11種常用農藥對地熊蜂工蜂的毒性和風險評估

王宏棟,韓 冰,王玉賽,韓 雙,王汝明,李冬剛,*

(1.德州市農業科學研究院,山東德州 253015;2.德州市農業農村事業發展中心,山東德州 253000)

我國大中拱棚以上的設施面積達370萬hm2，居世界第一，約占世界設施農業總面積的80%，其中設施蔬菜播種面積400萬hm2，占蔬菜播種面積的17%(駱飛等,2020)。隨著設施蔬菜產業的迅速發展，設施作物對蜂類授粉的依賴和需求日漸增加，這是由于設施農業封閉或半封閉的環境，阻礙了傳粉昆蟲的進入，蔬菜在開花期間得不到充足的授粉，造成坐果率低、畸形果多等問題，直接影響了產量和品質，傳統的人工授粉和激素蘸花不僅增加勞動強度，而且授粉效果不理想，還會造成激素殘留，因此，設施農作物授粉難已經成為困擾當前設施農業發展的一個巨大難題(付寶春和楊蛟峰,2014)。

地熊蜂Bombusterrestris屬膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂總科(Apoidea)蜜蜂科(Apidae)熊蜂屬Bombus，是一類多食性社會性昆蟲，是多種植物，尤其是茄科和豆科植物的重要授粉者(魏夢宇和王星,2017)。我國是全世界熊蜂物種資源最豐富的國家，根據已有的文獻資料，我國已探明的熊蜂有125種，這為國內熊蜂良種的篩選奠定了堅實基礎(徐希蓮和王歡,2018)。目前，在國外熊蜂授粉蜂群作為商品已經實現了出口創匯，達到了產業化水平。我國于20世紀90年代開始對熊蜂種質資源進行調查和篩選工作，熊蜂人工繁殖的研究和授粉應用示范已有20年，熊蜂授粉技術因其具有節省人工、提升果實產量和品質、減少環境污染和藥物殘留等優勢(Daganetal.,2004;Polaszek,2010)，已成為我國設施農業實現設施作物優質、高效、高產的一項重要配套技術措施(周進等,2017)。

與此同時，設施蔬菜產業的迅速發展也給病蟲提供了適宜的生長、繁殖和危害作物的生態環境。尤其是，各類植食性有害生物如蚜蟲、薊馬、粉虱、葉螨等的危害不斷加劇，造成極大的經濟損失(雷仲仁等,2016)。由于蔬菜生長周期較短，病蟲害的發生種類多、危害重，農業生產上不得不使用農藥進行防治(田毓起,2000)。然而農藥長期大量使用，不可避免地會對授粉昆蟲造成一定的傷害，如蜜蜂長時間暴露在殘留化學物質中會表現出反應遲鈍、運動不協調、震顫等中毒現象，甚至壽命縮短，造成蜂群數量減少，影響授粉的效果(Oldroyd,2007;史晶亮等,2019)。

目前國內關于不同農藥對蜜蜂屬Apis的急性毒性研究較多，而作為全球范圍內研究和商業化應用最為成熟的地熊蜂，對其關注不夠，相關毒性研究比較少，并且還忽視了殺菌劑的毒性，僅僅評價了部分新煙堿類、植物源類和昆蟲生長調節劑類殺蟲劑對地熊蜂的生態風險性(王爍等,2020a,2020b,2020c)。單一種類殺蟲劑在長時間使用過程中會導致害蟲在選擇壓力下產生抗藥性，因此選擇不同種類的藥物，尤其是輪換使用不同化學結構和不同作用機理的殺蟲劑就顯得尤為重要。因此，本研究根據殺蟲劑的作用機理和化學結構，從不同類型挑選11種農業常用的殺蟲劑、殺螨劑和殺菌劑農藥作為待試藥劑，采用經口毒性和接觸毒性兩種方法探究了11種農藥對地熊蜂工蜂的毒性，并利用危害熵值評估其對地熊蜂工蜂的生態風險，以期為設施蔬菜熊蜂授粉期間合理選擇農藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試蜂種為地熊蜂B.terrestris工蜂，購自山東魯保科技開發有限公司，于溫度25±2℃、相對濕度60%±10%、黑暗條件下進行飼養，飼養過程未接觸化學農藥和試劑。試驗所用地熊蜂均為個體大小基本一致的健康成年采集工蜂。

1.2 供試藥劑

供試藥劑為10%蟲螨腈懸浮劑(廣東省佛山市盈輝作物科學有限公司)、2.5%高效氯氟氰菊酯水乳劑(青島星牌作物科學有限公司)、17%氟吡呋喃酮可溶液劑[拜耳作物科學(中國)有限公司]、22.4%螺蟲乙酯懸浮劑[拜耳作物科學(中國)有限公司]、20%異丙威乳油(河南省安陽市五星農藥廠)、20%除蟲脲懸浮劑(河北威遠生物化工有限公司)、20%丁氟螨酯懸浮劑(江蘇省蘇州富美實植物保護劑有限公司)、5%唑螨酯懸浮劑(福建省德盛生物工程有限責任公司)、43%聯苯肼酯懸浮劑(愛利思達生物化學品有限公司)、2%春雷霉素水劑(日本北興化學工業株式會社)、50%啶酰菌胺水分散粒劑(巴斯夫歐洲公司)。

1.3 農藥對熊蜂的毒力測定

參考我國《化學農藥環境安全評價試驗準則.第10部分:蜜蜂急性毒性試驗》(袁善奎等,2014)，根據半數致死劑量(median lethal dose,LD50)(48 h)將農藥對熊蜂的毒性劃分4個等級(以有效成分計)：低毒(LD50>11.0 μg a.i./蜂)；中毒(2.0 μg a.i./蜂

1.3.1急性經口毒性：參照《化學農藥環境安全評價試驗準則.第10部分:蜜蜂急性毒性試驗》(袁善奎等,2014)，將待試藥劑母液，用50%的蔗糖水溶液稀釋成5個濃度梯度，為保證試驗體系中有效成分均勻分散，所有系列濃度稀釋液均使用超聲波助溶。按每頭蜂取食20 μL的量在飼喂器中加入不同濃度的藥劑糖水溶液200 μL，將饑餓處理2 h的成年工蜂移入蜂籠，每個蜂籠10頭成蜂，每個處理重復3次，并設50%蔗糖水為空白對照。飼喂3 h待藥劑消耗完后添加充足50%蔗糖水繼續飼養，記錄24 h和48 h熊蜂工蜂死亡數，計算熊蜂工蜂的死亡率。

1.3.2急性接觸毒性：參照《化學農藥環境安全評價試驗準則.第10部分:蜜蜂急性毒性試驗》(袁善奎等,2014)，用丙酮或蒸餾水配置的母液稀釋成5個濃度梯度。用微量點滴儀將不同濃度的供試藥劑按每頭蜂2 μL點滴在用CO2麻醉后熊蜂的中胸背板上，待蜂身晾干后轉入蜂籠中，用充足的50%蔗糖水飼喂，每個蜂籠10頭成蜂，每個處理重復3次，并設丙酮溶劑為空白對照。記錄24 h和48 h熊蜂工蜂死亡數，計算熊蜂工蜂的死亡率。

1.3.3質量控制條件：參照周新等(2008)，設置上限劑量500 μg a.i./蜂，即在此條件下，未見熊蜂死亡，則不再進行毒力測定；若試驗藥劑溶解度小于500 μg a.i./蜂，則采用最大溶解度作為上限濃度；如在較高劑量試驗藥劑下，熊蜂拒絕采食，或是采食量很小，則最多將試驗時間延長至6 h，并測定試驗藥劑殘存量(即測定該處理的食物殘存的體積)，用蔗糖溶液將剩余藥物溶液替換掉。

1.3.4風險評估：農藥對熊蜂的風險評估參照歐洲和地中海植物保護組織所采用的危害熵(hazard quotient,HQ)值(EPPO,2000;王爍等,2020c)。HQ值為農藥田間推薦用量(AR)(g a.i./hm2)與農藥對熊蜂急性經口或接觸LD50(μg a.i./蜂)值的比值：HQ=AR/LD50。HQ>2 500，高風險；501時，風險不可接受。本研究分別采用飼喂法和接觸法測得的48 h的LD50計算HQ和RQsp值，田間推薦劑量按照已在我國農業部登記的同一有效成分田間推薦用量的最大范圍來計算。

1.3.5中毒癥狀觀察：急性經口和急性接觸試驗期間，需保證助劑對照組和空白對照組熊蜂均表現正常，觀察記錄試驗組熊蜂是否出現活動減少、行動緩慢，甚至出現精神萎靡不振、掛壁不動等癥狀，對比熊蜂對于幾種待試藥劑毒性癥狀的不同表現。

1.4 數據分析

利用IBM SPSS Statistics 20軟件對試驗所得數據進行Probit統計分析，計算得出毒力回歸方程、LD50、95%置信區間，并分析每種農藥對地熊蜂工蜂的毒性等級。

2 結果

2.1 不同農藥對地熊蜂工蜂的急性經口毒性

試驗中，加入待試藥劑配制的糖水后，地熊蜂均取食干凈，未出現拒絕采食或采食量很小的現象。由表1可知，通過飼喂法測得的各農藥對地熊蜂工蜂的24 h的LD50值由小到大為：高效氯氟氰菊酯<異丙威<蟲螨腈<氟吡呋喃酮<唑螨酯<除蟲脲<聯苯肼酯<啶酰菌胺<春雷霉素<螺蟲乙酯<丁氟螨酯，LD50值分別為0.033,0.416,0.816,4.338,5.657,28.273,52.306,95.223,224.762,337.929和>500 μg a.i./蜂。其中，丁氟螨酯達到上限試驗，即藥劑劑量500 μg a.i./蜂時，24 h試驗期未引起地熊蜂工蜂死亡，因此判定對地熊蜂的急性經口毒性24 h的半致死劑量LD50>500 μg a.i./蜂。除丁氟螨酯的各農藥對地熊蜂工蜂的24 h的LD50均大于48 h的LD50。根據我國《化學農藥環境安全評價試驗準則.第10部分:蜜蜂急性毒性試驗》中(袁善奎等,2014)，農藥對蜜蜂急性毒性分級標準，11種農藥的急性經口毒性除高效氯氟氰菊酯、異丙威和蟲螨腈為高毒，氟吡呋喃酮和唑螨酯為中毒外，其余藥物均為低毒。

2.2 不同農藥對地熊蜂工蜂的急性接觸毒性

由表2可知，通過接觸法測得的各農藥對地熊蜂工蜂的24 h的LD50值由小到大為：高效氯氟氰菊酯<異丙威<蟲螨腈<除蟲脲<氟吡呋喃酮<聯苯肼酯<春雷霉素<唑螨酯<螺蟲乙酯<丁氟螨酯<啶酰菌胺，LD50值分別為0.208,0.407,4.307,149.095,175.533,569.066,607.466,833.016,1 413.374,1 822.028和1 954.632 μg a.i./蜂。各農藥對地熊蜂工蜂的24 h的LD50均大于48 h的LD50。根據我國《化學農藥環境安全評價試驗準則.第10部分:蜜蜂急性毒性試驗》中(袁善奎等,2014)，農藥對蜜蜂急性毒性分級標準，11種農藥的急性接觸毒性除高效氯氟氰菊酯和異丙威為高毒，蟲螨腈為中毒外，其余藥物均為低毒。

2.3 不同農藥對地熊蜂工蜂的生態風險評估

不同農藥對地熊蜂成年工蜂的生態風險評估結果見表3，通過飼喂法和接觸法測得的48 h的LD50值計算得到11種農藥對地熊蜂成年工蜂的危害熵值(HQ)。11種供試藥物中，異丙威和高效氯氟氰菊酯的經口與接觸危害熵值均位于50～2 500之間，為中風險；蟲螨腈的經口危害熵值位于50～2 500之間，為中風險，但是接觸危險熵值小于50，為低風險；氟吡呋喃酮、啶酰菌胺、除蟲脲、唑螨酯、聯苯肼酯、螺蟲乙酯、春雷霉素、丁氟螨酯的經口與接觸危害熵值均小于50，為低風險。通過風險熵值(RQsp)計算得出，除蟲螨腈對熊蜂的經口風險、異丙威和高效氯氟氰菊酯對熊蜂的經口和接觸風險為不可接受外，其余藥物的風險均為可接受。

表3 11種農藥對地熊蜂成年工蜂的危害熵值Table 3 Hazard quotient (HQ)values of eleven pesticides to adult workers of Bombus terrestris

農藥類型Pesticidetypes藥物類別Categories供試藥物Testedpesticides試驗類型TesttypeLD50(μga.i./individual)田間用量(ga.i./hm2)FieldrecommendeddoseHQ風險程度Riskassessment吡咯類蟲螨腈經口Oral0.6784566.37中MediumPyrroleChlorfenapyr接觸Contact2.91415.44低Low擬除蟲菊酯類高效氯氟氰菊酯經口Oral0.03015500.00中MediumPyrethroidBeta-Cyhalothrin接觸Contact0.18780.21中Medium新型煙堿類氟吡呋喃酮經口Oral3.50810229.08低Low殺蟲劑NeonicotineFlupyradifurone接觸Contact157.1080.65低LowInsecticides季酮酸類螺蟲乙酯經口Oral266.814100.80.38低LowQuaternaryketoicacidSpirotetramat接觸Contact1227.8640.08低Low氨基甲酸脂類異丙威經口Oral0.3166001898.73中MediumCarbamateIsoprocarb接觸Contact0.3191880.88中Medium苯甲酰脲類除蟲脲經口Oral23.0001506.52低LowBenzoylureaDiflubenzuron接觸Contact138.4071.08低Low苯酰基乙腈類丁氟螨酯經口Oral>50080<0.16低LowBenzoylacetonitrileCyflumetofen接觸Contact1691.2480.05低Low殺螨劑苯氧吡唑類唑螨酯經口Oral4.938306.08低LowAcaricidesPhenoxypyrazoleFenpyroximate接觸Contact693.0690.04低Low聯苯肼類聯苯肼酯經口Oral42.425193.54.56低LowBiphenylhydrazineBifenazate接觸Contact476.8390.41低Low抗生素類春雷霉素經口Oral149.12052.50.35低Low殺菌劑AntibioticKasugamycin接觸Contact526.2570.10低LowFungicides吡啶酰胺類啶酰菌胺經口Oral87.3116006.87低LowPyridineamideBoscalid接觸Contact1856.6536000.32低Low

2.4 地熊蜂工蜂對不同農藥的毒性反應

地熊蜂工蜂對不同農藥的反應表現為：高效氯氟氰菊酯和異丙威引起地熊蜂痙攣和抽搐顫動；氟吡呋喃酮則引起地熊蜂亂飛亂撞；除蟲脲導致地熊蜂呆立不動；蟲螨腈、唑螨酯和聯苯肼酯引起地熊蜂移動遲緩，而后仰臥在地；螺蟲乙酯和丁氟螨酯引起地熊蜂中毒表現為初期倒地翻滾，之后不能爬行移動；春雷霉素和啶酰菌胺作為殺菌劑，地熊蜂在取食或接觸后，中毒癥狀為呆立不動。死亡的地熊蜂均表現為雙翅張開、喙伸出、腹部收縮。

3 結論與討論

近年來，農藥對蜜蜂屬包括西方蜜蜂Apismellifera和中華蜜蜂A.ceranacerana的毒性研究引起了業界廣泛的關注，而作為全球范圍內研究和商業化應用最為成熟的地熊蜂，對其關注不夠，相關毒性研究比較少，并且還忽視了殺菌劑的毒性。本研究分別采用了飼喂法和接觸法對地熊蜂成年工蜂進行了室內毒力測定，從測定結果來看，所選11種待試藥物，無論采用飼喂法還是接觸法，對地熊蜂成年工蜂的結果略有不同，其中高效氯氟氰菊酯和異丙威均為高毒；除蟲脲、聯苯肼酯、春雷霉素、螺蟲乙酯、丁氟螨酯、啶酰菌胺均為低毒，而蟲螨腈的經口毒性為高毒、接觸毒性為中毒；氟吡呋喃酮和唑螨酯的經口毒性為中毒、接觸毒性為低毒。11種農藥對地熊蜂成年工蜂的24 h的LD50均大于48 h的LD50，這也說明隨著藥物作用時間的延長，藥物對于地熊蜂的毒性也在增強。除異丙威的急性經口和急性接觸的LD50值相差不大以外，其余藥物急性經口毒性的LD50值要遠遠小于急性接觸毒性，表明這些藥物對于地熊蜂的胃毒能力要大于觸殺能力。

在本研究中，蟲螨腈作為吡咯類殺蟲劑，是線粒體氧化磷酸化的解偶聯劑，干擾質子濃度，干擾能量代謝，具有胃毒和一定的觸殺作用，蟲螨腈在地熊蜂上的急性經口毒性為高毒，與張艷峰等學者在意大利蜜蜂上測定的結果相一致，急性接觸毒性為中毒，要弱于張艷峰等學者所得到的高毒結果(張艷峰和王會利,2020)。氟吡呋喃酮作為新煙堿類殺蟲劑，是煙堿型乙酰膽堿受體的激動劑，使神經元細胞長時間處于激動狀態，具有胃毒和觸殺作用，氟吡呋喃酮在地熊蜂上的急性接觸毒性為低毒，與王爍等學者研究的結果相一致，而急性經口毒性為中毒，要強于王爍等學者所得到的低毒結果(王爍等,2020c)。趙帥等學者研究發現，同樣的有效成分不同的劑型作用在意大利蜜蜂上的急性毒性結果也存在很大差異(趙帥等,2011)。造成這2種藥物急性毒性結果存在差異的原因可能是地熊蜂和蜜蜂的敏感性存在差異，也可能是與所選農藥的劑型或助劑、溶劑不同有關。高效氯氟氰菊酯作為擬除蟲菊酯類廣譜殺蟲劑，主要是破壞神經元鈉離子通道，從而造成神經系統紊亂，具有觸殺和胃毒作用，高效氯氟氰菊酯在地熊蜂上的急性毒性均為高毒，這與趙怡楠等學者在海南中蜂Apisceranahainana上(趙怡楠等,2014)，以及張艷峰等學者在意大利蜜蜂上測定的結果(張艷峰和王會利,2020)相一致。螺蟲乙酯作為季酮酸類殺蟲劑，主要是抑制乙酰輔酶A羧化酶活性，阻斷昆蟲能量代謝，是以胃毒作用為主、以觸殺作用為輔，螺蟲乙酯在地熊蜂上的急性毒性均為低毒，這與周浩等學者測定的結果(周浩等,2016)相一致。春雷霉素和啶酰菌胺作為殺菌劑，在地熊蜂上的急性毒性均為低毒，并且LD50值均較高，這與王雅珺等學者在中華蜜蜂上測定的結果(王雅君等,2017)相一致。由這些研究結果可以看出，對非靶標生物蜜蜂總科的不同屬來說，同一有效成分，當它的理化性質和作用方式相同，所呈現的急性毒性結果也可能一致；而同一有效成分，當劑型或助劑、溶劑不同時，即使是對地熊蜂同種來說，農藥的理化性質不同，進入蟲體的途徑及其穿透性也會存在差異，隨之而來的急性毒性結果也略有不同。除蟲脲作為苯甲酰脲類殺蟲劑，主要是抑制昆蟲幾內質的合成，以胃毒作用為主、兼具觸殺性，除蟲脲在地熊蜂上的急性毒性結果均為低毒，與王爍等學者在地熊蜂上測定的氟鈴脲、滅幼脲等其他苯甲酰脲類殺蟲劑的結果(王爍等,2020a)相一致，但對比幾種藥物所測定得到的LD50值，仍存在著倍數差異，我們分析原因可能是：苯甲酰脲類殺蟲劑的作用機理類似，對于地熊蜂也表現出相一致的毒性結果，但由于化學結構存在差異，苯胺環取代基不同，以及劑型或助劑、溶劑不同，理化性質也略有差異，因此LD50值差異較大。基于所有以上研究結果，我們綜合分析后推斷，藥物所引起的急性毒性作用，與藥物進入蟲體的途徑及其穿透性和作用機理有關，受藥物的脂溶性、解離度、表面張力等理化性質，以及劑型或所用助劑、溶劑的影響。另外，在本研究中，異丙威作為氨基甲酸酯類殺蟲劑，主要是吸附抑制乙酰膽堿酯酶，造成乙酰膽堿大量積聚，從而影響神經沖動傳導，同樣具有胃毒和觸殺性，異丙威在地熊蜂上的急性毒性均為高毒。唑螨酯作為苯氧吡唑類殺螨劑，主要是作用于線粒體電子傳遞鏈復合體Ⅰ，從而抑制電子鏈傳遞影響能量合成；聯苯肼酯作為聯苯肼類殺螨劑，主要作用是抑制線粒體電子傳遞鏈復合體Ⅲ；丁氟螨酯是新型酰基乙腈類殺螨劑，主要作用是抑制線粒體電子傳遞鏈復合體Ⅱ，這3種藥物作為農業上常用殺螨劑，均具有觸殺和胃毒作用，除唑螨酯對地熊蜂成年工蜂的急性經口毒性為中毒、急性接觸毒性為低毒外，其余2種藥物的急性毒性結果均為低毒。

在設施作物花期使用地熊蜂授粉時，建議禁用異丙威、高效氯氟氰菊酯和蟲螨腈這3種存在中風險的農藥，慎重使用氟吡呋喃酮和唑螨酯這2種農藥，以避免對地熊蜂造成危害，而另外6種低毒農藥可根據田間情況合理施用，并可采取通風晾曬、設置放蜂間隔期等方式降低農藥對地熊蜂的生態風險。