLR)4作為能夠介導多種細胞因子活化的細胞受體有報道顯示其在心肌組織灌注受損時呈現過表達，可能介導了MI/RI的炎性反應[3]。微小RNA(miRNA)是近些年發現的一種新的基因表達調節物，miR-146a定位于人類5號染色體，具有免疫調節作用[4]。然而目前關于miR-146a在MI/RI的作用效果及作用原理的相關研究未見報道。因此本實驗通過對大鼠模擬MI/RI，探討miR-146a對該病大鼠的血清心肌酶譜、TLR4及心肌細胞凋亡作用的影響機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:SPF級SD大鼠36只，雄性，體質量220～250 g，7～8周齡，實驗室平均溫度(22±2)℃，相對濕度60%，常規喂養(上海賽倫生物公司，動物實驗倫理委員會批準，批準號20160071)。

1.1.2 試劑:烏拉坦(武漢卡布達公司)、一抗TLR4兔抗鼠抗體、TNF-α兔抗鼠抗體、NF-κB兔抗鼠抗體及二抗(武漢艾美捷公司)、TUNEL試劑盒(Roche公司)、PVDF膜(Millipore公司)；RT-qPCR試劑盒(廣州東盛生物科技有限公司)；cTnT檢測試劑盒、CK-MB檢測試劑盒(上海佰曄生物公司)和LDH檢測試劑盒(合肥萊爾生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠分為假手術組(sham)、模型組(model)、miR-146a NC組(結扎后轉染miR-146a-NC)、miR-146a agomir組(結扎后轉染miR-146a-a agomir)，均9只。各組大鼠分為建模方法參考[5]，采用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，連接小動物呼吸機，呼吸器(60次/min)，潮氣量為13～15 mL，分離皮膚，于第4肋骨處開胸，從左側4肋間進入胸腔，用7-0滑線結扎冠狀動脈左前降支30 min，然后解開結扎線恢復血管通暢，冠狀動脈再灌注4 h后縫合胸腔，建立心肌缺血再灌注動物模型。假手術大鼠僅開胸后縫合。通過2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色方法評估各組大鼠心肌梗死面積。

1.2.2 TTC 染色觀察大鼠心肌梗死體積所占百分比：取大鼠心臟剔除周圍組織置入甲醛溶液中固定，保存在-80 ℃的環境下，5 min后將厚度為2 mm額極向后冠狀面儲存于1%濃度的TTC溶液中。在無光環境下37 ℃孵育，將心肌組織翻動一次，5 min/次，成功染色后，正常心肌組織為紅色，梗死組織為白色，用專業圖像分析軟件處理并分析圖像，計算大鼠心肌梗死體積所占百分比。

1.2.3 RT-qPCR檢測心肌組織中miR-146a、TLR4表達：取大鼠心肌組織，用Trizol進行總RNA的提取并測定總RNA濃度、純度，反轉錄參照試劑盒說明書執行,將逆轉后所得的cDNA通過Eppendorf MAS熒光定量 PCR分析系統進行檢測。所有反應嚴格按照反應的條件進行擴增,內參采用β-actin，目的基因的相對表達用2-△△Ct表示(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4 心肌酶譜活性的檢測：多次采集眼眶全血6 mL，放置20 min(25 ℃)，2 000 r/min離心10 min，血清-70 ℃凍存。用比色法檢測血清cTnT、CK-MB和LDH活性。

1.2.5 大鼠心肌組織形態學的觀察：心肌組織切片石蠟包埋，5 μm切邊，脫蠟10 min后利用95%乙醇水化，采用堿性蘇木精進行染色15 min，PBS沖洗3次，蒸餾水清洗，再利用0.5伊紅染色3 min，PBS透明，HE染色并在顯微鏡下觀察心肌組織細胞病理狀態。

1.2.6 TUNEL染色法檢測心肌細胞凋亡率：心肌組織進行石蠟切片，2 μm的5張，按照TUNEL試劑盒操作說明進行TUNEL染色處理，胞核黃染為凋亡細胞。采用400倍光學顯微鏡在每一張切片選取5個不重疊的視野進行觀察并分別取凋亡細胞、細胞總數的均值。凋亡率(%)=凋亡細胞/總細胞數×100%。

1.2.7 Western blot測定心肌組織中TLR4蛋白的表達：取心肌組織100 mg，0.125%胰蛋白酶消化，離心取上清液。另取50 mg心肌組織提取核蛋白。Bradford法測蛋白濃度并將濃度調整為5 mg/L，取50 μL蛋白樣品電泳，轉膜，封閉，加入一抗1∶5 000(TLR4、TNF-α、NF-κB)后TTBS漂洗，間隔10 min,一共3次漂洗,最后加入二抗1∶1 000對溶液稀釋,封閉1 h(25 ℃)。取出PVDF膜吐溫Tris緩沖液每10 min清洗，共3次，DAB顯色后照相。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 TTC染色檢測心肌梗死面積變化

假手術組、模型組、miR-146a-NC組及miR-146a agomir組心肌梗死面積分別為(2.56±0.50)%、(45.20±4.23)%、(43.05±3.69)%和(22.15±2.03)%，組間比較存在差異(P<0.05)。模型組與假手術組相比，心肌梗死區域(白色)面積增加(P<0.05)，與模型組相比，miR-146a agomir組心肌梗死區域(白色)面積降低(P<0.05)(圖1)。

圖1 4組心肌梗死面積變化Fig 1 Changes of myocardial infarction area in 4 groups

2.2 RT-qPCR檢測心肌組織大鼠miR-146a、TLR4 mRNA表達

模型組與假手術組相比miR-146a mRNA表達降低(P<0.05)，與模型組相比，miR-146a agomir組miR-146a mRNA表達升高(P<0.05)，說明轉染成功。模型組與假手術組相比，TLR4 mRNA表達升高(P<0.05)，與模型組相比，miR-146a agomir組TLR4 mRNA表達降低(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with sham operation group;#P<0.05 compared with the model group；△P<0.05 compared with miR-146a NC group圖2 4組大鼠心肌組織中miR-146a、TLR4mRNA表達量Fig 2 Expression levels of miR-146a and TLR4 mRNA in myocardial tissue of rats in the 4 groups

2.3 比色法檢測大鼠血清心肌酶譜活性

模型組與假手術組相比大鼠血清cTnT、CK-MB、LDH 活性增加(P<0.05)，與模型組相比，miR-146a agomir組上述指標均活性降低(P<0.05)(表2)。

表2 4組大鼠血清心肌酶譜活性比較Table 2 Comparison of myocardial enzyme activity in serum of 4

2.4 大鼠心肌組織形態學觀察

假手術組心肌細胞分布較為整齊有規律、胞間距較小。模型組、miR-146a NC組心肌肌纖維斷裂腫脹、間質充血明顯、結構消失、細胞多處壞死界限不清，miR-146a agomir組與模型組、miR-146a NC組相比水腫減輕，上述病理均有一定改善(圖3)。

圖3 4組心肌組織形態學變化Fig 3 Morphological changes of myocardial tissue in 4 groups(×200)

2.5 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡

模型組與假手術組相比心肌細胞凋亡數目增加(均P<0.05)，與模型組相比，miR-146a agomir組細胞凋亡數量明顯減少(P<0.05)(圖4)。

2.6 Western blot法檢測TLR4、TNF-α、NF-κB蛋白表達

模型組與假手術組相比大鼠心肌組織中TLR4、TNF-α、NF-κB蛋白明顯升高(均P<0.05)，miR-146a agomir組上述蛋白表達較miR-146a NC組、模型組明顯降低(P<0.05)(圖5)。

3 討論

MI/RI是復雜的多因素多途徑的綜合性病理生理過程，發生于犬類心臟冠狀動脈結扎模型中[6]。本文建立心肌缺血/再灌注動物模型后轉染miR-146a-a agomir能夠顯著改善心肌組織病理損傷，降低心肌細胞凋亡，抑制心肌酶譜水平，作用機制通過抑制相關信號通路表達而實現。

*P<0.05 compared with sham group;#P<0.05 compared with the model group；△P<0.05 compared with miR-146a NC group圖4 4組大鼠心肌細胞凋亡情況Fig 4 Apoptosis of myocardial cells in 4 groups(×200,

*P<0.05 compared with sham operation group;#P<0.05 compared with the model group；△P<0.05 compared with miR-146a NC group圖5 4組大鼠心肌組織蛋白表達情況Fig 5 Expression of protein in myocardial tissue of rats in 4

miRNA是一種能夠通過DNA調控基因表達的保守型非編碼短鏈RNA序列，其可以誘發的mRNA降解在細胞增殖、分化等功能中意義重大[7]。miRNA的特異性表達在心力衰竭、心肌細胞凋亡等病理進程中具有關鍵性作用[8]。miR-146a是具有免疫調控功能的mRNA。對24只I/R炎性腸損傷建模大鼠進行試驗檢測發現miR-146a在大鼠肝組織中呈現低表達并介導TLR4活化刺激肝組織炎性損傷[9]。然而目前尚無關于miR-146a在MI/RI中作用的研究報道，本文研究結果顯示miR-146a過表達的miR-146a agomir組大鼠心肌細胞凋亡較模型組、miR-146a NC組明顯減少。HE染色觀察到miR-146a agomir組的細胞壞死、病灶范圍等情況較模型組、miR-146a NC組有所改善，以上結果均說明過表達miR-146a在心肌細胞的凋亡中發揮抑制作用。

cTnT、CK-MB主要分布在心肌組織中，其表達與患者損傷嚴重程度成正比。LDH存在于骨骼肌、心肌中，其表達的提高也間接提示了心肌受損[10]。48例心肌梗死患者血清檢測中發現miR-302b表達上調與心肌細胞損傷相關，可誘導患者心肌細胞壞死或凋亡，同時研究還證實了miR-302b的表達上調與cTnT、CK-MB、LDH的表達呈正相關，提示cTnT、CK-MB、LDH高表達可加重心肌梗死患者心肌細胞損傷程度[11]。學者研究發現鹿茸多肽能夠通過抑制血清中心肌酶譜的表達改善MI/RI[12]。本文研究結果與之相似，推測miR-146a對大鼠MI/RI的保護作用與降低心肌酶譜水平相關。

TLR4源自TLRs家族，是一種存在于機體所有細胞系的炎性跨膜受體，能夠識別配體產生促炎以及炎性趨化因子引發機體炎性反應，在感染性疾病研究中廣受關注[13]。TNF-α、NF-κB是TLR4的下游因子，TLR4激活后能夠刺激TNF-α產生炎性反應，促使正常細胞凋亡，使心肌損傷嚴重化，而NF-κB能夠調控TLR4下游多種細胞因子的合成表達，其激活后可產生TNF-α形成惡性循環系統[14]。學者在研究中發現給MI/RI大鼠注射吳茱萸次堿能夠減少MI/RI大鼠心肌細胞凋亡數量對大鼠心臟起到保護作用，并證實吳茱萸次堿對MI/RI大鼠的保護作用的發揮是通過截斷TLR4信號通路阻止TLR4、NF-κB蛋白表達實現的[15]。結果顯示TLR4拮抗劑干預的MI/RI小鼠心功能能得到改善，TLR4表達量顯著降低，血清促炎因子濃度降低而抗炎因子指標上升。結果證實了TLR4表達下調后抑制炎性反應對小鼠MI/RI起保護作用。因此推測miR-146a對大鼠MI/RI的保護作用與降低TLR4表達相關。

綜上所述，miR-146a在MI/RI大鼠心肌細胞中低表達發揮促細胞凋亡作用，其上調后可通過降低心肌酶譜水平及TLR4表達，減少心肌細胞凋亡進而保護大鼠MI/RI。