肺類器官
——研究人類肺部發(fā)育和疾病的新途徑

楊天立，王向東，白 楠，董柳含，車皓月，蔡 蕓 解放軍總醫(yī)院 醫(yī)療保障中心，藥劑科，藥物臨床研究室，北京 00853； 解放軍總醫(yī)院研究生院，北京 00853

肺是由一個(gè)高度分支的管道系統(tǒng)組成的復(fù)雜器官，能夠參與各種重要的生理過程，包括氣體交換和免疫防御。肺的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜而精密的過程，任何階段的失敗/缺陷都可能導(dǎo)致嚴(yán)重的先天性疾病甚至死亡。在成人肺內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的情況下，細(xì)胞更新率通常很低。現(xiàn)有的呼吸道祖細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，而這些祖細(xì)胞在應(yīng)對(duì)各種損傷時(shí)具有增殖和分化為一種或多種細(xì)胞的能力[1]。這種能力引起了研究者的廣泛關(guān)注。雖然目前部分動(dòng)物模型能夠用來研究肺的發(fā)生和發(fā)病機(jī)制，但種屬差異性卻限制了許多試圖闡明人類肺特性和發(fā)育的研究。目前，以胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESC)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)為主的人類多能干細(xì)胞(human pluripotent stem cell，hPSC)最常被用于體外研究人的肺部生理學(xué)和病理學(xué)[2]。3D體外模型被認(rèn)為是最接近實(shí)際器官的模型，因此也被稱為“類器官”，通常具有與原生器官相似的結(jié)構(gòu)組織、來自多個(gè)胚層的細(xì)胞類型以及多個(gè)細(xì)胞譜系[3]。近年來，類器官也逐漸成為研究體外發(fā)育過程、組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)和病理狀況的復(fù)雜生理學(xué)模型[4]。人類類器官能夠進(jìn)行人類出生缺陷、人類特異性病原體以及臨床試驗(yàn)前對(duì)試驗(yàn)藥物進(jìn)行療效篩選等研究。同時(shí)在人類肺中干/祖細(xì)胞的特性研究，尋找哮喘和肺囊性纖維化(cystic fibrosis，CF)等疾病的新療法，以及內(nèi)源性修復(fù)在慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、肺氣腫、家族性和特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)和閉塞性細(xì)支氣管炎綜合征(bronchiolitis obliterans syndrome，BOS)等疾病中作用的研究方面，肺類器官也具有很大的應(yīng)用前景[5-6]。本文著重介紹肺類器官的主要類別及研究現(xiàn)狀、肺類器官的培養(yǎng)過程、肺類器官技術(shù)的獨(dú)特應(yīng)用、肺類器 官培養(yǎng)的主要局限。

1 肺類器官的主要來源及研究現(xiàn)狀

成人肺包括近端和遠(yuǎn)端兩個(gè)區(qū)域，氣管、支氣管和細(xì)支氣管構(gòu)成傳導(dǎo)區(qū)(氣道)，由Club細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、纖毛細(xì)胞、基底細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞組成，通過黏膜纖毛活動(dòng)排出異物和病原體，有助于濕潤空氣和保護(hù)肺部。進(jìn)行氣體交換的呼吸區(qū)(肺泡)由Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial type 1 and type 2，AT1 and AT2 cells)以及相關(guān)血管系統(tǒng)組成。肺類器官則主要由兩種來源的細(xì)胞產(chǎn)生——從成熟肺組織分離的上皮干/祖細(xì)胞[7]和人類多能干細(xì)胞[8-10]，前者包括基底祖細(xì) 胞、氣道分泌細(xì)胞和AT2細(xì)胞。

1.1 基底祖細(xì)胞 基底細(xì)胞排列在人的大部分氣道和小鼠的主支氣管中，緊貼基底層，不延伸到管腔[1]。基底細(xì)胞特異表達(dá)的基因包括編碼轉(zhuǎn)錄因子Trp63、細(xì)胞角蛋白Krt5、整合素α6(integrin alpha 6，Itga6)、平足蛋白(podoplanin，Pdpn；也稱為T1α)和跨膜神經(jīng)生長因子受體(nerve growth factor receptor，Ngfr；也稱為p75)的基因[11]。

從人類肺組織中分離的基底細(xì)胞通過擴(kuò)增能夠獲得類器官，而不同類器官則根據(jù)基底細(xì)胞是來源于氣管還是大氣道命名。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，類器官應(yīng)包含TRP63+KRT5+基底細(xì)胞、功能性纖毛細(xì)胞和分泌杯狀細(xì)胞(MUC5AC+，MUC5B+)[12-15]。由于基底細(xì)胞也存在于鼻腔上皮細(xì)胞中，因此從這些細(xì)胞中獲得的類器官能夠方便臨床醫(yī)生對(duì)患者進(jìn)行最終的藥物篩選[16]。人類基底細(xì)胞來源的類器官目前能夠被用來篩選影響纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞比例的細(xì)胞因子和其他蛋白質(zhì)，未來也可能作為某些穩(wěn)態(tài)失衡性疾病的潛在治療手段，如慢性哮喘。但目前由于缺乏檢測(cè)基因表達(dá)的方法，使 用人類類器官作篩選仍受到較大的限制[6]。

1.2 氣道分泌細(xì)胞 分泌細(xì)胞是指肺部氣道上皮中的柱狀、無纖毛、非神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，主要有Club細(xì)胞和杯狀細(xì)胞。成熟的Club細(xì)胞能夠合成并儲(chǔ)存Secretoglobins(Scgb1a1，Scgb3a2)和Splunc1等蛋白質(zhì)，而杯狀細(xì)胞能夠合成并儲(chǔ)存黏蛋白Muc5AC和Muc5B等。

Club細(xì)胞是一個(gè)異質(zhì)性細(xì)胞群，在病毒和細(xì)菌感染、損害氣道或肺泡上皮細(xì)胞的因子作用下，能夠表現(xiàn)出相當(dāng)強(qiáng)的表型可塑性[17]。使用化療藥物博來霉素?fù)p傷肺泡區(qū)域后，譜系追蹤研究可以發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)端細(xì)支氣管中表達(dá)Scgb1a1的細(xì)胞進(jìn)行增殖并在肺泡中產(chǎn)生具有AT1和AT2細(xì)胞特征的后代細(xì)胞[18]。類器官培養(yǎng)提供了一個(gè)模型系統(tǒng)，理論上可以用于測(cè)試細(xì)胞因子和生長因子對(duì)單個(gè)細(xì)胞增殖和分化的影響，以及識(shí)別具有較強(qiáng)再生潛力的Club細(xì)胞亞群。然而，目前缺乏同時(shí)純化和定位這些Club細(xì)胞亞群的有效表面標(biāo)志物。

氣道分泌細(xì)胞類器官的研究目前只在小鼠中實(shí)現(xiàn)，主要使用流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)(fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS)。McQualter等[19]基于檢測(cè)表面標(biāo)記表達(dá)的方法分離出Scgb1a1+細(xì)胞用來構(gòu)建類器官，而Chen等[20]使用Scgb1a1-CreER敲入等位基因和熒光表達(dá)等位基因進(jìn)行譜系追蹤，分離出Club細(xì)胞進(jìn)行類器官研究。這些結(jié)果顯示了Club細(xì)胞亞群與AT2細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)化為基底細(xì)胞的能力確實(shí)存在差異。而后，用類器官培養(yǎng)測(cè)試遠(yuǎn)端細(xì)支氣管中同時(shí)表達(dá)Sftpc的部分Scgb1a1+Club細(xì)胞亞群對(duì)肺內(nèi)皮細(xì)胞因子的反應(yīng)[18,21]，結(jié)果表明細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞(bronchioalveolar stem cell，BASC)具有分化為AT2細(xì)胞和氣道細(xì)胞的潛力。

目前，分離BASC的標(biāo)準(zhǔn)方法涉及FACS和其是否表達(dá)EpCAM和Sca1。未來的新技術(shù)將使這些細(xì)胞能夠在編碼Scgb1a1和Sftpc基因共表達(dá)的基礎(chǔ)上得到更嚴(yán)格的純化，從而找到其他標(biāo)志物 來區(qū)分BASC與其他Club細(xì)胞。

1.3 AT2細(xì)胞 肺泡上皮細(xì)胞有兩種不同的形態(tài)及功能：AT2細(xì)胞，呈立方形，能夠產(chǎn)生肺泡表面活性物質(zhì)(如Sftpc、Sftpb)、板層小體以及與它們的生成和分泌有關(guān)的基因(如Lamp3和Lyz2)，肺泡表面活性物質(zhì)可以降低肺泡表面張力，防止肺泡塌陷[22]；AT1細(xì)胞，大鱗狀細(xì)胞，覆蓋肺泡的大部分表面積，與毛細(xì)血管緊密相連，通常表達(dá)糖基化終產(chǎn)物特異性受體(advanced glycosylation end product-specific receptor，Ager)、Pdpn和轉(zhuǎn)錄因子Hopx。

由于肺氣腫和特發(fā)性肺纖維化等呼吸系統(tǒng)疾病影響氣體交換區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能，需要更多地了解肺泡干細(xì)胞的生物學(xué)特性。人類的AT2細(xì)胞可以通過FACS或磁珠分選(magnetic bead sorting，MACS)經(jīng)由單克隆抗體HTII280進(jìn)行特異性分離。

肺泡的形成需要支持細(xì)胞的存在，為了更接近上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系，需要一種能夠使兩種細(xì)胞群都能存活的培養(yǎng)基[19]。幾種不同的支持細(xì)胞群已用于小鼠類器官的構(gòu)建，與免疫/巨噬細(xì)胞亞群結(jié)合的效果正在研究中。同樣，使用損傷前還是損傷后分離的細(xì)胞、老年小鼠還是年輕小鼠的細(xì)胞、攜帶與人類肺泡疾病相關(guān)特定突變細(xì)胞的研究也正在進(jìn)行中[23]。

用類器官研究肺泡上皮細(xì)胞基因功能的主要困難是小鼠或人的AT2細(xì)胞均不能在Matrigel基質(zhì) 膠中進(jìn)行有效的培養(yǎng)擴(kuò)增。

1.4 hPSC 目前研究者們正在努力培育未成熟的肺上皮細(xì)胞和間充質(zhì)祖細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠被大量擴(kuò)增，然后定向分化為成熟的氣道和(或)肺泡組織。如來源于慢性哮喘或CF患者的iPSC所生成的氣道上皮細(xì)胞，可用來驗(yàn)證祖細(xì)胞表觀遺傳學(xué)的改變能夠影響其自我更新和分化能力這一觀點(diǎn)[24]，以及CF患者iPSC來源的肺類器官也可以提供一個(gè)可靠和可重復(fù)的突變細(xì)胞來源，以篩選補(bǔ)償或糾正患者特異性突變的藥物[25]。

在肺泡組織中，hPSC分化為遠(yuǎn)端肺祖細(xì)胞將有助于研究AT2細(xì)胞的突變，這些突變可以導(dǎo)致呼吸衰竭和間質(zhì)性肺病。對(duì)健康者和患者特異性hPSC來源的遠(yuǎn)端上皮進(jìn)行組學(xué)對(duì)比，將有助于更好地了解突變細(xì)胞如何隨著時(shí)間的推移而失調(diào)[26]。進(jìn)行CRISPR/Cas9基因編輯后仍能夠擴(kuò)增并穩(wěn)定分化的祖細(xì)胞，有助于該技術(shù)能夠在發(fā)育過程中檢測(cè)人類特異基因在氣道和肺泡細(xì)胞分化中的功 能。

2 肺類器官的培養(yǎng)過程

與成熟肺上皮干/祖細(xì)胞來源的類器官相比，多能干細(xì)胞(pluripotent stem cell，PSC)來源的類器官需要額外的處理步驟，即將PSC誘導(dǎo)為肺上皮干/祖細(xì)胞，肺類器官培養(yǎng)的全程都涉及體內(nèi)多種 信號(hào)通路嚴(yán)格的時(shí)間和空間控制。

2.1 hPSC向前部前腸球體分化 首先，使用重組人激活素A(Activin A)誘導(dǎo)PSC分化為終末內(nèi)胚層(definitive endoderm，DE)，在DE形成后，通過使用Noggin和小分子抑制劑(SB431542)分別抑制BMP和TGF-β信號(hào)通路，從而獲得前腸特性，生成SOX2+AFE。許多信號(hào)通路對(duì)肺的誘導(dǎo)和發(fā)育非常重要，Activin A模擬的Nodal信號(hào)在脊椎動(dòng)物的DE發(fā)育中起著決定性的作用，而成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)gf)和Wnt信號(hào)的激活協(xié)同促進(jìn)了hPSC源性內(nèi)胚層中CDX2+腸道譜系的形成，同時(shí)也促進(jìn)了2D結(jié)構(gòu)自我組織轉(zhuǎn)化為由間充質(zhì)層和極化上皮層組成的3D球體，抑制BMP和TGF-β信號(hào)能夠促使組織進(jìn) 入SOX2+前腸譜系[27]。

2.2 通過Fgf和Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)前腸內(nèi)胚層(anterior foregut endoderm，AFE)進(jìn)入肺譜系 為了進(jìn)一步使前腸球體向肺譜系發(fā)育，目前的研究主要集中于調(diào)控Fgf和Hedgehog(Hh)信號(hào)傳導(dǎo)。Fgf信號(hào)在肺生長和分支形態(tài)發(fā)生中起著重要的作用，而Hh分子在體內(nèi)對(duì)肺間質(zhì)的增殖也有重要作用。高水平的Fgf分子可以誘導(dǎo)Sonic Hedgelog(SHh，即高等動(dòng)物的Hh)在肺內(nèi)胚層的表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子陽性(NKX2.1+)的肺祖細(xì)胞發(fā)育，而在前腸球體期添加Hh激活劑(smoothened agonist，SAG)則是提高NKX2.1表達(dá)最有效的方法。目前這兩種信號(hào)通路的配體已經(jīng)應(yīng)用于2D培養(yǎng)的hPSC源性肺譜系[25,28]。

總的來說，在hPSC源性內(nèi)胚層培養(yǎng)物中加入Fgf 2、Fgf 4、BMP、Wnt和Hh等生長因子混合物，可以使其成功分化為表達(dá)NKX2.1的肺祖細(xì) 胞。

2.3 前 腸 球 體 生 成 人 肺 類 器 官(human lung organoid，HLO) 將前腸球體植入Matrigel基質(zhì)膠中，形成3D生長環(huán)境。在含有1%胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中對(duì)前腸球體進(jìn)行維持培養(yǎng)，3D培養(yǎng)20 d內(nèi)就會(huì)逐漸失去鈣黏蛋白(E-Cadherin，ECAD)陽性的上皮結(jié)構(gòu)并由間質(zhì)填充[29]。Fgf 10在成人肺的發(fā)育過程中，對(duì)于肺祖細(xì)胞的分支形成和維持以及組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)是必不可少的。與基礎(chǔ)條件和添加Fgf抑制劑相比，F(xiàn)gf 10促進(jìn)維持ECAD+上皮結(jié)構(gòu)，減少間質(zhì)的形成，并且在整個(gè)HLO中都表達(dá)近端肺標(biāo)志物SOX2和遠(yuǎn)端肺標(biāo)志物SOX9。隨著時(shí)間的推移，F(xiàn)gf 10處理的前腸球體能夠保持NKX2.1的表達(dá)；然而，遠(yuǎn)端祖細(xì)胞標(biāo)志物NMYC和ID2表達(dá)降低，而遠(yuǎn)端A T1和AT2細(xì)胞標(biāo)志物Hopx和Sftpc表達(dá)增加[30]。

2.4 HLO產(chǎn)生近端氣道樣結(jié)構(gòu) 培養(yǎng)2個(gè)月以上的HLO具有明顯的類似近端氣道的上皮結(jié)構(gòu)，能夠表達(dá)近端細(xì)胞特異性的標(biāo)志物，如基底細(xì)胞表達(dá)P63、纖毛細(xì)胞表達(dá)FOXJ1、ACTTUB以及Club細(xì)胞表達(dá)SCGB1A1等，且近端類氣道組織常被平滑肌肌動(dòng)蛋白(smooth muscle actin，SMA)陽性的間充質(zhì)隔層所包圍[29]。在超過2個(gè)月的長時(shí)間培養(yǎng)時(shí)，能夠看到P63+細(xì)胞沿著上皮管樣結(jié)構(gòu)的基底側(cè)排列，并與SMA+間質(zhì)相鄰，類似于人類支氣管和細(xì)支氣管[15]。在HLO近端氣道樣結(jié)構(gòu)管腔面的細(xì)胞可表達(dá)纖毛細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子FOXJ1，另一種纖毛細(xì)胞標(biāo)志物ACTTUB則定位于這些細(xì)胞的頂端側(cè)，但細(xì)胞表面并未發(fā)現(xiàn)纖毛，且鮮有細(xì)胞表達(dá)Club細(xì)胞標(biāo)志物SCGB1A1[29]。

研究表明，hPSC源性纖毛細(xì)胞的成熟分化需要改變培養(yǎng)條件以促進(jìn)細(xì)胞功能的分化，而Wnt通路能夠調(diào)節(jié)NKX2.1肺上皮祖細(xì)胞向近端氣道分化，使用Wnt激活劑(CHR99021)可促進(jìn)向遠(yuǎn)端上皮分化，而停用CHR99021可快速促進(jìn)向近端上皮分化[10]。因此，Matrigel基質(zhì)膠和富含F(xiàn)gf 10的培養(yǎng)基并不會(huì)促進(jìn)所有類型細(xì)胞向終末分化。此時(shí)，如果將前腸內(nèi)胚層接種于脫細(xì)胞肺基質(zhì)上，可以觀察到近端氣道樣結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞頂端表面 ACTTUB+的纖毛結(jié)構(gòu)向腔內(nèi)成簇生長[29]。

2.5 HLO產(chǎn)生未成熟的肺泡氣道樣結(jié)構(gòu) 在HLO培養(yǎng)過程中肺遠(yuǎn)端上皮細(xì)胞可表達(dá)包括SOX9、ID2和NMYC在內(nèi)的祖細(xì)胞標(biāo)志物，其中SOX9為持續(xù)性表達(dá)，而ID2和NMYC表達(dá)量隨著培養(yǎng)時(shí)間延長而減少[30]。在肺泡相關(guān)生長因子作用下，與人成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，可獲得PSC源性肺泡。多數(shù)研究表明，聯(lián)合使用地塞米松、CHIR99021、Fgf 7、cAMP和磷酸二酯酶抑制劑IBMX足以促進(jìn)肺泡分化并產(chǎn)生Sftpc+上皮細(xì)胞[9,31-33]。在一項(xiàng)長時(shí)間培養(yǎng)HLO的研究中，可以看到表達(dá)Sftpc和Sftpb的極少量AT2細(xì)胞，以及表達(dá)Pdpn和Hopx的極少量AT1細(xì)胞[29]，提示HLO主要為未分化的肺泡祖細(xì)胞，在遠(yuǎn)端類氣道組織中分布著極少的分化成熟的AT1細(xì)胞和AT2細(xì)胞。

為了獲得遠(yuǎn)端上皮細(xì)胞并部分克服PSC源性上皮細(xì)胞的成熟度限制，除了延長體外培養(yǎng)時(shí)間，與胎肺間質(zhì)共培養(yǎng)[32]、植入脫細(xì)胞肺基質(zhì)中[34]、在旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行分化[35]或小鼠腎包膜下的移植[28,31, 36]等方法也有探索。這些方法均表明，細(xì)胞外基質(zhì)的機(jī)械外力作用，以及來自細(xì)胞外基質(zhì)或來自間充質(zhì)細(xì)胞的分子信號(hào)均在促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞分化方面起著關(guān)鍵作用。

3 肺類器官技術(shù)的獨(dú)特應(yīng)用

建立肺類器官有助于進(jìn)一步了解肺部的發(fā)育過程和病理生物學(xué)，這兩點(diǎn)都是尋找治療呼吸系統(tǒng)疾病新方法的關(guān)鍵。人類肺部發(fā)育、修復(fù)和再生的幾個(gè)重要研究結(jié)果都是從小鼠模型中推斷出來的[37]。然而，人與鼠的肺組織之間存在著許多內(nèi)在差異，如基底細(xì)胞遍布于人體氣道，但在小鼠中僅限于氣管，亦如杯狀細(xì)胞在人呼吸道中常見，但在小鼠中少見等。雖然肺上皮細(xì)胞系能夠表現(xiàn)出人類肺組織的一些表性特征，但這些細(xì)胞系只能單層培養(yǎng)，并且很難通過其進(jìn)一步了解肺組織發(fā)育和形成過程的影響因素，如上皮-間充質(zhì)相互作用和分支形態(tài)發(fā)生等[22]。因此，建立人體模型是準(zhǔn)確研究人肺發(fā)育的關(guān)鍵。近年來，已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了hPSC源性肺類器官的建立，雖然它們?cè)隗w外培養(yǎng)時(shí)仍處于與胎肺相似的轉(zhuǎn)錄和功能狀態(tài)，但可以通過移植到小鼠腎包膜或附睪脂肪墊下使其形態(tài)成熟且具備一定的生理功能[29,31,38]。目前尚不清楚為什么類器官模型不能在體外“成熟”，但這些hPSC源性肺類器官具有的未成熟性狀成為探索未完全發(fā)育肺生理和病理過程的理想模型，最終能夠?yàn)榉尾堪l(fā)育不成熟的早產(chǎn)兒開發(fā)新的治療方法。

對(duì)于某些呼吸道疾病研究來說，小鼠并非完美模型，如在建立小鼠CF模型時(shí)，通過致病基因囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)突變的方法，小鼠模型并不能完全重現(xiàn)人類疾病的癥狀[39]。目前，通過CFTR突變的肺類器官可以成功建立CF類器官模型，并表現(xiàn)出關(guān)鍵的CF表型[40]，這項(xiàng)研究表明肺類器官是一種易于操作的模型，可用于體外檢測(cè)CFTR藥物的療效。杯狀細(xì)胞化生是一種與CF、哮喘和COPD相關(guān)的表型，亟需體外人體模型來開發(fā)新的治療方法。最近一項(xiàng)對(duì)人肺類器官的研究發(fā)現(xiàn)，IL-13和IL-17A均可誘導(dǎo)黏膜高分泌表型，使纖毛細(xì)胞標(biāo)志物減少且杯狀細(xì)胞標(biāo)志物增多，而Notch信號(hào)的調(diào)節(jié)是IL-13誘導(dǎo)的黏膜高分泌表型的一個(gè)控制因素，抑制Notch2可以防止杯狀細(xì)胞化生[13]。因此，Notch通路是目前治療杯狀細(xì)胞化生的一個(gè)潛在的治療干預(yù)靶點(diǎn)，該項(xiàng)研究也突出了類器官對(duì)呼吸系統(tǒng)研究的價(jià)值。

目前人們關(guān)于感染對(duì)呼吸道的影響及其發(fā)病機(jī)制的了解有限，主要是由于缺乏一個(gè)真實(shí)的模型來重現(xiàn)體外感染的表型。近年來，hPSC源性肺類器官已被用于研究麻疹病毒、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)和人類副流感病毒3型(human parainfluenza virus type 3，HPIV3)感染[31,41]。嬰幼兒呼吸道感染主要由RSV引起，目前尚無疫苗或有效藥物，而RSV感染的hPSC源性肺類器官則再現(xiàn)了RSV感染人肺的重要特征，即感染細(xì)胞腫脹，與上皮細(xì)胞分離并脫落到受感染的支氣管腔中。HPIV3是兒童下呼吸道疾病的常見病因，HPIV3感染的肺類器官在組織完整性方面沒有明顯變化，也沒有感染細(xì)胞脫落到管腔中，與臨床表現(xiàn)一致，且肺類器官中的HPIV3全基因組測(cè)序與在臨床環(huán)境中分離的病毒也完全相同。這些研究表明，肺類器官可以作為研究呼吸道病毒發(fā)病機(jī)制的可靠模型，能夠重現(xiàn)宿主的感染情況，為研究宿主-病原體相互作用、肺部感染和病毒在肺部傳播機(jī)制提供了一個(gè)有價(jià)值的工具。引起COVID-19大流行的2019-nCoV主要導(dǎo)致包括AT2細(xì)胞在內(nèi)的肺上皮細(xì)胞損傷[42]，肺類器官能夠重現(xiàn)肺的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞微環(huán)境，有望為揭示COVID-19發(fā)病機(jī)制和篩選有效治療藥物提供一個(gè)新方法。

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)自1832年被Koch發(fā)現(xiàn)以來，對(duì)東南亞和一些非洲國家的人口健康構(gòu)成了巨大威脅[43-44]。世界衛(wèi)生組織提出2035年消除結(jié)核病這一策略，在此過程中最大的障礙是耐藥菌株的出現(xiàn)以及HIV合并感染[45]。用于研究結(jié)核病病理學(xué)和藥物篩選的動(dòng)物模型有幾個(gè)明顯的缺陷。首先，通常容納MTB感染動(dòng)物的設(shè)施都很昂貴，限制了動(dòng)物在結(jié)核病研究中的應(yīng)用；此外，這些動(dòng)物不是MTB的天然宿主，因此它們只能部分模擬結(jié)核病的臨床癥狀、特征性的病理病變(肉芽腫形成和肺空洞)和免疫指標(biāo)變化[46]。而人肺類器官的顯著優(yōu)勢(shì)在于其空間結(jié)構(gòu)的存在和細(xì)胞成分的異質(zhì)性[47]，肺泡類器官的MTB感染可以納入非常早期的MTB(動(dòng)物模型很難做到)，而且還能克服種屬差異[48]。因此，將MTB注射到人肺泡類器官可用來研究MTB與肺泡上皮細(xì)胞之間的直接作用，或?qū)⒚庖呒?xì)胞(如巨噬細(xì)胞等)加入類器官結(jié)構(gòu)中模擬體內(nèi)免疫反應(yīng)的復(fù)雜性[47]。

研究腫瘤發(fā)生和早期肺癌的特征可以大大提高早期診斷肺癌的能力，但目前肺癌的早期診斷能力仍較差，通常是其他醫(yī)療檢查時(shí)意外發(fā)現(xiàn)[22,49]。肺癌的動(dòng)物模型可以提供豐富的信息，但也存在著顯著的種屬差異，如人類細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中與嚙齒類動(dòng)物所需的致癌和抑癌基因是不同的，這些差異可能會(huì)阻礙小鼠研究成果向人類的轉(zhuǎn)化。而用人肺類器官體外模擬肺癌發(fā)生過程較肺癌細(xì)胞系具有明顯的優(yōu)勢(shì)，其包含多種正常的肺細(xì)胞類型，還可以通過基因工程檢測(cè)特定突變驅(qū)動(dòng)前體細(xì)胞的轉(zhuǎn)化能力[22]。因此，探索肺類器官的致癌性轉(zhuǎn)化將有助于開發(fā)可用于研究腫瘤發(fā)生的模型，并能夠提供用于人體治療評(píng)估的新臨床模 型。

4 肺類器官培養(yǎng)的主要局限性

hPSC源性肺類器官極大地促進(jìn)了我們對(duì)肺發(fā)育、再生以及肺部疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，迄今為止，它是唯一能夠研究不同生殖層起源細(xì)胞之間相互作用的完全人源性模型。而以肺類器官作為研究手段獲得研究益處之前，其存在的局限性需要研究者們共同解決。

肺類器官模型面臨的最大挑戰(zhàn)之一是其無法在體外達(dá)到完全成熟。雖然可以通過在小鼠腎包膜下或附睪脂肪墊下進(jìn)行移植來促進(jìn)肺類器官成熟，但在異位移植的情況下，無法進(jìn)行氣體交換等原發(fā)性肺功能的研究。最近的一項(xiàng)研究證實(shí)了經(jīng)氣管內(nèi)移植后的hPSC源性肺類器官在小鼠受損肺中存活的能力，提示了原位肺移植模型能夠?yàn)榉晤惼鞴俚闹踩搿⒎只凸δ芴峁┮粋€(gè)更好的環(huán)境[50]。在這種情況下，需要解決的另一個(gè)問題則是移植細(xì)胞是否在功能上整合到宿主肺組織中并長期存活，且保留完整肺轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)。這就需要更全面地探索介導(dǎo)人類肺部終末分化的分子機(jī)制，然而由于倫理問題，人們對(duì)妊娠晚期和產(chǎn)后肺發(fā)育的研究非常有限[2]。

肺類器官應(yīng)用的另一個(gè)限制是其缺乏免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。目前，體外培養(yǎng)或體內(nèi)移植的肺類器官不具備自身的血管系統(tǒng)、免疫細(xì)胞(如肺泡巨噬細(xì)胞)等，而這些系統(tǒng)的成分和功能在調(diào)節(jié)干細(xì)胞行為和肺組織結(jié)構(gòu)形成中也起著關(guān)鍵作用[47]。

肺類器官在藥物研發(fā)中的應(yīng)用也存在著挑戰(zhàn)。大多數(shù)藥物篩選平臺(tái)要求使用相同的起始材料，如相應(yīng)條件下相同的起始細(xì)胞數(shù)，從而獲得比較可靠的結(jié)果[47]。而類器官是self-organize的組織，通常大小并不一致。如想要在類器官形成過程中控制其大小和直徑，則可能會(huì)影響其分化的軌跡，又會(huì)使其失去招募和組織細(xì)胞的自由。但肺類器官仍是基于表型的藥物發(fā)現(xiàn)平臺(tái)(phenotypebased drug discovery，PDD)[51]的選擇之一。

近年來，患者細(xì)胞來源的3D類器官培養(yǎng)物為肺部腫瘤類器官作為個(gè)性化用藥工具提供了可能[52-54]。但單純肺腫瘤類器官的建立仍是一個(gè)主要問題，可能會(huì)限制其在臨床上的應(yīng)用。最近的一項(xiàng)研究表明，大多數(shù)來源于肺內(nèi)非小細(xì)胞肺癌的類器官會(huì)被過度生長的正常氣道類器官所替代 ，從而限制了單純肺癌類器官的應(yīng)用[55]。

5 結(jié)語

類器官技術(shù)是研究細(xì)胞間通訊和宿主-病原體相互作用的一種新病理模型，也是人類肺部疾病建模、藥物篩選和毒性分析的有力工具。這種工具可以代替一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，從而減少動(dòng)物在呼吸系統(tǒng)研究中的使用。未來待該技術(shù)成熟后，可以建立一個(gè)用于細(xì)胞治療或基因治療的人肺類器官庫，為研究個(gè)體對(duì)治療的反應(yīng)和個(gè)性化藥物的開發(fā)開辟了新途徑。盡管目前用類器官技術(shù)模擬遠(yuǎn)端肺部疾病仍存在難以模擬氣體交換過程中肺部膨脹和收縮的機(jī)械力、缺乏成熟的體外培養(yǎng)等局限性，但目前hPSC源性肺類器官的研究極大推進(jìn)了呼吸道疾病的治療和臨床/基礎(chǔ)研究，而肺類器官的應(yīng)用與活體成像、基因工程和生物材料等新技術(shù)的結(jié)合將極大促進(jìn)肺部相關(guān)研究進(jìn)展。