柞蠶微粒子病潛在生物標志物的挖掘

孫 影,梁瑞業,張文娟,王 勇,3,姜義仁,3,*,秦 利,3,*

(1.沈陽工學院生命工程學院,遼寧撫順 113122;2.沈陽農業大學生物科學技術學院,沈陽 110866; 3.遼寧省昆蟲資源工程技術研究中心,沈陽 110866)

柞蠶Antheraeapernyi是我國重要的經濟昆蟲之一，近幾年我國柞蠶放養面積基本穩定在80萬hm2左右，年產柞蠶繭8萬噸以上(封槐松和李建琴,2016)。柞蠶幼蟲期生活在野外，各種病害嚴重影響柞蠶繭的產量及質量，往往造成巨大的經濟損失。其中，柞蠶微粒子病是柞蠶生產中唯一的檢疫性病害，該病害既可水平傳播又可垂直傳播，已成為制約柞蠶產業健康發展的瓶頸問題之一(秦利,2003)。目前，柞蠶生產上對于該病的防控仍一直沿用雌蛾顯微鏡檢查的方法，該方法費時費力，且準確性受人為因素影響較大，不僅給柞蠶制種工作帶來極大的負擔，而且難以保證種卵質量。因此，開發柞蠶微粒子病的檢測方法對于保障柞蠶產業健康發展具有重要的意義。

代謝組學是一種研究生物體內代謝的系統方法，主要以分子量在1 000以下的小分子代謝物為研究對象，通過比較不同狀態生物樣本中低分子量代謝物信息，反映生物體對病理生理刺激、遺傳修飾和周圍環境的反應，相比于轉錄組學、基因組學和蛋白質組學，代謝譜更接近于對疾病過程的反應，在很多疾病的早期診斷、監測及致病機理等方面具有廣泛的應用潛力(Nicholsonetal.,1999,2002;Gowdaetal.,2008;Emwasetal.,2013;Zengetal.,2017)。利用代謝組學技術發掘新型生物標志物已是很多研究領域廣泛采用的策略，包括癌癥(Chengetal.,2011;Tumasetal.,2016)、糖尿病(Savolainenetal.,2017;Zengetal.,2017)、慢性病(Mastrangelo and Barbas,2017)及健康老齡化(Almeidaetal.,2021)等重要疾病研究。柞蠶微粒子病的病原物為柞蠶微孢子蟲Nosemapernyi，微孢子蟲侵染會造成柞蠶體內蛋白質在種類及含量上發生顯著的變化，導致柞蠶生理或病理過程發生改變(姜義仁等,2012;臧敏等,2012)，推測在柞蠶微粒子病發生過程中柞蠶體內的代謝物也會發生相應的變化。本研究以健康及患柞蠶微粒子病雌成蟲血淋巴為材料，采用代謝組學技術分析健康與患病柞蠶雌成蟲血淋巴內代謝物差異，篩選差異代謝物，挖掘病害的潛在生物標志物，為開發柞蠶微粒子病的檢測方法提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試柞蠶沈黃2號雌成蟲由遼寧省昆蟲資源工程技術研究中心提供。隨機挑選剛羽化柞蠶雌成蟲若干，冰上快速采集血淋巴，并對采血后雌成蟲進行顯微鏡檢查，鏡檢出微孢子蟲的雌成蟲(患微粒子病)的血淋巴標記為M組，鏡檢健康的雌成蟲的血淋巴標記為H組，所有樣品液氮冷凍后置于-80℃冰箱中備用。

1.2 代謝物提取

取25 μL冰上解凍后的柞蠶雌成蟲血淋巴樣品，加入250 μL 50%甲醇溶液，震動充分混勻，提取樣品中的代謝物，常溫靜置10 min；提取液放置-20℃過夜，沉淀樣品中的蛋白質，4 000 g離心20 min，轉移上清液到96孔板；利用稀釋液(異丙醇∶乙腈∶水=2∶1∶1，體積比)稀釋代謝物提取液，樣品稀釋液作為代謝物上樣樣品，每組各取6個生物學重復。每個樣品中等量取出10 μL稀釋液混合作為質控(quality control,QC)樣品。所有樣品代謝物提取液上樣前保存于-80℃冰箱。

1.3 液相色譜及質譜條件

利用超高效液相色譜儀(ExionLC,SCIEX)進行數據采集，色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm,Waters)；采用高分辨率質譜儀TripleTOF5600plus飛行時間質譜(SCIEX，英國)進行代謝物采集，每個樣本進行一次正離子模式采集和一次負離子模式采集，正離子模式的噴霧電壓為5 000 V，負離子模式的噴霧電壓為-4 500 V，儀器參數設置參照鄭海英等(2019)方法。

1.4 代謝物注釋和定量分析

1.4.1代謝物注釋：利用Proteowizard的MSConver軟件將原始文件轉換成mzXML文件，將mzXML文件導入XCMS軟件進行代謝物峰提取、保留時間矯正。利用CAMERA軟件進行代謝物同位素、加和離子分析；利用metaX軟件結合KEGG和HMDB數據庫進行代謝物注釋，質量誤差為10 ppm；對質譜二級碎片數據與in-house代謝物標準品二級圖譜庫進行匹配、打分，提取相似性>80%的代謝物。

1.4.2代謝物定量分析：利用XCMS軟件(Smithetal.,2006)提取所有樣品的所有代謝物強度信息，采用metaX軟件(Wenetal.,2017)對數據進行質控。去質量峰(QC樣品中缺失超過50%或實際樣品中缺失超過80%的離子)；利用KNN(k-nearest neighbor)方法進行缺失值補充；利用PQN(probabilistic quotient normalization)算法對所有樣品進行數據歸一化，再利用QC樣品進行QC-RSC(QC-robust spline batch correction)校正；對校正后的數據進行過濾，去掉不穩定的代謝物，即在QC樣品中相對標準差(relative standard deviation,RSD)>30%的離子。

1.5 差異表達代謝物篩選及其功能分析

使用metaX軟件進行單變量和多變量分析獲得健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品間差異表達代謝物。采用單變量分析對每組6個生物學重復測代謝物強度的平均值計算其在健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品間的比值(ratio)，即差異表達倍數(fold change)，利用T檢驗進行統計學分析，對檢驗結果作多重檢驗分析，主要利用BH(Benjamini-Hochberg)校正得到P值；結合多變量統計分析，運用偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)建立代謝物表達量和樣品類別之間的關系模型，建立健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品之間的PLS-DA模型，同時對該模型參數R2和Q2進行了置換檢驗，次數為200次，進而得到每個代謝物的變量重要性(variable importance,VIP)值；顯著差異表達代謝物同時滿足：ratio≥2或ratio≤1/2,P<0.05,VIP≥1。

2 結果

2.1 健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴代謝物統計

為探討柞蠶微粒子病雌成蟲體內代謝物的變化，我們對柞蠶健康及患微粒子病雌成蟲的血淋巴樣品進行了代謝組學分析，獲得樣品的代謝物總離子流圖(圖1)。從圖1可知，患病與健康雌成蟲的血淋巴之間代謝物種類存在差異。在正離子模式下獲得8 870個代謝物，其中注釋代謝物5 390個，二級鑒定代謝物312個；在負離子模式下獲得6 716個代謝物，其中注釋代謝物3 848個，二級鑒定代謝物177個。

圖1 健康與患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品代謝物質譜總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of metabolites from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometerA:正離子模式In positive ion model;B:負離子模式In negative ion model;H:健康Healthy;M:患病Sick;QC:質控Quality control.下同The same below.

2.2 健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴代謝物鑒定

正、負離子模式下分別鑒定了2 629和1 983個一級鑒定代謝物，均被注釋到40個KEGG二級代謝通路，兩種模式鑒定的代謝物分別有2 109和1 606個被分類到新陳代謝(metabolism)中12個條目，134和107個被分類到人類疾病(human diseases)中11個條目，256和159個被分類到有機體系統(organismal systems)中9個條目，8和5個被分類到細胞過程(cellular processes)中3個條目，103和82個被分類到環境信息處理(environmental information processing)中的3個條目，19和24個被分類到遺傳信息處理(genetic information processing)中的2個條目；在人類疾病二級通路中，正、負離子模式下代謝物數量最多的是癌癥概況(cancers:overview)(分別為75和59個)，其次是抗腫瘤藥物耐藥性(drug resistance:antineoplastic)(分別為12和12個)和神經退行性疾病(neurodegenerative diseases)(分別為12和8個)，還包括藥物依賴性(substance dependence)(分別為9和6個)、特定類型癌癥(cancers:specific types)(分別為6和5個)、內分泌和代謝疾病(endocrine and metabolic diseases)(分別為6和6個)、細菌性傳染病(infectious diseases:bacterial)(分別為4和3個)和傳染性寄生蟲病(infectious diseases:parasitic)(分別為6和4個)等(圖2)。鑒定代謝物數量最多的前20個代謝通路如圖3所示，正、負離子模式下前3位代謝通路依次為代謝通路(metabolic pathways)(分別為704和516個)、2-氧羧酸代謝(2-oxocarboxylic acid metabolism)(分別為75和72個)和氨基酸生物合成(biosynthesis of amino acids)(分別為69和68個)。正、負離子模式下，分別有28 622和20 683個一級鑒定代謝物被注釋到HMDB數據庫中的24個和22個功能分類中，前2位功能分類依次為脂和類脂分子(lipids and lipid-like molecules)(分別為16 530和11 223個)和苯丙素類和聚酮化合物(phenylpropanoids and polyketides)(分別為4 959和4 833個)(圖4)。

圖4 健康與患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品正離子(A)和負離子(B)模式下質譜檢測的一級鑒定代謝物的HMDB注釋Fig.4 HMDB super class annotation of metabolites primarily identified from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometer in positive ion (A)and negative ion (B)models

正離子模式下，312個二級鑒定代謝物中有293個被注釋到HMDB數據庫的11個super classes的42個條目，16個沒有被注釋(na)，3個為未知(unknown)，注釋代謝物數量前3位的條目分別為甘油磷脂(glycerophospholipids)(67)、脂肪酰基化合物(fatty acyls)(62)和羧酸及其衍生物(carboxylic acids and derivatives)(34)(圖5:A)；251個代謝物被注釋到85個KEGG代謝通路中，其中排名前20位的通路如圖6(A)所示，前3位通路分別為代謝通路(metabolic pathways)(42)、ABC轉運蛋白(ABC transporters)(12)和蛋白質消化和吸收(protein digestion and absorption)(12)。負離子模式下，177個二級鑒定代謝物中有175個被注釋到HMDB數據庫的8個super classes的25個條目，2個沒有被注釋，前3位分別為甘油磷脂(glycerophospholipids)(71)、羧酸及其衍生物(carboxylic acids and derivatives)(27)和脂肪酰基化合物(fatty acyls)(16)(圖5:B)；213個代謝物被注釋到85個KEGG代謝通路中，代謝物數量前3位通路分別為代謝通路(metabolic pathways)(32)、癌癥的中心碳代謝(central carbon metabolism in cancer)(9)和氨基酸生物合成(biosynthesis of amino acids)(9)(圖6:B)。

圖5 健康與患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品正離子(A)和負離子(B)模式下質譜檢測的二級鑒定代謝物的HMDB注釋Fig.5 HMDB annotation of metabolites secondarily identified from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometer in positive ion (A)and negative ion (B)models

圖6 健康與患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品正離子(A)和負離子(B)模式下質譜檢測的二級鑒定代謝物的前20個KEGG代謝通路注釋Fig.6 Annotation of top 20 KEGG pathways of metabolites secondarily identified from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometer in positive ion (A)and negative ion (B)models

2.3 健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴代謝物定量

正、負離子模式下，分別篩選出7 966個和 6 143個高質量代謝物歸一化后用于統計分析，二級鑒定的高可信度代謝物在每個樣品中的強度分布見圖7。

圖7 健康與患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品正離子(A)和負離子(B)模式下質譜檢測的二級鑒定代謝物強度熱圖Fig.7 Heatmap of the intensity of metabolites secondarily identified from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometer in positive ion (A)and negative ion (B)models

2.4 健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴差異表達代謝物的篩選

以健康組(H)為對照，篩選微粒子病組(M)差異表達的代謝物。結果表明，正離子模式下，篩選到差異表達代謝物472個，其中260個上調，212個下調；負離子模式下，差異表達代謝物301個，其中207個上調，94個下調。對兩組各個樣品的差異表達代謝物進行聚類，結果如圖8所示，健康組(H)與微粒子病組(M)的差異表達代謝物彼此分開。

圖8 健康和患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品正離子(A)和負離子(B)模式下質譜檢測的差異表達代謝物表達強度熱圖Fig.8 Heatmap of the expression intensity of differentially expressed metabolites identified from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometer in positive ion (A)and negative ion (B)models

2.5 健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴差異表達二級鑒定代謝物篩選

柞蠶健康雌蛾和患微粒子病雌蛾兩組之間的PLS-DA模型結果表明，正離子模式下，建立的PLS-DA模型的R2為0.9949，Q2為0.6719(圖9:A)；負離子模式下，建立的PLS-DA模型的R2為0.9976，Q2為0.7310(圖9:B)，表明正、負離子模式下構建的PLS-DA模型較為可靠，差異表達代謝物在兩組之間的表達量能夠較好地將健康與患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品區分開。

圖9 健康和患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品正離子(A)和負離子(B)模式下質譜檢測的差異表達代謝物PLS-DA得分圖Fig.9 PLS-DA score plot of differentially expressed metabolites identified from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometer in positive ion (A)and negative ion (B)models

篩選出差異表達的二級鑒定的代謝物(表1)中正離子模式下，篩選到差異表達代謝物12個，其中8個上調，4個下調；負離子模式下，篩選到差異表達代謝物9個，其中8個上調，1個下調。

3 討論

本研究利用代謝組學技術分析了柞蠶健康及患微粒子病雌成蟲血淋巴內代謝物的差異，了解了柞蠶雌成蟲血淋巴內代謝物種類和柞蠶微粒子病對柞蠶雌成蟲血淋巴內代謝物的影響，為深入開展柞蠶微粒子病的檢測及致病機理等研究奠定了基礎。本研究中，正離子模式下質譜檢測獲得8 870個代謝物，其中注釋代謝物5 390個，篩選到微粒子病組相對于對照組健康的差異表達代謝物472個，其中260個上調，212個下調，這些差異表達代謝物中有二級鑒定代謝物12個(8個上調，4個下調)，分別為纈氨酸(valine)、苯并噻唑(benzothiazole),3-脫羥基肉堿(3-dehydroxycarnitine),1-甲基鳥嘌呤(1-methylguanine)、2-乙氧基萘(2-ethoxynaphthalene)、N6-乙酰基-L-賴氨酸(N6-acetyl-L-lysine)、生物素(biotin)、桑色素(morin)、噻嗎洛爾(timolol)、酰基肉堿15∶0(acylcarnitine 15∶0)、酰基肉堿18∶4(acylcarnitine 18∶4)和異槲皮苷(isoquercitrin)；負離子模式下獲得6 716個代謝物，其中注釋代謝物3 848個，篩選到差異表達代謝物301個(207個上調，94個下調)，其中二級鑒定差異表達代謝物9個(8個上調，1個下調)，分別為二甲基丙二酸(dimethylmalonic acid)、戊二酸(glutaric acid)、2,5-二羥基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid)、1,3-二乙酰基丙烷(1,3-diacetylpropane)、3-(4-羥基苯基)乳酸(DL-p-hydroxyphenyllactic acid)、泛酸(pantothenate)、熒光素(fluorescein)、飛燕草素-3-O-beta-吡喃葡萄糖苷(delphinidin-3-O-beta-glucopyranoside)和溶血磷酯酰肌醇16∶1(lysoPI 16∶1)(表1)。

表1 健康及患微粒子病柞蠶雌成蟲血淋巴樣品質譜二級鑒定的差異表達代謝物統計表Table 1 Statistical analysis of differentially expressed metabolites secondarily identified from the haemolymph samples of healthy and pebrine-infected female adults of Antheraea pernyi by mass spectrometer

目前，關于柞蠶代謝組方面的研究報道較少，本研究鑒定到這些差異代謝物可能與柞蠶微粒子病的病程相關，有待進一步研究。這21個二級鑒定差異表達代謝物分別注釋到HMDB數據庫中的8個super classes，其中包括苯型烴類(benzenoids)(2)、脂和類脂分子(lipids and lipid-like molecules)(3)、有機酸及其衍生物(organic acids and derivatives)(5)、有機化合物(organic compounds)(1)、有機氮化合物(organic nitrogen compounds)(1)、有機氧化合物(organic oxygen compounds)(1)、有機金屬雜環化合物(organoheterocyclic compounds)(4)和苯丙素類和聚酮化合物(phenylpropanoids and polyketides)(4)(圖5)。本研究發現，柞蠶微粒子病組的3-脫羥基肉堿顯著上調表達，差異表達倍數達到了20.96，有意思的是在糖尿病(Zengetal.,2017)、紅肉消費及其相關疾病(Romboutsetal.,2017)等研究中該代謝物同樣也上調表達。有研究表明，3-脫羥基肉堿為腸道細菌分解代謝左旋肉堿(L-carnitine)的中間代謝物，推測腸道微生物可能參與到糖尿病進程(Kleber,2006;Koethetal.,2014)。柞蠶微粒子病會嚴重影響柞蠶幼蟲的營養消化吸收功能(姜義仁等,2012)，推測柞蠶微孢子蟲也可能通過影響柞蠶幼蟲腸道微生物而參與到柞蠶微粒子病進程。這些差異代謝物在柞蠶微粒子病發生與發展過程中可能發揮重要作用，具有潛在的生物標志物功能。雖然本研究僅按照柞蠶制種生產的操作程序進行取樣及初步分析了患柞蠶微粒子病及健康雌蛾血淋巴的差異代謝物，但發現代謝組學技術在柞蠶微粒子病研究中具有積極的應用價值及潛力。我們后續研究中將結合柞蠶微粒子病的分子檢測手段來進一步提高檢測靈敏性來確保取樣的準確性，并計劃以柞蠶幼蟲為材料進行人工添食微孢子蟲孢子，深入探討侵染時期及孢子濃度等對柞蠶體內代謝物產生的影響，為進一步揭示柞蠶微粒子病的致病機理及開發病害診斷檢測技術奠定基礎。