藥用植物內生菌資源在農業(yè)中的應用與研究進展

常愷莉，張琳，周紅英，張晨雪，葉鴻翔，梅顯貴

（山東農業(yè)大學農學院，山東 泰安 271018）

隨著微生物研究的不斷發(fā)展，人們在健康植物組織內部也發(fā)現(xiàn)微生物的存在，這類微生物后來被稱為“植物內生菌”。目前從藻類、苔蘚、蕨類、裸子植物和被子植物中均已分離到內生菌，并且具有豐富的生物多樣性［1－4］。19世紀中葉，De Bary首先提出了內生菌（endophyte）的概念，將生活在植物組織內部的微生物與生長在植物表面的表生菌（epiphyte）相區(qū)別［5］。1991年Pertrini［1］定義內生菌為“一類在其生活史中的某一段時期存在于健康植物組織內部，而不使宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物”。

諸多研究表明，內生菌與宿主植物在長期協(xié)同進化過程中逐漸形成了一種互利互惠的關系，并塑造了內生菌特有的基因特征和代謝產物，既能夠直接促進植物生長如調節(jié)或合成植物生長激素、調節(jié)根部生理、促進營養(yǎng)吸收［6，7］等，通過與宿主進行遺傳信息交換，調控宿主基因表達［8，9］；又能產生抗生素或分泌毒素拮抗作物病原菌、蟲害等間接促進植物生長［10，11］；還可利用內生菌資源進行微生物菌肥或生物農藥的研發(fā)以替代化學農藥或化學肥料進行生物防控、土壤修復改良等，進而實現(xiàn)生態(tài)系統(tǒng)保護，農業(yè)可持續(xù)發(fā)展［12－15］。由此可見，植物內生菌對宿主植物的生長、代謝、抗逆等生理活動有著重要的影響，在農業(yè)生產中具有廣闊的應用前景。

我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥文化歷史悠久，藥用植物資源種類豐富，分布地域廣闊，涵蓋383科，2 309屬，11 146種，僅臨床常用植物藥材就有700余種。藥用植物因其生長環(huán)境的地域差異性和自身特殊的內環(huán)境和生理生化特點，加之物種和地域交叉等因素的影響，蘊藏著豐富而獨特的內生菌資源［4，16］。據(jù)不完全統(tǒng)計，2010年之前的十多年間有關藥用植物內生真菌的研究涉及我國藥用植物21科44屬62種2變種，僅占我國植物資源種類的5.7‰和臨床常用植物藥材的9.1%，對其研究和開發(fā)遠遠不夠［17］。藥用植物內生菌由于其特殊的內環(huán)境、微環(huán)境，從中篩選有價值的菌種資源的幾率大大增加，其開發(fā)和利用是一項快速有效、可持續(xù)發(fā)展的新技術。隨著環(huán)保意識的增強、綠色生態(tài)農業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，將藥用植物內生菌資源運用于農業(yè)研究與生產具有天然優(yōu)勢。本文對近些年藥用植物內生菌在農業(yè)生產中的研究與應用進行綜述，并對存在問題和發(fā)展前景進行探討，以期為藥用植物內生菌資源運用于農業(yè)生產提供借鑒。

1 藥用植物內生菌在農業(yè)生產中的應用

1.1 藥用植物內生菌能夠促進植物生長發(fā)育

藥用植物內生菌與宿主形成了許多共生互促機制，可通過多種途徑促進植物的生長發(fā)育。如某些內生菌可以自身產生生長激素促進宿主生長［18］，或促進種子的萌發(fā)［19］，或促進根部營養(yǎng)的吸收［20］，或促進植物代謝物的積累［21］等。因此，利用內生菌的這些功能特點可以輔助解決植物栽培耕作和生長發(fā)育等過程中的難題。

郭順星等［19］發(fā)現(xiàn)分離自蘭科植物原球莖中的內生菌可以有效促進細葉石斛種子的萌發(fā)；無菌條件下播種無種子萌發(fā)，伴菌播種發(fā)芽率達20%以上；在內生真菌培養(yǎng)物的醇、水提取液培養(yǎng)條件下，種子發(fā)芽率高達40%～70%，但相比而言，內生菌絲伴播更有利于種子萌發(fā)形成的原球莖繼續(xù)發(fā)育。張集慧等［21］發(fā)現(xiàn)分離自蘭科藥用植物的5株內生真菌可促進蘭科藥用植物生長發(fā)育，并從其發(fā)酵液和菌絲體中分別提取出5種植物激素，包括赤霉素、吲哚乙酸、脫落酸、玉米素和玉米核苷，對蘭花的生長發(fā)育有著較好的促進作用；內生菌伴播可有效促進天麻、石斛等種子的萌發(fā)，研究為闡明內生真菌促進蘭科藥用植物生長發(fā)育機制提供了依據(jù)。福建金線蓮［Anoectochilus roxburghii（Wall.）Lindl.］是一種常見的名貴藥材，廣泛用于高血壓、糖尿病和肝炎等的治療，由于長期采挖，野生資源瀕臨滅絕；通過組織培養(yǎng)可大量繁殖，但面臨移栽成活率低、生長緩慢、難以養(yǎng)護成為有價值的商品等一系列問題。唐明娟等［22，23］從野生福建金線蓮根中分離獲得多種菌根真菌并對其生物活性進行研究，發(fā)現(xiàn)部分菌根真菌不但可與金線蓮幼苗形成典型的菌根結構，而且對其生長具有顯著促進作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)在福建金線蓮的家栽過程中可利用內生真菌提高其成活率、酶活性和產量。

1.2 藥用植物內生菌可用于生物防治

植物病害是引起農作物品質下降、產量損失的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計大約80%的植物病害是由植物病原真菌引起的［24］。長期以來，植物真菌病害的防治主要以化學方法為主，而化學農藥存在諸多弊端，如農藥殘留帶來環(huán)境污染、危害人畜健康以及長期使用造成病原菌的耐藥等問題。因此，尋找綠色、有效、可替代的產品用于植物病害防治成為農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關鍵問題［25］。

藥用植物內生菌作為一類可持續(xù)利用的微生物資源，一方面可以提高植物的抗生物脅迫性［26，27］，另一方面能夠代謝產生結構豐富、新穎的具有抗植物病原菌活性的代謝成分［28］，為防治植物病蟲害提供了極大的可行性。藥用植物內生菌用于防治植物病害已有諸多成功案例。許多研究表明，植物內生真菌的發(fā)酵液大多具有抗植物病原真菌活性［29，30］，并從中分離出許多活性物質［24］。Lu等［31］從黃花蒿內生真菌Colletotrichumsp.中分離鑒定的新活性代謝物ergosterol對小麥全蝕病、紋枯病、根腐病和疫霉病致病真菌具有有效的抑制作用。Li等［32］從雷公藤莖皮中分離得到的內生真菌Cryptosporiopsiscf.quercina可以代謝產生獨特的tetramic acid衍生物cryptocin，具有抗稻瘟病病原菌等多種植物病原真菌活性，但對人類病原真菌無活性。Xu等［28］從三七內生真菌Preussia isomeraXL－1326中分離得到一對新穎的降倍半萜（＋）和（－）preuisolactone A，具有顯著的抗菌活性。Yang等［33］從蛇足石杉內生真菌Bionectriasp.Y1085中分離得到一系列具有顯著抗菌活性的新穎代謝物。Wu等［34］從桑黃內生真菌Alternaria alternataShm－1分離得到一個新的2H－benzindazole混合物，具有中等抗C.michiganense活性。本課題組近些年針對山東省野生藥用植物資源和多年道地產區(qū)家種藥用植物資源內生菌開展了一系列研究，從泰山、徂徠山、沂蒙山等地采集野生藥用植物資源50余種，生長環(huán)境遍及不同地形、海拔、氣候等；同時從臨沂、濟南、泰安、淄博等山東省傳統(tǒng)道地藥材產區(qū)采集種植藥材丹參、黃芩、金銀花等藥用植物10余種，從中分離內生真菌200余株，以小麥赤霉病病原菌禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）作為指示菌，采用平板對峙法和紙片擴散法分別對內生菌及其代謝產物進行了抗菌活性篩選，從中得到10株具有抗小麥赤霉病菌活性內生菌，相關研究仍在開展中。由此可見，將藥用植物內生菌用于生物防治可為開發(fā)綠色農藥提供新的資源并且潛力巨大。

1.3 運用植物內生菌開發(fā)微生物肥料，進行土壤修復及改良

在農業(yè)生產活動中，由于土地長時間連續(xù)耕作，往往面臨營養(yǎng)貧瘠或連作障礙等問題，進而影響作物長勢、產量和質量。另外，隨著工業(yè)化的發(fā)展，生活垃圾廢水的排放，以及農藥化肥的使用，各種各樣的污染物如有機污染物、重金屬等排放到土壤中，給土壤帶來嚴重壓力。一方面造成土壤肥力退化、病害加重等，另一方面土壤污染日益嚴重，危及植物生長及人類發(fā)展，因此改善土壤質量、修復土壤污染成為農業(yè)生產生活不得不面臨的嚴峻問題。微生物菌肥作為一種可持續(xù)利用資源，越來越受到人們的青睞，在改善土壤成分、提高肥力、促進植物生長方面潛力巨大。

王夏等［35］研究內生菌肥料對設施西瓜生長的影響，以西瓜品種‘小蘭’為試材，采用苗期澆灌內生真菌菌劑和設施大棚內減少化肥用量配施微生物肥的方法進行試驗，結果表明，內生菌劑處理（5 g／L）對西瓜幼苗有一定的促生作用，可增加根長、株高、葉面積等，同時可有效降低枯萎病的發(fā)生，提高幼苗的生物量、西瓜產量和品質。郎宸用［36］以龍高L2玉米品種和野生植物根系內生菌鏈格孢菌（Alternaria alternata）為材料，通過連續(xù)3年大田試驗，研究了內生菌提取物對玉米生長的影響，綜合比較發(fā)現(xiàn)，植物內生菌提取物可以顯著影響玉米的生長發(fā)育，提高了成熟期玉米的百粒重、穗粒數(shù)和穗粒重，進而提高玉米產量。

土壤污染可簡單劃分為重金屬污染、有機物污染，或兩者復合污染等［37］。近些年，研究者發(fā)現(xiàn)植物內生菌具有改變植物攝取污染物或酶促降解污染物的能力，當微生物與植物聯(lián)合時，植物可為微生物提供棲息地，而微生物也能通過增強植物的耐受性及降解污染物改善其生長環(huán)境，這種方法被認為是一種新型、有前景的生物修復方法［37］。

目前研究人員從多種植物中分離到具有修復土壤重金屬污染的內生菌，如芥菜、蜈蚣草、商路、大豆、油菜等［37］。蘆葦通常被用于處理廢水或滲濾液，Sim等［38］從蘆葦中首次分離得到一系列內生真菌，并對其對各種重金屬的耐受性和生物吸附潛力進行了篩選，結果表明，21株內生菌均表現(xiàn)出重金屬耐受性（包括Cd2＋、Cu2＋、Cr2＋、Pb2＋、Zn2＋等），其中以Trichoderma asperellumIso11，Phomopsissp.Iso9 andSaccharicola bicolourIso22三株菌耐受力最強；進一步研究表明，與Phomopsissp.Iso9和S.bicolourIso22相比，T.asperellumIso11對各種重金屬均表現(xiàn)出較好的耐受性和適應性，對金屬的適應濃度高達2 000 mg／L；三種內生菌在單金屬溶液中均具有去除效果，在多金屬溶液中，T.asperellumIso11和S.bicolourIso22對Cu2＋的吸附親和力較高，其次是Cr3＋和Pb2＋，而Phomopsissp.Iso9對重金屬的親和性順序為Cu2＋＞Pb2＋＞Cr3＋。多環(huán)芳烴是一類具有毒性的環(huán)境污染物，由于人類活動在環(huán)境中大量累積。Dai等［39］為了探索更多具有多環(huán)芳烴生物修復功能的內生菌資源，以菲作為模型化合物，從4種大戟科植物中分離到9株內生真菌，并對其菲降解進行了篩選，其中分離自重陽木（Bischofia polycarpam）的內生真菌Ceratobasidum stevensiistrain B6具有較高的降解效率，在該內生真菌培養(yǎng)過程中加入100 mg／L菲，培養(yǎng)10天后大約89.51%的菲被消除。

以上研究充分表明，植物內生菌以微生物菌肥的方式作為一種綠色環(huán)保、可持續(xù)利用的資源，在改善土壤質量、修復土壤污染方面具有廣闊前景。

1.4 內生菌能夠提高植物抗逆性

植物的抗逆性是指植物具有的抵抗外界不利環(huán)境的某些性狀，如抗旱、抗寒、抗鹽、抗病蟲害等，這些不利環(huán)境因素又可分為非生物脅迫（高溫、干早、高鹽堿等）和生物脅迫（病原菌、昆蟲、食草動物等）。一系列研究表明，內生菌與宿主長期生長進化過程中，能有效促進植物對生物脅迫和非生物脅迫的耐受，形成一定抗逆性，增強其適應性，這種適應性的增強包括對食草性哺乳動物和昆蟲、病原菌和線蟲等的抵抗力，以及宿主的耐旱性和競爭力等［26，27］。借此可將其運用于農業(yè)生產以提高作物對干旱或鹽堿地等惡劣環(huán)境的適應。

自然生態(tài)系統(tǒng)中的所有植物都被認為與菌根真菌和／或內生真菌共生。經(jīng)過4億多年的進化，一些植物仍然不能依靠自身而需要通過其內生真菌提高耐脅迫性，通過對高脅迫生境中植物內生菌的分析，發(fā)現(xiàn)至少有一些內生真菌賦予其寄主植物對特殊生境的耐受性，離開了這些內生菌，宿主植物無法在原生棲息地生存［40］。如受內生菌感染的冷季禾本科植物可逐漸適應外界環(huán)境（干旱和礦物質缺乏）的脅迫［41］。

Redman等［42］研究表明，生長于美國黃石公園的植物Dichanthelium lanugunasum只有在與其優(yōu)勢彎孢屬內生真菌Curvularia protuberata共生的情況下才能適應38℃的地熱高溫環(huán)境，而單獨培養(yǎng)條件下宿主植物Dichanthelium lanugunasum則無法存活。王貴生等［43］研究發(fā)現(xiàn)分離自亳菊的1株柄孢殼菌屬（Zopfiellasp.）內生菌BJF10對玉米彎孢菌、黃瓜枯萎菌、小麥赤霉菌、茶葉輪斑菌均具有拮抗作用和降解纖維素、抗氧化等生物活性。Rodriguez等［44］證明來自沿海和地熱生境的原生植物分別需要借助共生真菌來耐受鹽和熱環(huán)境，而在沒有鹽或熱脅迫的生境中，從植物分離得到的同一種內生真菌卻不具有這些脅迫耐受能力；源自農作物的內生真菌具有抗病性，卻不具有耐鹽性或耐熱性；研究者分別將農作物、沿海植物和地熱植物中的內生菌在番茄上定植，最終分別獲取了抗病性、耐鹽性和耐熱性能；此外，沿海植物內生菌在水稻上定植則賦予了水稻耐鹽性；不管被定植植物原始棲息地在何處，耐旱脅迫環(huán)境下植物內生菌也會賦予其耐旱能力，這種內生真菌賦予植物抗逆性的能力或許為減輕全球氣候變化對農業(yè)和原生植物群落的影響提供一種新的策略。

自然界中某種植物出現(xiàn)的優(yōu)良抗逆性狀，因為不同物種間存在的生殖隔離，在自然條件下很難轉移到其他種類的植物上，而通過植物內生菌的這種“促抗作用”作為媒介或許能為解決這一難題提供方案。植物內生菌進入宿主植物后，能脅迫宿主植物開啟植物抗逆有關的基因，增強這些基因的表達，提高與抗逆有關的酶活性，從而增強宿主植物的抗逆性［20］。另一方面，植物內生菌也可通過產生抗生素、水解酶、植物生長調節(jié)劑等成分，增強宿主的抵抗力以及誘導其產生系統(tǒng)抗性［45，46］。藥用植物生長環(huán)境多樣，野生棲息地一般營養(yǎng)貧瘠或氣候惡劣，這種特殊環(huán)境往往也塑造了其內生菌的特殊性以及對脅迫環(huán)境的適應性，因此運用藥用植物內生菌資源研究植物的抗逆性具有不可替代的優(yōu)勢。

1.5 運用內生菌資源對植物遺傳育種進行改良

傳統(tǒng)植物育種的方法是以自然突變和有性雜交為基礎，而由于物種間存在生殖隔離，具有一定局限性，隨著基因工程研究的發(fā)展，運用分子生物學技術對植物基因進行編輯等為植物遺傳育種開辟了更廣闊的空間［47］。藥用植物內生菌與宿主植物長期協(xié)同進化過程中，逐漸形成了特有的基因特征、生態(tài)特性，發(fā)掘這些功能基因并加以應用將為植物遺傳育種開辟新途徑。此外，由于微生物基因組相對較小，遺傳操作相對容易，可為通過分子生物學手段進行遺傳改良提供先天條件；引入內生菌資源與植物聯(lián)合培育在改良植物品種、植物表型方面也發(fā)揮著重要作用。

小麥赤霉病是世界范圍內極具毀滅性且防治困難的真菌病害，培育與利用抗病品種是首要選擇。Wang等［48］首次從小麥近緣植物長穗偃麥草中克隆出抗赤霉病基因Fhb7，研究表明Fhb7是通過水平基因轉移從內生真菌轉入植物，該研究為解決小麥赤霉病世界性難題找到了“金鑰匙”。郜庭等［49，50］運用分子生物學和植物細胞工程等技術，從優(yōu)良濕地植物中挖掘內生菌資源，并解析其中功能內生菌的金屬耐受性及促生機制，隨后進一步將功能內生菌的利用拓展至濕地植物育種方向，為濕地植物品種改良提供了新思路。

1.6 運用內生菌開發(fā)微生物源綠色防腐保鮮劑或食品添加劑

農產品及食品在長時間貯藏過程中容易因發(fā)生氧化或細菌、真菌等的污染而導致腐敗變質，前者可以通過添加具有抗氧化活性物質來延長其保質期，后者則可以通過添加具有抗菌活性物質作為食品添加劑改善和延長保質期。研究發(fā)現(xiàn)一些藥用植物內生菌可以代謝產生許多具有抗氧化活性和抗菌活性的物質，將其進一步開發(fā)運用于微生物源綠色防腐保鮮劑或食品添加劑具有巨大潛力，尤其一些具有類似于益生菌作用的藥用植物內生菌，在食品加工與保藏方面更是前景廣闊。

p－酪醇是一種天然抗氧化劑，是所有紅景天屬植物的主要生物活性成分。紅景天是一種稀有瀕危高山植物，被廣泛用作食品和藥物添加劑，其主要有效成分就包括p－酪醇，具有抗高原反應、抗衰老、保護細胞免受氧化傷害等藥理活性。Cui等［51］研究分離自紅景天植物的內生真菌Phialocephala fortiniiRac56，其發(fā)酵產物經(jīng)UPLC／QTOF-MS和1H-NMR分析發(fā)現(xiàn)，該內生菌也能夠代謝產生p－酪醇，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化產量可達2.002 mg／mL。這一研究結果為通過內生菌發(fā)酵獲取該天然抗氧化劑提供了新途徑。劉雅莉等［52］從蒺藜內生真菌中篩選得到一株抗氧化活性較好的菌株JL13，其發(fā)酵產物具有較強的清除DPPH·自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的能力，EC50依次為149.67、439.91、514.77μg／mL，結果表明蒺藜內生真菌具有較好的抗氧化潛力和一定的開發(fā)利用價值。張新國等［53］從藥用植物烏頭、唐松草、獨活、車前草、薄荷、澤瀉中分離得到43株內生真菌和18株放線菌；抗氧化活性篩選顯示6株內生真菌具有較好的抗氧化活性，對·OH自由基清除率≥70%，其中1株鏈格孢菌屬Alternariasp.DHL－10發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對過氧化氫的IC50為0.26 mg／mL，顯示了較強的抗氧化活性，總酚和總黃酮含量分別達到（0.81±0.05）mg／g和（0.84±0.05）mg／g。這一研究結果為從藥用植物內生菌中發(fā)現(xiàn)抗氧化活性物質提供了資源。本課題組采用DPPH·自由基清除試驗評價200余株藥用植物資源內生菌抗氧化活性，其中代謝產物具有抗氧化活性菌株近40株，比例達20%。由此可見，從藥用植物內生菌中篩選并開發(fā)微生物源綠色防腐保鮮劑或食品添加劑具有巨大潛力。

除此之外，在農業(yè)生產生活中，藥用植物內生菌資源還可用來開發(fā)動物飼料或添加劑，或是開發(fā)獸藥，用于防治動物致病菌和動物防疫抗生素的研發(fā)，以及運用內生菌進行黃曲霉素防控、農用地膜降解等。由此可見，藥用植物內生菌資源在農業(yè)生產生活中的研究與應用非常廣泛并且具有廣闊前景。

2 總結與展望

我國地域廣闊，藥用植物資源極其豐富，植物種類和地域差異等因素使得其中孕育了更為多樣的內生菌資源，是一個亟待開發(fā)的巨大寶庫。隨著微生物組學、基因組學和合成生物學等新興技術的興起，內生菌研究也得到越來越多的關注，并積累了大量的菌種資源。

關于藥用植物內生菌方面的研究仍存在一些問題：理論研究較多，產業(yè)化水平較低，仍需下大力氣，結合農業(yè)生產生活需求，促進內生菌理論成果的應用轉化；藥用植物內生菌的研究主要以活性次生代謝產物篩選鑒定居多，其他方面研究仍相對欠缺，如可用于作物育種的功能基因發(fā)掘和農業(yè)生產功能酶的開發(fā)等；內生菌與植物之間存在著密切關系，兩者間的互作關系方面研究仍相對薄弱，內生菌在植物生長過程中扮演著重要角色，而這一角色如何發(fā)揮作用即藥用植物內生菌的微生態(tài)效應值得開拓；隨著組學時代的到來，傳統(tǒng)內生菌研究主要圍繞單一菌株展開，下一步可結合組學技術開展藥用植物內生微生物組方面研究以進一步揭示內生菌與植物之間的密切聯(lián)系等。

隨著生產和生活水平的提高，人們對農業(yè)生產全鏈條、生活食品全過程的品質追求越來越高。藥用植物內生菌種類豐富、活性廣泛，同時具有生長迅速、循環(huán)持續(xù)、綠色生態(tài)等一系列優(yōu)勢，合理有效開發(fā)并利用藥用植物內生菌資源不僅在農業(yè)科學研究方面具有重要的理論意義，而且在農業(yè)生產和生活中具有廣闊的應用價值。