TREM2過表達減輕大鼠顱腦創傷后的認知缺陷

楊 齊，許 峰，焦 陽，張 賽，孫中磊,*

(1.棗莊礦業集團中心醫院 神經外科，山東 棗莊 277000；2.武警特色醫學中心，天津市神經創傷修復重點實驗室，天津 300162)

神經炎性反應被定義為對不同類型的顱腦創傷(traumatic brain injurie，TBI)所作出的先天免疫系統的激活反應。腦實質中的小膠質細胞激活是神經炎性反應的標志，被認為是神經元命運的關鍵因素[1]。神經炎性反應與包括TBI后認知障礙在內的各種神經系統疾病的發病機制密切相關[2]。髓細胞觸發受體2(triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2)是TREM家族的I型跨膜先天免疫受體，在大腦中主要在小膠質細胞中表達，在小膠質細胞激活和存活中起著重要作用[3-4]。雖然小膠質細胞是參與中樞神經系統炎性反應的主要細胞類型之一，但是根據不同的疾病和狀況，它對神經元的作用不同[5]。盡管已廣泛報道TREM2調節神經炎性反應，但未見報道其在TBI中的作用。本研究旨在探討TREM2過表達對大鼠TBI后認知功能障礙的影響及其對神經炎性反應的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SPF級雄性SD大鼠80只，24～26月齡，體質量600～700 g(北京維通利華生物技術有限公司)SCXK(京)2016-0011，飼養環境為清潔級動物室(SPF級)。所有動物實驗程序均按照武警特色醫學中心的動物指南進行。

1.1.2主要試劑：Trizol試劑盒(Invitrogen公司)；ReverTra Ace RT-qPCR試劑盒(Toyobo公司)；Anti Aβ1-42(amyloid β1-42)、Anti tau、Anti TREM2、Anti iNOS、Anti Arg-1和Anti β-actin(Abcam 公司)；TREM2、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10 mRNA試劑盒(Sigma-Aldrich公司)；RIPA緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；編碼TREM2的慢病毒載體和對照慢病毒載體(上海吉凱基因化學技術有限公司)；SYBR Green實時PCR預混試劑盒(上海聯邁生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理：將大鼠隨機分為對照組(n=8)和TBI 2、5、7、14和28 d組(n=8)，采用皮質撞擊致傷法建立大鼠TBI模型，余32只大鼠隨機分為4組(n=8)：對照組、TBI組、(TBI+Null)組和(TBI+TREM2)組，按文獻所述，(TBI+Null)組腦室內注射對照慢病毒載體，(TBI+TREM2)組腦室內注射等量編碼TREM2的慢病毒載體，在對應天數安樂死，取腦組織用于下一步研究[6-7]。

1.2.2 Morris水迷宮實驗檢測記憶功能：實驗第24～28 d，通過Morris水迷宮試驗觀察大鼠學習記憶功能。

1.2.3 RT-qPCR檢測mRNA：按照使用說明，使用Trizol試劑從小鼠腦組織中收獲總mRNA，按照表1中引物序列，使用RT-qPCR試劑盒合成cDNA，SYBR Green實時PCR預混試劑盒進行反轉錄酶RT-qPCR分析，StepOnePlus實時熒光定量PCR儀實時定量分析mRNA，以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法分析。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

1.2.4 Western blot檢測蛋白：將腦組織破碎后使用RIPA緩沖液從腦組織中收集蛋白質，BCA法測定蛋白總濃度，利用SDS-PAGE，電泳后，半干轉移至聚偏二氟乙烯膜上。使用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h，然后在4 ℃下分別與一抗(anti TREM2、anti iNOS、anti Arg-1、Aβ1-42、anti tau和anti β-actin)孵育過夜。用TBST洗滌后將膜與山羊抗兔二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h。使用增強的化學發光系統(ECL試劑盒)檢測免疫反應性條帶，并使用ImageJ 1.42q軟件程序分析圖像。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 TREM2在TBI大鼠中上調

TBI組TREM2 mRNA及蛋白質水平較對照組明顯升高(P<0.05)，且TREM2 mRNA和蛋白水平的峰值均出現在TBI后3 d(圖1A～C)。

A.TREM2 and β-actin Western blot bands;B.quantification of TREM2 protein expression;C.quantification of TREM2 mRNA expression;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group圖1 各組大鼠TREM2蛋白和mRNA表達水平Fig 1 Expression levels of TREM2 protein and mRNA in each n=8)

2.2 TREM2過表達減輕了TBI大鼠的認知缺陷

與對照組相比，第28天 TBI組和(TBI+Null)組大鼠的逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)；與(TBI+Null)組相比，(TBI+TREM2)的逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠逃避潛伏期Table 2 Escape latency of rats in each n=8)

2.3 TREM2過表達改變了TBI大鼠腦組織的小膠質細胞表型

與對照組相比，TBI組和(TBI+Null)大鼠腦組織小膠質細胞M1型標志物iNOS表達水平升高，小膠質細胞M2型標志物Arg-1表達水平下降(P<0.05)；與TBI組相比，(TBI+TREM2)組大鼠腦組織小膠質細胞M1型標志物iNOS表達水平下降，小膠質細胞M2型標志物Arg-1表達水平升高(P<0.05)(圖2A～C)。

A.iNOS and Arg-1 protein Western blot bands;B.iNOS protein quantification;C.Arg-1protein quantification；*P<0.05 compared with sham;#P<0.05 compared with the TBI+Null圖2 TREM2過表達改變TBI大鼠腦組織的小膠質細胞表型Fig 2 TREM2 over-expression altered microglial phenotypes in brain tissues of TBI n=8)

2.4 TREM2過表達減弱了TBI大鼠的炎性反應

與對照組相比，TBI組和TBI+Null組大鼠腦組織促炎性介質(IL-1β，IL-6)表達水平升高，抗炎介質(IL-4，IL-10)表達水平下降(P<0.05)；與(TBI+Null)組相比，(TBI+TREM2)組大鼠腦組織促炎性介質(IL-1β，IL-6)表達水平下降，抗炎介質(IL-4，IL-10)表達水平升高(P<0.05)(圖3A,B)。

A.quantification of IL-1β and IL-6mRNA expression;B.quantification of IL-4 and IL-10 mRNA expression;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with the TBI+Null group圖3 大鼠腦組織神經炎性反應相關因子mRNA表達水平Fig 3 mRNA expression levels of neuroinflammation-related factors in rat brain n=8)

2.5 TREM2過表達抑制了認知障礙相關蛋白表達

與對照組相比，TBI組和(TBI+Null)組Aβ1-42、tau 蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與(TBI+Null)組比，(TBI+TREM2)組Aβ1-42、tau 蛋白水平明顯下降(P<0.05)(圖4)。

A.Aβ1-42 and tau protein Western blot bands;B.Aβ1-42 protein quantification;C.tau protein quantification；*P<0.05 compared with sham;#P<0.05 compared with the TBI+Null圖4 大鼠腦組織認知障礙相關蛋白表達水平Fig 4 Expression levels of cognitive impairment related proteins in rat brain n=8)

3 討論

本研究結果表明，TBI大鼠的腦組織中TREM2基因和蛋白質水平較對照組上調，表明TREM2可能參與TBI的發病，TREM2的過表達可減少腦組織中認知障礙相關蛋白(tau和Aβ1-42)表達，減輕大鼠認知缺陷。TREM2還通過修飾小膠質細胞表型來調節炎性因子的釋放，這也解釋了TREM2對TBI大鼠神經炎性反應的抑制及神經功能的保護作用。

許多報道表明，神經炎性反應是包括TBI后認知障礙在內的多種神經系統疾病發病機制的主要誘因[8-9]。TBI后認知障礙的神經炎性反應的特征是活化小膠質細胞釋放的炎性介質水平升高[10]。新近有報道TREM2參與了多種神經系統疾病的炎性反應機制，例如，脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)處理的APP/PS1雙轉基因小鼠的研究表明TLR4/TREM2可能是阿爾茨海默病(Alzheimer’s diseasem,AD)與全身炎性反應之間的潛在聯系，還有研究表明TREM2通過減少神經炎性反應和多巴胺神經元的凋亡對帕金森病具有神經保護作用[11-12]。總之，TREM2可能是多種神經系統疾病中炎性反應的上游調節劑。

神經炎性反應主要由小膠質細胞驅動，小膠質細胞是中樞神經系統的先天免疫細胞，在腦代謝和生理學等方面起核心作用[13]。活化的小膠質細胞分為促炎性M1型和抗炎性M2型，它們一方面通過分泌促炎細胞因子引起神經元損傷，另一方面通過釋放抗炎介質而發揮有益作用。近年來TREM2與小膠質細胞之間的關系備受關注，TREM2修飾了P301S tau轉基因小鼠的小膠質細胞表型[14-15]。TREM2還可拮抗淀粉樣蛋白的病理改變和相關毒性，表明TREM2在體內具有神經保護作用，可作為一種治療AD的靶標藥物來探索[16]。

總之，本研究表明TREM2的過表達通過調節活化的小膠質細胞表型和減少炎性反應來減輕認知缺陷。這些發現為TREM2在TBI后認知障礙發病機制中的作用提供了新線索。