miR-29b抑制劑降低小鼠肝臟內膽固醇合成

蔡君艷

(東南大學附屬中大醫院 心血管內科，江蘇 南京 210000)

高膽固醇血癥(hypercholesterolemia)是冠心病、腦梗死等心血管疾病的獨立危險因素，嚴重威脅人類健康。控制高膽固醇血癥能夠有效降低心腦血管疾病的發生。目前臨床上主要采用他汀類藥物降低膽固醇，而口服他汀類藥物時患者會出現乏力、肌肉酸痛、肝臟轉氨酶升高甚至橫紋肌溶解等不良反應。因此，探尋新型降低膽固醇的藥物具有重要意義。microRNAs是一類由內源基因編碼、長度約22個核苷酸的小非編碼單鏈RNA分子。它可與信使RNA的特定序列結合，參與轉錄后基因表達調控，在一系列生理、病生理過程中發揮重要作用[1]。miR-29b在高血壓、心肌病等疾病中發揮重要作用，但對高膽固醇血癥的作用尚未見報道[2-3]。本研究以高脂喂養小鼠為研究對象，觀察miR-29b對膽固醇代謝的影響，并探討可能的機制，為發現新型降膽固醇藥物提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:45只SPF級C57/BL6雄鼠(體質量20～22 g)(北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格號：NO.201807103)。

1.1.2 主要試劑:高脂飼料含15%脂肪，1.25%膽固醇，0.5%膽酸鈉(北京維通利華實驗動物技術有限公司)；亂序無意義陰性序列(scrambled shRNA)、miR-29b抑制劑(miR-29b antagomir)(廣州銳博生物科技有限公司)；總膽固醇測定試劑盒、三酰甘油測定試劑盒、RNA trip和BCA蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)；鼠抗Actin抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗SIRT1抗體(Cell Signaling Technology公司)；兔抗SREBP2抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：將小鼠分為：正常飲食組(Con組，n=10)、高脂飲食組(HF組，n=10)、正常飲食+miR-29b抑制劑對照組(Con+shRNA組，n=6)、正常飲食+miR-29b抑制劑組(Con+antago組，n=6)、高脂飲食+miR-29b抑制劑對照組(HF+shRNA組，n=6)、高脂飲食+miR-29b抑制劑組(HF+antago組,n=6)。Con+shRNA組和HF+shRNA組按照2.5 mg/kg體質量通過尾靜脈注射scrambled shRNA，Con+antago組和HF+antago組按照 2.5 mg/kg體質量通過尾靜脈注射miR-29b拮抗劑。小鼠共飼養8周，每周注射1次核酸以保證轉染效果。

1.2.2 標本的收集：摘眼球取血，滴入肝素鈉處理過的離心管中，在4 ℃以3 000×g離心10 min分離血漿備用。

取新鮮肝臟置于凍存管中，經液氮迅速降溫后，轉移至-80 ℃冰箱中保存備用。

1.2.3 總膽固醇和三酰甘油的測定:使用總膽固醇、三酰甘油測定試劑盒按照說明書操作。將相應試劑盒中的R1(含顯色劑)與R2(含酶)按4∶1混勻，即為反應液。稱取50 mg肝臟，按照1 mg肝臟加30 μL組織裂解液的比例，加入適量裂解液，冰上高速勻漿1 min。將肝臟組織裂解液在70 ℃水浴煮10 min，然后轉移至離心管中，室溫2 000×g離心10 min。棄組織碎片，取上清至新離心管中。向96孔板中加入190 μL反應液，再加入10 μL標準品或者肝臟裂解液，充分混勻。37 ℃反應20 min，將96孔板置于酶標儀中，在570 nm處讀取A值。

1.2.4 RT-qPCR檢測mRNA的表達:使用RNA提取試劑提取血漿及肝臟的總RNA。實時定量PCR采用Promega Go Taq qPCR Master Mix，20 μL體系按照如下擴增條件操作：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環；95 ℃ 1 min，55 ℃變性30 s，95 ℃ 30 s。數據分析使用MxProMx3000軟件進行分析。引物見表1。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2.5 Western blot檢測SIRT1、SREBP2表達水平：使用組織裂解液提取肝臟的總蛋白。BCA試劑盒測定蛋白含量。10% SDS-PAGE膠電泳分離80～100 μg蛋白。轉膜，用5%脫脂牛奶封閉，4 ℃一抗孵育NC膜過夜，洗膜后室溫孵育二抗1～2 h，TBST洗膜后暗室顯色、曝光。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 各組小鼠血漿和肝臟中miR-29b的表達

高脂飲食小鼠血漿及肝臟中miR-29b表達升高，miR-29b抑制劑可抑制高脂飲食小鼠血漿和肝臟中miR-29b的表達(表2)。

表2 各組小鼠血漿和肝臟中miR-29b的表達Table 2 Expression of miR-29b in plasma and liver

2.2 各組小鼠血漿和肝臟中總膽固醇和三酰甘油的含量

HF組小鼠與對照組相比，血漿和肝臟中總膽固醇升高；HF+antago組小鼠血漿和肝臟中總膽固醇較HF+shRNA組明顯降低。而Con+antago組與Con+shRNA組小鼠相比，血漿和肝臟中的總膽固醇和三酰甘油無明顯變化(表3，4)。

表3 各組小鼠血漿中總膽固醇和三酰甘油的含量Table 3 Total cholesterol and triglyceride in plasma

表4 各組小鼠肝臟中總膽固醇和三酰甘油的含量Table 4 Total cholesterol and triglyceride in liver

2.3 各組小鼠肝臟中SIRT1、SREBP2、HMGCR的mRNA表達

HF組與對照組小鼠相比，肝臟中SIRT1 mRNA表達降低，而膽固醇合成相關蛋白SREBP2、HMGCR mRNA表達增加。抑制miR-29b表達后，肝臟中SIRT1 mRNA表達增加，SREBP2、HMGCR mRNA表達減少(表5)。

表5 各組小鼠肝臟中SIRT1、SREBP2、HMGCR的mRNA表達Table 5 mRNA expression of SIRT1,SREBP2,HMGCR

2.4 各組小鼠肝臟中SIRT1和SREBP2的蛋白表達

與Con組相比，HF組小鼠肝臟中SIRT1表達減少，SREBP2表達增加。抑制miR-29b表達，肝臟中SIRT1表達增加，SREBP2表達減少(圖1)。

3 討論

高膽固醇血癥是多種疾病的危險因素，而體內膽固醇主要有兩個來源，一是小腸從食物中攝取膽固醇，二是體內以乙酰CoA為原料合成膽固醇[4]。肝臟是合成膽固醇的主要場所。因此，抑制肝臟內膽固醇合成是治療高膽固醇血癥的重要方法。本研究以高脂喂養的小鼠為動物模型，發現高膽固醇血癥小鼠血漿中miR-29b顯著升高；尾靜脈注射miR-29b antagomir后可降低血漿中總膽固醇，說明miR-29b可作為調節膽固醇代謝的靶點。

miR-29b是miR-29家族成員之一，由染色體7q32.3、染色體 1q32.2編碼轉錄，在2型糖尿病、高血壓、腫瘤等多種疾病中發揮重要作用[5-6]。本實驗發現高膽固醇血癥的小鼠的血漿和肝臟中miR-29b表達升高；而抑制miR-29b表達后，高膽固醇血癥小鼠血漿和肝臟中總膽固醇降低。這一結果提示miR-29b可參與調節膽固醇代謝。

SIRT1是調節膽固醇代謝的重要蛋白[7]。前期研究發現miR-29b通過位于SIRT1 mRNA 3′非翻譯區的靶位點抑制SIRT1的表達[8-9]。在血管平滑肌中，miR-29b抑制劑可促進SIRT1的表達，而miR-29b類似物可抑制SIRT1的表達[10]。在本實驗中，給予高膽固醇血癥小鼠注射miR-29b拮抗劑后，肝臟中SIRT1表達顯著增加。

SIRT1是NAD+依賴的去乙酰化酶，可使SREBP2去乙酰化，同時促進SREBP2降解，從而降低膽固醇合成限速酶HMGCR和HMGCS的表達[11-12]。本實驗發現，給予高膽固醇血癥小鼠注射miR-29b antagomir后，肝臟中SREBP2表達降低，參與膽固醇合成的限速酶HMGCR表達亦降低，從而抑制肝臟內膽固醇合成，降低血清中總膽固醇。這給后他汀時代的降脂治療帶來新方案。目前已有通過RNA干擾技術特異性的沉默肝臟內編碼前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)蛋白的mRNA藥物，因而抑制miRNA表達的藥物未來可期。另一方面，Con+antagomir組小鼠肝臟中SREBP2和HMGCR表達雖然減少，但血漿中膽固醇表達未見明顯下降，提示在正常飲食情況下，尾靜脈注射miR-29b抑制劑后，雖然肝臟內膽固醇合成減少，但膽固醇的攝取可能增加，從而維持膽固醇的代謝平衡。

*P<0.01 compared with control group;#P<0.01 compared with Con+shRNA group圖1 各組小鼠肝臟中SIRT1和SREBP2的蛋白表達Fig 1 Protein expression of SIRT1 and SREBP2 in liver

綜上所述，在高脂喂養的小鼠模型中，miR-29b拮抗劑可使肝臟中SIRT1表達升高，促進下游SREBP2的去乙酰化，從而減少膽固醇合成限速酶HMGCR的表達，抑制肝臟內膽固醇合成，最終降低血漿中總膽固醇。