HPV E6/E7 mRNA、Ki-67在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)

蔣笑霞，李紅梅，俞旭云，王福智

（寧海縣婦幼保健院，浙江 寧海 315600）

宮頸癌一般由宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）發(fā)展而來，人乳頭狀瘤病毒（HPV）是與宮頸病變密切相關(guān)的球形DNA病毒[1]，其中E6、E7為高危型HPV早期轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性高危型HPV感染可致E6、E7蛋白大量表達(dá)，增加宮頸組織高級(jí)別病變風(fēng)險(xiǎn)，HPV E6/E7 mRNA多作為反映HPV致癌基因活躍狀態(tài)的指標(biāo)[2]。細(xì)胞增殖相關(guān)核蛋白（Ki-67）與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)，研究表明，Ki-67表達(dá)與CIN呈正相關(guān)[3]。本研究探討了HPV E6/E7 mRNA與Ki-67在不同級(jí)別CIN中的表達(dá)，并分析其臨床意義，旨在為臨床提供更多參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月-2020年3月本院收治的89例子宮頸病變患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）18-65歲；（2）有性生活史；（3）接受病理組織學(xué)檢查、HPV E6/E7 mRNA及Ki-67檢測；（4）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往CIN史、陰道及宮頸治療史、放化療史、HPV感染史；（2）處于妊娠期或哺乳期；（3）合并宮頸外的其他惡性腫瘤；（4）合并肝腎等功能不全、免疫系統(tǒng)疾病、凝血功能障礙；（5）既往接受免疫抑制劑治療。根據(jù)組織病理學(xué)檢查結(jié)果，根據(jù)宮頸上皮內(nèi)瘤變的級(jí)別進(jìn)行分組[4]，其中CIN1級(jí)組18例、CIN2級(jí)組31例、CIN3級(jí)組26例和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組14例。選取同期本院收治的23例子宮良性病變患者為對照組，術(shù)中取正常子宮頸組織作為對照。各組年齡、孕次、產(chǎn)次比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見表1。研究經(jīng)本院倫理會(huì)批準(zhǔn)，且患者知情同意。

表1 各組一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 （1）宮頸細(xì)胞：檢測前3天無性生活、無陰道沖洗或用藥，經(jīng)期內(nèi)患者擇期檢查；利用一次性窺陰器充分暴露患者宮頸，清理宮頸口分泌物后，宮頸細(xì)胞刷順時(shí)針輕旋轉(zhuǎn)收集脫落細(xì)胞；置于宮頸細(xì)胞保存液（美國Hologic公司）4℃保存。（2）宮頸組織：手術(shù)收集宮頸組織，以10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋；連續(xù)切片，層厚4μm，48℃展片。

1.2.2 HPV E6/E7 mRNA檢測 取宮頸細(xì)胞，采用熒光PCR染料法行HPV-DNA檢測，操作按照HPV-DNA檢測試劑盒（博奧生物集團(tuán)有限公司，貨號(hào)340020）說明書，熒光PCR儀（美國ABI公司，型號(hào)7500）定量分析，以≥500拷貝數(shù)為陽性，反之為陰性。采用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增法（TMA）進(jìn)行HPV E6/E7 mRNA檢測，操作按照HPV E6/E7 mRNA試劑盒（美國Hologic公司，貨號(hào) 10210）說明書，根據(jù)分析物信號(hào)與閾值之比（S/CO）進(jìn)行判讀，S/CO≥1.0為陽性，反之為陰性。

1.2.3 Ki-67檢測 取宮頸組織切片，采用免疫組化SP染色法檢測；常規(guī)脫蠟，置于3%過氧化氫溶液處理5分鐘；蒸餾水沖洗3次，浸入0.1mol/L檸檬酸鈉緩沖液中，高壓加熱至噴汽3分鐘，冷卻后用PBS溶液（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號(hào)PBS-0061）沖洗1-2次；滴加Ki-67單克隆抗體（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號(hào)：MAB-0672），4℃過夜；PBS溶液沖洗2分鐘，滴加HRP標(biāo)記鼠/兔二抗（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號(hào)：Kit-5030）30℃ 15分鐘；PBS溶液沖洗 1次/min，連續(xù)3次；按照DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號(hào)：DAB-1031）說明書操作，蘇木素復(fù)染1分鐘后依次行脫水、透明和封片處理，顯微鏡下觀察染色情況；以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，反之為陰性。

1.3 觀察指標(biāo) 比較各組HPV E6/E7 mRNA和Ki-67的表達(dá)情況，并分析HPV E6/E7 mRNA和Ki-67陽性表達(dá)率與宮頸上皮內(nèi)瘤變級(jí)別的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用（±s）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Snk-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)。HPV E6/E7 mRNA和Ki-67陽性表達(dá)率與宮頸病變程度相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析。

2 結(jié)果

與對照組比較，CIN1級(jí)組、CIN2級(jí)組、CIN3級(jí)組及宮頸鱗狀細(xì)胞癌組HPV E6/E7 mRNA、Ki-67陽性表達(dá)率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。HPV E6/E7 mRNA及Ki-67陽性表達(dá)率與宮頸病變程度呈正相關(guān)（rHPVE6/E7mRNA=0.712，P＜0.01；rKi-67=0.698，P＜0.01）。 詳見表 2。

表2 各組HPV E6/E7 mRNA、Ki-67的表達(dá)[n（%）]

3 討論

宮頸鱗狀細(xì)胞癌為宮頸癌常見病理類型，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)漸進(jìn)過程，多由宮頸不典型增生發(fā)展而成[5]。HPV持續(xù)感染已被證實(shí)與宮頸病變密切相關(guān)，且為宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[6]。HPV基因組包括早期基因區(qū)、晚期基因區(qū)和長調(diào)控區(qū)，E6和E7是位于HPV早期基因區(qū)的致癌基因，其編碼的蛋白可致宮頸上皮癌變，并在病變進(jìn)一步發(fā)展過程中參與病毒DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)宮頸癌變[7]。Ki-67是與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)抗原，其陽性率越高提示腫瘤細(xì)胞有絲分裂數(shù)高，生長較快，組織分化能力就差。Min等[8]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌和CIN2-3級(jí)患者宮頸組織Ki-67表達(dá)水平高于CIN1級(jí)，宮頸癌Ki-67表達(dá)水平高于CIN2-3級(jí)，Ki-67表達(dá)水平與HPV感染呈正相關(guān)，提示檢測Ki-67對于CIN和早期宮頸癌診斷具有一定臨床價(jià)值。

本研究采用支鏈DNA信號(hào)擴(kuò)增法檢測宮頸組織HPV E6/E7 mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)宮頸病變組織HPV E6/E7 mRNA陽性表達(dá)率增加，符合以往研究結(jié)果[9]，相關(guān)性分析提示，HPV E6/E7 mRNA表達(dá)與宮頸病變程度呈正相關(guān)，提示HPV E6/E7基因過度表達(dá)可能與CIN和宮頸癌變過程有關(guān)，分析原因?yàn)镋6/E7基因編碼致癌蛋白與細(xì)胞內(nèi)p53和pRb兩種主要抑癌蛋白結(jié)合，調(diào)控和改變細(xì)胞生長周期及DNA修復(fù)，使宿主細(xì)胞基因組有游離狀態(tài)逐漸以整合狀態(tài)存在，最終導(dǎo)致宮頸癌變[10]。本研究采用免疫組化SP染色法檢測不同宮頸病變組織Ki-67，發(fā)現(xiàn)子宮頸病變組織Ki-67陽性表達(dá)率增加，與以往研究結(jié)果一致[11]，相關(guān)性分析顯示，Ki-67表達(dá)與宮頸病變程度呈正相關(guān)，機(jī)制可能與癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及細(xì)胞自噬有關(guān)[12]。

綜上，HPV E6/E7 mRNA和Ki-67在子宮頸病變組織中陽性表達(dá)率較高，且與病變程度呈正相關(guān)，臨床可行HPV E6/E7 mRNA和Ki-67檢測，以便早期發(fā)現(xiàn)宮頸上皮惡性變，進(jìn)一步提高患者預(yù)后。