13C脈沖標記法研究非正常凋落物對土壤有機碳的激發效應

張天霖，蔡章林，趙厚本*，吳仲民，周光益，邱治軍

1. 中國林業科學研究院熱帶林業研究所，廣東 廣州 510520；2. 南嶺北江源森林生態系統國家定位觀測研究站，廣東 廣州 510520

近些年來，由于人類活動引起的全球氣候變化對森林、草原、海洋等不同生態系統的結構和功能造成了深遠的影響（Scholze et al.，2009；Okey et al.，2014）。全球氣候變化導致的臺風、冰雹、極端降水等極端氣候事件已經成為森林生態系統失衡的主要因素之一（劉世榮等，2014）。極端氣候事件往往對森林造成機械損傷，產生諸多新鮮的落葉、斷枝、斷干等，這種由于外力作用而產生的植物新鮮殘體被定義為“非正常凋落物”（吳仲民等，2008）。非正常凋落物具有瞬時大量產生的特點，如吳仲民等（1994）發現尖峰嶺熱帶山地雨林原始林的非正常凋落物高達4.7 Mg·hm?2，占全年凋落物總量的43%。Lodge et al.（1991）發現波多黎各臺風影響產生的凋落物輸入量為 10.06—10.83 Mg·hm?2。駱土壽等（2008）調查顯示2008年特大冰災所造成的非正常凋落物量高達 13.96—19.59 Mg·hm?2。非正常凋落物的物理和化學性質均和正常凋落物有較大差異，如臺風產生的凋落物中的氮和磷含量分別為正常凋落物的13倍和1.5—2.4倍（Lodge et al.，1991）。還有學者從非正常凋落物的碳儲量（許涵等，2008）、養分歸還（陳耀德等，2006）以及對土壤的影響（肖以華等，2013）等方面開展了相應的研究。

土壤碳庫是地球陸地生態系統最大的碳庫，土壤有機碳（SOC）儲量是地上植被碳庫的3倍，是大氣碳庫的兩倍（Jobbagy et al.，2000）。森林土壤碳庫更是至關重要的碳儲庫和碳匯（劉世榮等，2011）。因此，土壤有機碳的微小變化都將對全球碳循環產生顯著的影響（Smith et al.，2008）。凋落物的輸入與土壤有機質的分解是全球碳循環的重要組成部分（Guenetet al.，2018），維持著土壤碳庫的平衡（Trumboreet al.，2008）。外源有機質的輸入將在短時期內改變土壤原有有機碳的礦化過程，這種現象被稱為土壤碳激發效應，正向的土壤碳激發效應將加速SOC的分解，負向則會產生抑制作用（Zhanget al.，2012）。在極端氣候事件的影響下，非正常凋落物的大量輸入可能打破土壤碳庫的平衡，從而造成深遠的影響。有研究指出，凋落物輸入增加改變了土壤微生物的周轉，將導致土壤排放更多的 CO2，進一步加劇全球變暖（Sayer et al.，2011）。目前，國內外學者已經針對土壤碳激發效應開展了諸多研究，這些研究主要集中于不同外源添加物對土壤的碳激發效應方向和強度（Fontaine et al.，2007；Zhang et al.，2012）、環境因子對碳激發效應的影響（Lenka et al.，2019）、土壤微生物響應過程（Li et al.，2018）等方面。

全球氣候變化影響下，極端氣候事件干擾將逐漸增強（Fischer，2019），由于極端氣候事件所產生的非正常凋落物可能成為未來全球變化對森林生態系統影響的重要方面。然而，關于非正常凋落物的分解過程及對土壤碳庫的影響研究十分匱乏，其在生態系統中的作用還有待深入研究。南亞熱帶森林結構復雜，在陸地土壤碳庫和全球碳循環中扮演重要角色（Yu et al.，2014；Xu et al.，2018），且容易受到臺風、冰暴等極端氣候事件的干擾。因此，探究非正常凋落物的分解過程及其對南亞熱帶森林土壤碳庫的影響具有明顯的現實意義。本文選取了馬尾松（Pinus massoniana）、黧蒴錐（Castanopsis fissa）、浙江潤楠（Machilus chekiangensis）3種南亞熱帶森林主要樹種，利用脈沖標記法對植物葉片進行13C標記，開展室內控制實驗模擬了極端氣候事件影響下的非正常凋落物輸入對土壤的影響，旨在探究不同樹種的非正常凋落物的分解過程及其土壤碳激發效應，以期揭示南亞熱帶森林生態系統對極端氣候事件干擾的響應，為全球變化下南亞熱帶森林生態系統管理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

研究地點位于廣東省韶關市小坑林場（24°42′28.07′′N，113°50′10.08′′E），海拔為 244—256 m。研究區域屬南亞熱帶季風氣候區，冬季盛行東北季風，夏季盛行西南和東南風。年均氣溫為20.3 ℃，年均太陽輻射467.52 kJ·m?2，年平均降雨量為1530 mm。土壤類型主要為花崗巖發育而成的紅壤，富含有機質。研究樣地選在50—60年生的針闊混交林，優勢樹種主要包括馬尾松、浙江潤楠、黧蒴錐、米錐（Castanopsis chinensis）、木荷（Schima superba）等。2008年該區域曾遭受特大冰雪災害影響，具有一定的代表性。

1.2 植物材料準備

參考之前相關研究采用脈沖標記法對植物材料進行13C標定（Bromand et al.，2001；Lu et al.，2003）。具體方法為：用 PVC管搭建 2個 4 m×2 m×1.8 m的框架，之后用透光率95%的聚乙烯膜密封。在密封箱內安裝風扇、溫度計、補光燈等。選取馬尾松、黧蒴錐、浙江潤楠幼苗各50株，保證幼苗均高約為1 m，生長狀況良好。將植物幼苗放入密封箱培養10 d以適應密封箱環境。標定開始前，先對密封箱進行2 h的遮黑處理。將4個裝有15 g Na213CO3和過量檸檬酸、2個裝有15 g Na212CO3和過量檸檬酸的燒杯放入箱內，之后密封。標定開始時，從箱外用注射器先向裝有Na213CO3的燒杯內注水，催化反應產生13CO2。2小時后，向裝有Na212CO3的燒杯注水，進一步提升箱內CO2濃度，促進植物光合作用。每隔1天標定一次，共標記3次，標定時間分別為2020年7月19日、7月21日、7月23日的09:00—11:00，之后在密封箱中繼續培養30 d。標定完成后，采集植株上所有新鮮葉片（非正常凋落物）供分解培養使用。

1.3 土壤材料準備

土壤材料來源于小坑林場的南亞熱帶次生針闊混交林。在林內隨機選擇取樣點，移除地表凋落物后分別取0—5、5—10、10—20 cm 3層土壤，撿出肉眼可見的植物殘體、根系、石塊等雜物，粉碎其中較大的土塊并過2 mm篩，之后將同層土壤充分混合，帶回實驗室供培養使用。

1.4 實驗設計

準備12個直徑為20 cm，高為45 cm的PVC培養桶。培養桶底部有直徑3 mm的小孔，保證培養裝置的透水性和透氣性。將取回的土壤樣品按10—20、5—10、0—5 cm的順序依次放入培養桶內，保持土壤密度與樣地自然狀態下基本一致。將土壤填回后于室內靜置 20 d，使土壤恢復至自然狀態。

實驗共設置3個處理組，分別為培養桶土壤表面添加馬尾松、黧蒴錐和浙江潤楠的新鮮葉片。以不向培養桶添加任何葉片作為對照組。處理組和對照組各重復3次。標記好的新鮮植物葉片樣品采摘下來后，立即均勻地平鋪在培養桶內土壤表層，植物葉片碳氮含量詳見表1。每桶葉片量參考2008年特大冰雪災害所產生的非正常凋落葉量，換算為干重為25 g。培養桶整體稱重后放置在溫室內培養，培養開始后每3天稱重1次并用去離子水補充蒸發水分控制土壤含水率在25%，維持室內溫度在25—29 ℃，空氣濕度在60%左右。培養結束后，分層采集桶內土壤以及剩余的非正常凋落物，分析其理化性質。

表1 13C標記植物葉片特征Table 1 Characteristics of the 13C-labeled plant leaves

1.5 CO2采集及計算

氣體于培養開始后第0、1、3、5、7、10、15、20、25、35、45、55、70、90、110天采集，采集時間選取在當天 09:00—12:00。氣體采集方法為：將直徑27.5 cm，高35 cm的培養桶蓋覆于培養桶之上，桶蓋內裝有電扇，保證氣體充分混合。蓋上培養桶蓋30 s后用注射器抽出300 mL培養桶蓋內氣體并裝入氣體采樣袋中，之后每隔 10 min采集一次，共采集4次。采集的氣體利用Picarro G2201-i分析儀（美國）分析其CO2濃度以及13C同位素值（δ13C）。

參考Wang et al.（2014）的方法，利用同位素混合模型區分CO2來源：

式中：

Qt——培養桶產生的總CO2量；

δt——總CO2的13C同位素值；

Qs——來源于土壤中的CO2量；

δb——對照組產生的CO2的13C同位素值；

Qd——來源于非正常凋落物的CO2的量；

δd——非正常凋落物的初始13C同位素值。

碳排放計算公式：

式中：

F——CO2排放速率；

V——培養桶蓋中的氣體體積；

S——培養桶底面積；

ρ——標準狀態下CO2的密度；

P——采樣地點的大氣壓值；

P0——標準狀態下的大氣壓值；

T——采樣時的絕對溫度；

T0——標準狀態下的絕對溫度；

dQ1/dt——采樣時氣體濃度隨時間變化的線性回歸斜率。

碳激發效應計算公式：

式中：

PE——碳激發效應強度；

Fs——來源于土壤中的CO2的排放速率；

Fb——對照組產生的CO2的排放速率。

CO2累積排放量計算公式：

式中：

Et——CO2累積排放量；

Fn——第n天的碳排放速率；

Fm——第m天的碳排放速率；

Dn——第n天；

Dm——第m天；

S——培養桶底面積；

h——每天的小時數。

1.6 土壤化學分析

培養實驗前的土壤樣品與培養實驗結束后采集的土壤樣品進行風干處理，粉碎過篩后進行化學分析。有機碳采用重鉻酸鉀外加熱法測定，全氮采用半微量凱氏定氮法測定，有效氮采用堿解擴散法測定（劉光崧，1996），13C同位素豐度值（δ13C）采用Picarro G2201-i分析儀（美國）進行測定。

1.7 統計分析

采用SPSS 23.0進行所有數據分析工作，采用Origin 2018進行繪圖。采用單因素方差分析法（oneway ANOVA）對非正常凋落物的碳排放速率、碳激發效應強度以及不同處理組和不同土層的土壤化學性質進行差異性檢驗，利用多因素方差分析（multi-factor ANOVA）對不同處理組和不同土層交互作用下的土壤化學性質進行差異性檢驗，用最小顯著差數法（LSD）進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 非正常凋落物碳排放過程

如圖1所示，非正常凋落物的碳排放過程主要分為4個階段：培養初期（0—7 d），非正常凋落物碳排放速率快速升高，在短時間內達到峰值，上升速度表現為黧蒴錐>浙江潤楠>馬尾松；之后一段時間（7—15 d），碳排放速率呈波動下降，碳排放速率表現為黧蒴錐>浙江潤楠>馬尾松；培養中期（15—45 d）碳排放速率持續下降，下降速度表現為黧蒴錐>馬尾松>浙江潤楠；培養后期（45—110 d），碳排放將穩定在較低水平，且3種樹種的非正常凋落物之間差異較小。馬尾松、黧蒴錐、浙江潤楠的非正常凋落物碳排放速率峰值分別為156.02、323.08、300.57 mg·m?2·h?1，前 3 個階段（0—45 d）的碳排放量分別占其總排放量的91.39%、93.17%、94.04%。培養過程中馬尾松、黧蒴錐、浙江潤楠的非正常凋落物碳分解量分別為5.80、7.13、5.58 g，占其總分解碳量的67.86%、95.31%、92.41%。

圖1 不同種非正常凋落物的碳排放動態Fig. 1 The dynamics of total CO2 flux of different abnormal litters

2.2 非正常凋落物對土壤的碳激發效應

如圖2所示，馬尾松、黧蒴錐、浙江潤楠3組處理對土壤的碳激發效應過程主要分為3個階段：快速增加階段（0—7 d），非正常凋落物輸入迅速產生強烈的負激發效應，并在7 d左右達到峰值，激發效應強度峰值分別為?50.05、?117.72、?124.08；減弱階段（7—35 d），這一階段中負激發效應逐漸減弱，表現為前期減弱迅速之后逐漸轉慢；平穩階段（35—110 d），整體表現較平穩，不同處理之間有所差異：黧蒴錐和浙江潤楠的負激發效應逐漸降低，而后轉為正激發效應，正激發效應強度分別于45—55 d達到峰值，峰值分別為20.43和20.26，之后激發效應緩慢降低至消失。馬尾松維持較低強度的負激發效應至約90 d，之后緩慢下降消失。

圖2 不同非正常凋落物的土壤碳激發效應強度Fig. 2 The priming effects intensity of different abnormal litters

2.3 土壤有機碳

如表2所示，110 d培養后，馬尾松、黧蒴錐處理組的 0—5 cm土壤 OC含量顯著高于對照組（P<0.05），黧蒴錐的0—5、5—10 cm土壤的δ13C顯著高于對照組（P<0.05）。各處理組與對照組之間全氮（TN）、有效氮（AN）差異均不顯著（P>0.05）。不同土壤深度之間的OC、TN、AN、δ13C呈極顯著差異（P<0.01）。土壤深度和不同處理的雙因素影響下，土壤OC呈顯著差異（P<0.05），而TN、AN、δ13C差異不顯著（P>0.05）。

表2 不同處理組培養前后土壤養分含量Table 2 Soil nutrient content before and after incubation in different treatments groups

3 討論

本研究中，3種非正常凋落物的碳排放速率均表現為前期快速升高，中后期逐步降低并維持在較低水平。整個培養過程中，非正常凋落物中的碳大量消耗，其中 91.39%—94.04%的碳在 0—45 d消耗，這表明非正常凋落物在較短時間內完成了大部分分解。與正常凋落物的分解過程相比（郭培培等，2009），非正常凋落物前期分解速率較高，變化更加劇烈。之前也有研究表明非正常凋落物分解速率快于正常凋落物，如Xu（2006）研究發現，臺風造成的新鮮凋落物整體分解速率高于普通凋落物，與本研究結果相一致。不同種非正常凋落物的分解過程有所差異，其中黧蒴錐分解啟動最快，也是最早開始下降的，表明該種最容易分解；浙江潤楠在培養前期維持了長時間的高速率分解，表明該種易分解組分所占比例較高；馬尾松分解啟動最慢，且最高分解速率較低，但是下降時間較晚，表明該種最難分解。不同種非正常凋落物成分組成差異可能是造成分解過程差異的主要原因，黧蒴錐、浙江潤楠等闊葉樹種中含有更多的單糖等易分解碳且氮、磷等養分含量較高，而馬尾松等針葉樹種含有更多的木質素等不易分解碳且養分含量較低（郭培培等，2009）。

微生物對碳的需求是誘發碳激發效應的主要原因（Wang et al.，2015）。本研究中，非正常凋落物輸入土壤后，在早期抑制SOC分解，引起強烈的負激發效應。之前的研究也得到過類似的結果（Guenet et al.，2010），這可能源于微生物的底物優先利用。底物優先利用假說認為，當外源新鮮有機碳進入土壤中后，比起土壤原有的有機質，微生物更傾向于利用新加入的易分解的碳（Cheng，1999），這一過程往往由善于利用易分解碳的r型微生物主導。研究表明，葡萄糖、蔗糖等易分解的外源添加物往往導致負向的激發效應（Kuzyakov et al.，2000）。易分解碳組分更容易被微生物利用，其輸入引發的激發效應更加強烈，尤其是在激發效應初期（Blagodatskaya et al.，2008）。正常凋落葉在凋落之前養分大部分轉移到了植物其他器官，而由于外力作用而產生的非正常凋落葉中含有大量的水分、易分解碳以及氮、磷等營養元素（Lodge et al.，1991），促使微生物在培養初期大量增殖，生物量急劇增加，促進了非正常凋落物的快速分解，并對土壤有機碳庫產生強烈的負激發效應。

隨著培養的進行，不同樹種非正常凋落物的碳激發效應表現出不同的變化趨勢。黧蒴錐和浙江潤楠對土壤的負激發效應強烈而短暫，在培養開始后約35 d，逐漸轉向低強度的正激發效應，并持續至約70 d。這可能是由于非正常凋落物中易分解的養分大量消耗之后，剩余養分不足以滿足土壤微生物群落的養分需求，迫使其轉向利用土壤原有有機質以滿足自身生長需求，這往往導致在培養后期的碳激發效應由負向轉為正向。Moorhead et al.（2006）研究表明，當外源添加物中的氮元素不足以滿足微生物生長需求時，微生物將加速分解土壤原有有機質以獲得更多的氮元素。不同于黧蒴錐和浙江潤楠，馬尾松組的負激發效應在早期強度較低但持續時間較長，且不會轉為正向而是逐漸消失。這種差異可能源于不同添加物的化學組分及養分含量不同。有研究表明，添加物的化學組份不同可能對碳激發效應產生較大影響（Aerts，1997）。相較于易分解組分含量較高的闊葉樹種，微生物群落對馬尾松等不易分解組分含量較高的針葉樹種葉片的利用效率較低，限制了碳激發作用的強度。同時，馬尾松的非正常凋落物中較低的氮元素含量以及較高的C?N（Wang et al.，2015），也可能是造成這種差異的原因。

一般認為，凋落物和植物根系是土壤有機碳的主要來源（王清奎，2011）。然而，越來越多的研究表明，土壤有機碳主要來源于細根周轉以及真菌（Clemmensen et al.，2013；Treseder et al.，2013）。培養過程中，馬尾松、黧蒴錐和浙江潤楠的非正常凋落物分解釋放的碳有 67.86%—95.31%排放到了大氣當中，表明非正常凋落物的產生顯著促進了森林生態系統碳排放。Yu et al.（2020）的研究表明，新鮮植物殘體分解產生的碳 77.16%—87.90%進入了大氣中，與本實驗結果基本一致。110 d后表層土壤有機碳和δ13C有所增加，但是深層的土壤有機碳和δ13C均沒有顯著變化。表層土壤有機碳含量及δ13C的增加可能源于非正常凋落物中小部分碳分解進入土壤，也可能由于土壤動物的作用下使凋落物碎屑進入了土壤表層（徐璇等，2019）。整體而言，非正常凋落物輸入對土壤有機碳庫的影響較小，而對于碳排放的促進作用較大。這可能源于非正常凋落物養分充足，微生物從土壤中轉移并大量聚集在凋落物層，大部分凋落物中的碳不進入土壤碳庫而直接以CO2的形式釋放到大氣當中。而對于土壤碳庫而言，凋落物中的碳不足以對深層土壤產生影響。同時，土壤碳庫的形成是一個長期的過程，短期的非正常凋落物輸入對土壤碳庫的影響在數月或數年的觀測中難以察覺（Trumbore et al.，2008）。

無論如何，在極端氣候事件的影響下，非正常凋落物的大量輸入將使地表植被的碳大量釋放到大氣當中。非正常凋落物進入土壤的碳可能是土壤碳庫中的快速周轉部分，土壤表層碳的增加可能只是短期效應，而非正常凋落物添加對土壤碳庫的長期影響仍未明確。本研究著重探討了不同碳氮比的非正常凋落物的分解過程及對土壤的碳激發效應，之后將進一步探究非正常凋落物其他化學特征諸如磷含量、木質素含量、水分等的影響。同時，在現實情況下，南亞熱帶林森林受到干擾所產生的非正常凋落物往往是多樹種的混合，本研究只模擬了不同樹種非正常凋落物獨立作用下的分解及對土壤的碳激發效應，針對多樹種非正常凋落物混合作用下的分解及對土壤的碳激發效應仍需進一步研究。

4 結論

非正常凋落物碳排放過程主要表現為前期速率快速升高，之后速率逐漸降低，后期穩定在較低水平，其中91.39%—94.04%的碳在前中期（0—45 d）分解釋放，這表明非正常凋落物在較短時間內完成了大部分分解。不同樹種非正常凋落物添加均會在前期引起土壤碳強烈的負激發效應。隨著培養的進行，不同樹種碳激發效應略有差異。黧蒴錐和浙江潤楠的非正常凋落物輸入土壤后迅速產生強烈且短暫的負激發效應，之后逐漸轉為強度較低的正激發效應。馬尾松的非正常凋落物產生的負激發效應強度低于黧蒴錐和浙江潤楠但持續時間較長，之后逐漸降低至消失。經過110 d的培養，表層土壤有機碳、13C同位素值有所增加，而深層土壤沒有顯著變化。各處理組不同土層的全氮、有效氮均沒有顯著差異。整個培養過程中，非正常凋落物中的碳大部分分解釋放到大氣當中。在全球氣候變化的背景下，頻發的極端氣候事件將干擾森林生態系統并產生更多的非正常凋落物，導致大量CO2釋放到大氣當中，這將對全球氣候變化以及南亞熱帶森林生態系統管理產生深刻影響。