達格列凈降低心力衰竭大鼠心肌內質網應激并緩解左室重構

張志敏，茍麗沙，馬麗群，任 可，路 軍，魏 星，李慧杰，周圣華*

(新疆軍區總醫院 1.心內科；2.保健科，新疆 烏魯木齊 830000)

心力衰竭(heart failure)是各種心臟疾病的嚴重表現或晚期階段，持續高血糖、缺血缺氧、血壓升高等可單獨或協同誘導心肌細胞肥大、損傷、凋亡，引起心室重構，最終導致心力衰竭。除經典改善心力衰竭、保護心肌細胞藥物外，近年研制的新型降糖藥物-達格列凈(鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2抑制劑)可明顯改善糖尿病和非糖尿病心力衰竭患者的預后，具有顯著的獨立于降糖作用之外的心血管保護作用[1-2]。達格列凈是中國心力衰竭指南中明確指出的具有心血管保護作用的降糖藥[3]，但其獨立的心血管保護機制仍不清楚。內質網應激是多種心血管疾病發生發展的共同分子機制之一，高糖、高血壓、高同型半胱氨酸血癥、缺血缺氧刺激等都可誘導心肌細胞內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[4-6]，而上述刺激因素持續存在可激活ERS相關促凋亡蛋白如CHOP、caspase12等，調控細胞凋亡發生。因此有效抑制ERS對細胞起保護作用，達格列凈是否有抑制心肌細胞ERS功效尚不可知。本研究通過主動脈縮窄(transverse aortic contriction,TAC)術建立心力衰竭大鼠模型，使用不同劑量達格列凈干預治療，觀察其對心力衰竭大鼠心臟結構及功能的影響及探討其潛在心肌保護分子機制，為達格列凈臨床應用提供新的理論依據。

1 材料及方法

1.1 動物及試劑

SPF級6～8周齡成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠20只，體質量180～200 g(新疆軍區總醫院實驗動物中心，動物合格證編號：LJ-20206587)。達格列凈片(諾華制藥中國)；兔抗大鼠GRP78抗體及兔抗大鼠caspase12抗體和堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理:將大鼠分為對照組，腹主動脈縮窄(TAC)模型組,達格列凈干預組(每日1次灌胃給予達格列凈0.5和1.0 mg/kg)，每組5只，實驗共12周。

1.2.2 大鼠血壓值及心肌肥厚指數HWI及LVWI的測定:采用無創鼠尾血檢測系統檢測大鼠血壓值，將大鼠放入無創鼠尾血壓檢測系統筒形固定器中，將脈壓套置大鼠尾部近心端處，高敏脈搏換能器置于尾巴中上1/3處并固定，待脈搏穩定后測量血壓。記錄其心率，平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)=[舒張壓+1/3(收縮壓-舒張壓)]。大鼠禁食不禁水24 h，稱取大鼠體質量(body weight,BW)，使用戊巴比妥鈉充分麻醉大鼠后開胸剪取心臟，剪去主動脈根部及脂肪組織，稱取全心質量(heart weight,HW)。再剪去心房及右心室，保留室間隔及左心室，稱取左心室質量(left ventricular weight,LVW)。計算HWI(HW/BW)和LVWI(LVW/BW)比值。

1.2.3 大鼠心臟功能及心肌組織HE染色形態學觀察:采用小動物超聲檢測大鼠心臟功能，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠安靜后，使用13 MHz M型超聲探頭連續測量5個心動周期。記錄左心室收縮末期容積、左心室舒張末期容積、左心室收縮末期內徑、左心室舒張末期內徑，以計算EF及ES。將新鮮大鼠心肌組織置于多聚甲醛中固定后，經不同濃度乙醇梯度脫水，石蠟包埋，沿心臟縱軸連續切片，使用HE染色，置于光鏡下觀察心肌組織形態改變。

1.2.4 免疫組化檢測大鼠心肌組織中GRP78及CHOP的表達:將大鼠心肌組織的石蠟切片經脫蠟→脫水→雙氧水封閉→抗原修復→非特異性抗原封閉等步驟后，分別滴加1∶100比例稀釋的兔抗大鼠GRP78及caspase 12一抗，4 ℃冰箱中孵育過夜。室溫復溫20 min后PBS洗滌，滴加1∶500稀釋羊抗兔IgG于室溫下孵育30 min，新鮮配置二甲基聯苯胺顯色，依次經蘇木精復染→乙醇脫水→透明→中性樹膠封片。于光鏡下觀察染色效果，并拍照記錄。

1.2.5 Western blot檢測大鼠心肌組織中GRP78及CHOP表達:取大鼠心肌組織，加適量組織裂解液，置于冰上研磨，靜置30 min后取上清液，于4 ℃10 000 r/min離心10 min，留上清液。取少量上清液測蛋白濃度，余上清液中按比例加入上樣緩沖液后于100 ℃沸水中煮5 min，置于-80 ℃低溫冰箱保存。配制10%分離膠，取等量蛋白樣品，使用凝膠恒壓電泳分離蛋白并轉至PVDF膜上。將PVDF膜置于含5%牛奶的TBST中，搖床搖動室溫封閉60 min。依次滴加1∶1 000兔抗大鼠GRP78、caspase 12抗體，4 ℃冰箱振蕩孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，1∶5 000 HRP-羊抗兔IgG室溫振蕩孵育1 h，TBST洗膜3，每次8 min,用ECL發光試劑于BIO-RAD成像系統發光成像，條帶使用Image軟件進行吸光度值分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組大鼠血壓、心率及左室重構指標的變化

與對照組相比，模型組大鼠MAP、HWI及 LVWI明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，達格列凈2組MAP明顯降低(P<0.05)。與對照組相比，模型組顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，達格列凈組HWI及 LVWI明顯降低(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血壓、心率及左心室血流動力學指標的比較Table 1 Comparison of blood pressure,heart rate and left ventricular hemodynamics in

2.2 各組大鼠心功能指標的變化

與對照組相比，模型組大鼠左心功能指標EF及FS值顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，達格列凈1組EF及FS值明顯升高(P<0.05)，達格列凈2組EF及FS值顯著升高(P<0.01)(圖1)。

*P<0.01 compared with control group；#P<0.05，##P<0.01 compared with model group圖1 超聲心動圖檢測各組大鼠LVEF及LVFS的變化Fig 1 Changes of LVEF and LVFS of rats in each group detected by echocardiography(×400)

2.3 HE染色顯示各組大鼠心肌組織改變

模型組大鼠心肌纖維排除紊亂，細胞分支多，組織間較為疏松，部分肌纖維斷裂；達格列凈1組大鼠心肌纖維排列紊亂及組織疏松較模型組好轉，少量肌纖維斷裂，細胞形態不規則；達格列凈2組大鼠心肌纖維排列整齊，組織較為致密，細胞形態規則，未見分支(圖2)。

圖2 各組大鼠心肌組織Masson染色圖片Fig 2 Masson staining picture of myocardial tissue of rats in each group(×400)

2.4 免疫組化檢測大鼠心肌組織GRP78、caspase 12蛋白表達變化

對照組大鼠心肌組織GRP78及caspase 12蛋白表達呈弱陽性，可見少量棕黃色顆粒分布于胞質；模型組大鼠心肌組織可見大量GRP78及caspase 12蛋白表達呈強陽性，可見大量棕黃色顆粒分布于胞質；達格列凈1組大鼠心肌組織GRP78及caspase 12蛋白表達呈陽性，可見較多棕黃色顆粒分布于胞質；達格列凈2組大鼠心肌組織GRP78及caspase 12蛋白表達呈弱陽性，可見少量棕黃色顆粒分布于胞質(圖3)。

2.5 Western blot檢測大鼠心肌組織GRP78、caspase 12蛋白表達水平變化

與對照組相比，模型組大鼠心肌組織GRP78及caspase 12蛋白水平表達顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，達格列凈1組大鼠心肌組織GRP78及caspase 12蛋白表達明顯降低(P<0.05)，達格列凈2組大鼠心肌組織GRP78及caspase 12蛋白表達顯著降低(P<0.01)(圖4)。

3 討論

心力衰竭的發生導致患者逐漸喪失勞動力，給家庭及社會帶來沉重負擔，但其發病機制復雜尚不完全明確，因此發現及研制新型抗心力衰竭藥物以改善心臟結構及功能顯得尤為重要。達格列凈為新型降糖藥物[7]，多項大型臨床研究顯示[8-9]，達格列凈可顯著降低主要心血管不良事件、因心血管原因死亡和心力衰竭住院風險，但其獨立的抗心力衰竭作用尚不明確。

*P<0.01 compared with control group；#P<0.05，##P<0.01 compared with model group圖3 免疫組化檢測各組大鼠心肌組織GRP78及caspase 12 表達水平Fig 3 Expression levels of GRP78 and caspase 12 in myocardium of rats in each group were detected

本研究采用TAC術建立心衰大鼠模型，以觀察達格列凈對不伴糖尿病心力衰竭大鼠心臟結構及功能的影響。研究結果顯示，術后12周，大鼠血壓、心率、HWI及LVWI較對照組顯著升高，EF及ES水平較對照組顯著降低，心肌細胞排列紊亂、細胞分支多，組織間較為疏松，部分肌纖維斷裂。使用不同劑量達格列凈自TAC術即干預治療至第12周末，與模型組相比，達格列凈組大鼠血壓、心率未見明顯變化，HWI及LVWI明顯降低，EF、FS水平明顯升高，HE染色見心肌細胞排列紊亂、組織疏松情況等明顯改善，表明達格列凈可抑制后負荷增加所致心肌重構，改善心臟結構及功能，對心肌細胞有效保護，但其潛在作用分子機制需進一步研究。

心力衰竭發生發展過程中多種分子機制激活已被證實[10-12]。心肌細胞ERS激活是貫穿心力衰竭病理生理發展過程的經典分子機制之一。使用TAC術建立心力衰竭小鼠模型，模型組小鼠心肌組織ERS相關信號通路激活[13]，心肌細胞應激啟動蛋白GRP78表達顯著升高，促凋亡蛋白caspase12表達顯著升高，表明持續后負荷過度激活心肌細胞ERS，誘導促凋亡，這與既往研究結果一致[14]。使用達格列凈干預后，大鼠心肌細胞GRP78及caspase12蛋白表達較模型組明顯降低，表明達格列凈降低心肌細胞ERS起始激活蛋白GRP78表達，從TAC術后早期即對ERS激活有抑制作用，從而減少促凋亡蛋白的表達。以上結果均提示抑制ERS可能是達格列凈保護心肌細胞，改善心肌結構和功能，延緩心力衰竭進展的分子機制之一。

*P<0.01 compared with control group；#P<0.05，##P<0.01 compared with model group圖4 Western blot檢測各組大鼠心肌組織中GRP78、CHOP蛋白表達的變化Fig 4 Changes of GRP78 and CHOP protein expressions in myocardial tissue of rats in each group detected by Western n=6)

綜上所述，達格列凈可改善TAC術后心力衰竭大鼠左室重構，改善心臟結構及功能，達格列凈干預可抑制后負荷增加誘導的心肌細胞ERS激活，對心肌細胞起保護作用，可能是其緩解左室重構及改善心力衰竭的分子機制之一，本研究為達格列凈具有心血管保護作用提供了新的理論依據。