腫瘤壞死因子相關蛋白6缺失減緩CCl4誘發的小鼠肝臟纖維化進程

蔡歡嫦，周丹茹，史天靜，尹亞軍，張大偉，張 瑾

(嘉興學院 生物與化學工程學院，浙江 嘉興 314001)

肝纖維化(liver fibrosis)是胞外基質過度積累的病理生理學過程，由持續的肝損傷和異常修復程序引起，不斷發展將轉變為肝硬化乃至肝癌[1-2]。近年來發現免疫細胞與肝纖維化進程關系密切，自然殺傷細胞(natural killer，NK)和1型輔助性T細胞(T helper type 1 cells,Th1)抑制肝纖維化，而巨噬細胞(macrophage)和2型輔助性T細胞(T helper type 2 cells,Th2)起促進作用[3]。因此，相關功能分子的探究將是纖維化干預的重要理論基礎。補體C1q/腫瘤壞死因子相關蛋白6(complement C1q/tumor necrosis factor-related protein 6,CTRP6)是調控脂肪細胞增殖與分化、三酰甘油積累和脂肪酸氧化等過程的新型脂肪因子[4-5]。它參與機體免疫細胞分布的調節，并通過改變IL-10、TNF-α和IL-1β等細胞因子的水平影響免疫應答[6-7]。盡管研究顯示CTRP6缺陷致使肝癌細胞增殖和轉移受到抑制[8]，但對其調控肝癌免疫細胞浸潤和肝病進程的認識仍不清楚。本研究通過分析肝纖維化CTRP6敲除小鼠的病理學與分子表達特點，揭示CTRP6在肝病發展進程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：8周齡體質量相近雄性野生型(CTRP6+/+)和敲除型(CTRP6-/-)小鼠共計24只，以C57BL/6J為遺傳背景，CTRP6基因敲除小鼠委托劍橋基因組中心(蘇州大學)構建，飼養于嘉興學院醫學院SPF級鼠房，條件為(25±1)℃，40%～60%相對濕度，12 h明暗循環照明。

1.1.2 主要試劑：康仕蘭特級初榨橄欖油(Aceites Ybarra S.A.)；四氯化碳(江蘇強盛功能化學股份有限公司)；丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司)；HiFiScript gDNA Removal cDNA合成試劑盒和Plus SYBR real-time PCR mixture(康為世紀生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組與造模：將2種基因型小鼠進行隨機分組，每組6只，分別為CTRP6+/+(橄欖油)、CTRP6-/-(橄欖油)、CTRP6+/+(CCl4)和CTRP6-/-(CCl4)。CCl4灌胃劑量為每克小鼠體質量10 μL，給藥濃度為0.2%，以橄欖油稀釋，每隔兩天給藥1次，持續給藥1個月；橄欖油處理組只灌胃等體積橄欖油。

1.2.2 測定肝臟指數與病理學觀察：乙醚麻醉處死后，稱量小鼠體質量，并解剖，肝臟組織稱重，計算公式為：肝臟指數=肝臟濕質量(g)/小鼠體質量(g)×100%。然后，分割肝臟組織，一部分組織于-80 ℃凍存，一部分組織用4% PFA固定。將固定的肝臟組織樣送至浙江省榮軍醫院，由其病理科完成石蠟包埋、切片和HE染色，并利用萊卡光學顯微鏡進行觀察。

1.2.3 纖維化及細胞增殖標志基因表達水平的檢測：分離小部分凍存于-80 ℃的肝臟組織，經組織研磨儀破碎裂解，按照Trizol操作說明進行RNA提取；然后，利用核酸測定儀檢測RNA濃度，并根據試劑盒說明書反轉錄合成cDNA。通過熒光實時定量PCR(RT-qPCR)對纖維化(Acta2、Col1a1、Mmp2、TGF-β和TNF-α)和細胞增殖標志基因(CyclinD、CyclinE和CDK6)進行相對定量，以β-actin作為內參基因，采用2-△△Ct法計算。檢測基因與對應引物序列見表1。

表1 熒光實時定量PCR引物Table 1 Real-time fluorescent quantitative PCR primers

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 肝臟指數的分析

與橄欖油組的CTRP6+/+小鼠相比，CCl4處理組的CTRP6+/+小鼠肝臟指數增加顯著(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with CTRP6+/+ olive oil group圖1 CTRP6對CCl4誘導肝損傷小鼠肝臟指數的影響Fig 1 Effect of CTRP6 on mice liver index in CCl4-

2.2 肝臟中CTRP6表達水平的分析

與橄欖油組的CTRP6+/+小鼠相比，CCl4處理組的CTRP6+/+小鼠肝臟中CTRP6基因表達升高2倍(P<0.001)，而在CTRP6-/-小鼠肝臟不存在CTRP6基因表達(P<0.001)(圖2)。

*P<0.001 compared with CTRP6+/+ olive oil group圖2 CTRP6在CCl4誘導損傷肝臟中的表達Fig 2 Expression of CTRP6 in injured liver induced

2.3 肝臟病理與生化指標的分析

在肝臟組織切片的HE染色中，相比于橄欖油組，CCl4處理組的CTRP6+/+和CTRP6-/-小鼠出現嚴重的肝臟病變，其中CTRP6+/+小鼠肝組織病變更為嚴重，表現出更多的壞死，肝細胞疏松、腫脹，細胞形態不規則(圖3A)。同時，CCl4處理組的小鼠肝臟內丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量明顯升高(P<0.01)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力顯著降低(P<0.01)；此外，CCl4處理組中CTRP6-/-小鼠肝臟內SOD活力降低程度顯著弱于CTRP6+/+小鼠(P<0.05)(圖3B,C)。

A.liver tissue section stained by HE;B.MDA content in liver tissue;C.SOD content in liver tissue;*P<0.01 compared with CTRP6+/+ olive oil group;#P<0.05 compared with CTRP6+/+ CCl4 group圖3 CTRP6缺失對肝臟病理與生化指標的影響Fig 3 Effect of CTRP6 deletion on liver pathological and biochemical indexes n=6)

2.4 纖維化標志基因表達的分析

與橄欖油組相比，CCl4處理組的CTRP6+/+和CTRP6-/-小鼠肝臟組織都表現為纖維化標志基因Acta2、Col1a1、Mmp2和TGF-β的顯著高表達(P<0.01)；但CTRP6-/-小鼠的纖維化標志基因表達水平明顯低于CTRP6+/+小鼠(P<0.05)；此外，炎性因子TNF-α表達水平分析顯示，CTRP6-/-小鼠肝臟組織TNF-α水平低于CTRP6+/+小鼠(P<0.05)(圖4)。

A.relative Acta2 transcription;B.relative Col1a1 transcription;C.relative Mmp2 transcription;D.relative TGF-β transcription;E.relative TNF-α transcription;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with CTRP6+/+ olive oil group;#P<0.05,##P<0.01 compared with CTRP6+/+ CCl4 group圖4 CTRP6缺失對纖維化標志基因表達的影響Fig 4 Effect of CTRP6 deletion on the expression of fibrosis markers n=6)

2.5 細胞增殖標志基因表達的分析

與橄欖油組相比，CCl4處理組的CTRP6+/+小鼠肝臟組織的細胞增殖標志基因CyclinD、CyclinE和CDK6顯著高表達(P<0.01)；但CTRP6-/-小鼠未出現類似變化趨勢，且這3個基因的表達水平顯著低于CTRP6+/+小鼠(P<0.01)(圖5)。

A.relative Cyclin D transcription;B.relative Cyclin E transcription;C.relative CDK6 transcription;*P<0.01 compared with CTRP6+/+ olive oil group;#P<0.01 compared with CTRP6+/+ CCl4 group圖5 CTRP6缺失對細胞增殖標志基因表達的影響Fig 5 Effect of CTRP6 deletion on the expression of cell proliferation markers n=6)

3 討論

肝纖維化是繼慢性肝損傷和炎性反應之后的一種愈傷反應，嚴重威脅著人類健康。因此解析影響肝纖維化進程的關鍵分子對干預與治療方案的提出是必要的。

研究發現CTRP6在肝癌組織與細胞中顯著高表達，其缺失導致肝癌細胞凋亡，并抑制細胞增殖與遷移[8]；且它在小鼠肝臟的水平因高脂飲食增加，而敲降后減弱肝臟的脂肪沉積[5]。本研究發現CTRP6-/-小鼠表現為更高抗氧化能力和低水平的脂質過氧化程度，即相對高水平的SOD和低水平的MDA，而這一結果與高糖誘導下CTRP6敲降的腎小球系膜細胞呈現低水平活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)一致[9]。此外，CTRP6-/-小鼠在病理切片分析上顯示相對低的纖維化程度。以上研究表明CTRP6參與肝病的發生與發展，而這可能與它調節細胞氧化應激相關。

已有研究證實CTRP6與腎纖維化相關，但在調節腎小球系膜細胞胞外基質(extracellular matrix，ECM)積累方面，兩個課題組獲得了相反的結果[9,11]。本研究檢測到ECM沉積標志基因在CTRP6-/-小鼠肝臟組織是顯著低表達的，與報道的高糖誘導發現類似。這種差異效應可能與細胞的營養狀態或者其受到的刺激條件有關。在LPS誘導的小鼠急性炎性反應模型中，CTRP6-/-小鼠的炎性因子TNF-α水平顯著低于CTRP6+/+小鼠[6]，與CCl4誘導小鼠肝纖維化模型一致。因此，可以明確CTRP6缺失降低CCl4誘導的小鼠肝ECM沉積和炎性反應。

肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化與增殖是肝纖維化的中心事件[12]。在肝癌細胞Hep3B敲降CTRP6的研究發現，CTRP6缺陷抑制細胞存活而促進凋亡[8]。本研究發現，在CCl4誘導條件下，CTRP6-/-小鼠肝臟中細胞增殖基因CyclinD、CyclinE和CDK6表達水平低于CTRP6+/+小鼠；同時，能夠活化HSCs和增加ECM分泌的細胞因子TGF-β表達呈現類似趨勢。因此，這些分子水平的差異暗示，CTRP6基因缺失對小鼠肝纖維化進程的抑制可能與HSCs的增殖與活化狀態關聯。

綜上，CTRP6基因缺失減緩CCl4誘導的小鼠肝纖維化進程，而這與肝損傷過程中纖維化和細胞增殖基因的異常表達相關，提示下調CTRP6的表達可能成為干預和治療肝纖維化的潛在方法。