柞蠶雄蛾濃縮液改善高脂飲食誘導的小鼠非酒精性脂肪肝

朱琳，郭光，范作卿，王娜，施新琴，吳建軍

（1.山東省蠶業研究所，山東 煙臺 264002；2.寧陽縣農業農村局，山東 寧陽 271400）

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精外的其他因素導致的肝臟彌漫性脂肪浸潤。隨著經濟水平的提高及人們生活方式的改變，NAFLD的發病率逐漸增高，引起社會廣泛關注。已有諸多研究表明，脂肪性肝炎可進展為肝纖維化、肝硬化并可能最終形成肝衰竭，同時NAFLD還會促進胰島素抵抗、糖尿病、病毒性肝炎、代謝性綜合征和動脈粥樣硬化等疾病的發生與發展［1］。目前國內外學者大多認同NAFLD的發病機理為“二次打擊”理論。其中，“首次打擊”為高脂飲食影響脂質代謝，游離脂肪酸（FFA）不斷增多，導致肝臟線粒體氧化超載，同時高胰島素又使得糖酵解增加促進脂肪酸的合成，最終導致甘油三酯（TG）在肝臟中堆積，引起呈良性的肝內脂肪堆積（單純性脂肪肝）。“第二次打擊”主要是在此基礎上發生的氧化應激和炎癥細胞因子的異常。丙二醛（MDA）、4－羥基壬酸等脂質過氧化物增多，結果促進肝細胞酶的活性并抑制線粒體的功能；庫普弗（Kupffer）細胞激活，細胞因子比如TNF－α、IL－6等的參與，導致肝星狀細胞激活、增殖，進而導致肝臟炎癥，炎癥持續存在并造成肝細胞壞死形成進展性肝纖維化，并最終導致肝硬化和肝癌［2］。其他如激素、環境、遺傳、免疫反應、持續輕微的內毒素血癥、缺氧和肝微循環障礙等也參與了此病的形成，說明其有多環節、多因素的發病特點。

柞蠶蛾（Antheraea pernyiGuerrin-Meneville）屬于節肢動物門昆蟲綱鱗翅目天蠶蛾科柞蠶屬，是一種在我國具有悠久養殖歷史的藥食兩用經濟昆蟲，屬完全變態昆蟲。柞蠶雄蛾歷史上曾作為貢品，有“神蟲國寶”之美譽，其功效在《本草綱目》早有記載：“雄原蠶蛾益精氣，強陰道，交接不倦，亦壯陽事，止泄精、尿血、暖水臟，治暴風、金瘡、凍瘡、湯火瘡，滅瘢痕”［3］。柞蠶雄蛾營養物質豐富，干物質中含粗蛋白40.49%且氨基酸種類齊全、比例適當，高于世界衛生組織和聯合國糧農組織（WHO／FAO）推薦的蛋白質氨基酸記分模式；脂肪酸含量中不飽和脂肪酸占78.6%，必需脂肪酸占43.0%，超過了《食物成分表》中任何一種動物的脂肪酸含量；還含有豐富的礦物質、微量元素、維生素和激素等其他活性物質［4］。我國柞蠶資源豐富，近年來對柞蠶雄蛾的綜合加工利用已引起人們的高度重視，現已開發出一些食品、保健品和醫藥品，取得較大的經濟效益和社會效益。為了確保柞蠶雄蛾的食用及藥用安全性，有研究以昆明小鼠為實驗動物，檢測柞蠶雄蛾粉的急性毒性和致突變性，結果表明其對昆明小鼠無急性毒性、無致突變性和無致畸性［5］。柞蠶雄蛾濃縮液是本研究團隊選用初羽化、未交尾的柞蠶雄蛾為原料，經乙醇浸泡后低溫減壓抽提得到的具有生物活性的保健產品［6］，對其部分營養成分及食品衛生指標的測定結果表明：18種游離氨基酸總量為11.34 g／L，其中人體必需氨基酸含量達3.29 g／L，占總量的29%；脂肪含量為0.09%；維生素A、E、B1、B2及8種礦質元素含量也很豐富［7］；通過紫外分光光度法初步確定其中含有一些激素類成分如睪丸酮和蛻皮激素［8，9］。

目前國內外對柞蠶雄蛾產品的功能成分、功效及其作用機理的研究甚少，并且大部分研究還停留在表面。柞蠶雄蛾濃縮液對NAFLD的作用研究也尚未見報道。因此，本團隊基于以前的研究基礎，通過小鼠試驗，研究柞蠶雄蛾濃縮液對高脂誘導的小鼠NAFLD的防治作用，以期為柞蠶的綜合開發利用提供理論依據，并為開發預防和治療NAFLD的產品做探索性研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

柞蠶雄蛾濃縮液，由山東省蠶業研究所2019年提取制備；雄性C57BL／6J小鼠，每只18～20 g，購自濟南金豐實驗動物有限公司；辛伐他汀購自Sigma公司；四氯化碳（CCl4）、無水乙醇、甲醛等試劑均購自生工生物工程（上海）有限公司。

H2200R冷凍離心機，購自長沙湘儀離心機儀器有限公司；HM325輪轉式切片機，購自賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；博視達拍照顯微鏡，購自深圳市博視達光學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物實驗 先將小鼠隨機分為2組，其中空白對照組（A組）5只，飼喂正常飼料；造模組33只，飼喂高脂飼料并注射5% CCl4，劑量為0.01 mL／g，每周兩次。三周后，挑選3只模型組小鼠，取肝臟做組織切片，HE染色，根據肝臟病變情況判斷是否造模成功。

造模成功后，將造模組小鼠重新分配，隨機分為3組，每組10只，B組為模型組，C組為柞蠶雄蛾濃縮液處理組，D組為陽性對照組。A、B兩組灌胃生理鹽水，C組灌胃0.8 g／mL柞蠶雄蛾濃縮液，D組灌胃2 mg／mL辛伐他汀溶液，灌胃劑量為0.01 mL／g，每日灌胃1次，連續30 d。每隔3天測量一次小鼠體重，繪制體重曲線。試驗結束前小鼠禁食禁水8 h以上，之后摘眼球取血，然后斷頸處死，解剖取肝臟和脂肪組織并對其進行稱重，計算器體比。器體比又稱臟器系數，是實驗動物某臟器的重量與其體重之比。

1.2.2 血脂四項的測定 血漿靜置1 h后，4 000 r／min離心5 min，取血清，檢測血脂四項，即總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL－C）和低密度脂蛋白（LDL－C）。

1.2.3 組織學分析 摘取肝臟和脂肪組織，以純凈水洗去血污，4%福爾馬林固定，HE（蘇木精－伊紅）染色，石蠟包埋切片，在顯微鏡下進行病理組織學觀察、拍照，分析肝臟炎癥及損傷情況。

1.3 數據分析

每組數據至少3個重復，所有數據處理及方差分析均采用Origin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 柞蠶雄蛾濃縮液對小鼠體重增長的影響

柞蠶雄蛾濃縮液處理組與陽性對照組小鼠的體重差異較小，變化趨勢基本一致，但均顯著低于模型組和空白對照組；模型組小鼠的體重在處理前9天內低于空白對照組，但9天后明顯高于空白對照組（圖1）。

圖1 小鼠體重變化曲線

2.2 柞蠶雄蛾濃縮液對小鼠肝臟及脂肪組織增長的影響

由圖2可見，柞蠶雄蛾濃縮液處理組的肝臟質量／體重值為0.032，低于其它處理組，但處理間差異不顯著；濃縮液處理組的脂肪質量／體重值為0.014，略高于空白對照組，但低于陽性對照組和模型組，且與模型組（0.027）差異極顯著（P＜0.01）。

圖2 小鼠肝臟（a）和脂肪（b）器體比

2.3 柞蠶雄蛾濃縮液對小鼠血清中血脂四項的影響

由圖3可見，柞蠶雄蛾濃縮液處理組的TC水平最低，顯著低于模型組和陽性對照組（P＜0.05），與空白對照組差異不顯著。柞蠶雄蛾濃縮液處理組的TG水平低于模型組和陽性對照組，但差異不顯著；三者TG水平均顯著高于空白對照組。在HDL－C水平上，柞蠶雄蛾濃溶液處理組最低，其次為陽性對照組、模型組、空白對照組，但四組處理間差異不顯著。柞蠶雄蛾濃溶液處理組的LDL－C水平最低，與空白對照組差異不顯著，但顯著低于模型組和陽性對照組。

圖3 小鼠血脂四項測定結果比較

2.4 柞蠶雄蛾濃縮液對小鼠肝臟及脂肪組織的病理學影響

如圖4所示，空白對照組小鼠肝臟細胞排列緊密，細胞形態完整，無脂肪滴，無炎癥反應；模型組小鼠肝臟細胞排列松散無序，部分細胞核破損，多處出現脂肪顆粒；柞蠶雄蛾濃縮液處理組細胞排列有序，形態完整，無脂肪滴，無炎癥反應；陽性對照組細胞排列有序，形態完整，無脂肪滴，少數細胞出現空泡現象。

圖4 肝臟HE染色（400×）

如圖5所示，模型組脂肪細胞明顯大于其它三組；柞蠶雄蛾濃縮液處理組和陽性對照組的脂肪細胞直徑相差不多，但比空白對照組稍大。

圖5 脂肪HE染色（400×）

3 討論與結論

本團隊前期對柞蠶雄蛾濃縮液的保健功能做了初步研究，表明其可明顯降低四氯化碳中毒小鼠的肝細胞變性、壞死程度和范圍，對受損肝組織具有明顯保護作用，對于高脂血癥有良好的治療效果［10］；Li等［11］研究證明柞蠶雄蛾濃縮液的有效成分對小鼠細胞免疫和體液免疫均具有明顯增強作用，對單核吞噬細胞系統功能也有一定增高趨勢，并且還具有一定的抗腫瘤作用［12］。此外，柞蠶雄蛾濃縮液對酒精性脂肪肝也被證明有一定的預防作用，能抵抗因飲用酒精而導致的肝細胞線粒體脂質過氧化，對乙醇誘導的肝脂肪變性有一定保護作用［13］；賈青等進一步探明柞蠶雄蛾濃縮液能夠降低小鼠早期酒精性肝病Kupffer細胞Toll樣受體4及肝組織中TNF－α的表達［14］。另外，柞蠶雄蛾濃縮液對酒精誘導的小鼠肝纖維化也具有顯著的預防作用，其機制可能與調控TGFβ1／Smad2／3信號轉導通路、下調TIMP及抑制CTGF的活化與增殖有關［15］。

本研究結果表明，其能夠降低高脂誘導的NAFLD小鼠體重、肝臟質量／體重和脂肪質量／體重的值，說明其能夠減少小鼠體內的脂肪堆積。HE染色結果表明，其能夠明顯減少肝臟炎癥反應和脂肪化及改善脂肪在體內的堆積。本研究結果可為利用柞蠶開發預防和治療NAFLD的產品提供參考。