血清NLRP3蛋白水平對成人癲癇患者短期內再發風險的預測價值

劉睿，郭翀，彭江濤，胡忠波，郭科，張鑫帆，吳淑華，李建民

(1.濱州醫學院附屬醫院 神經外科，濱州 256603；2.濱州醫學院附屬醫院 病理科，濱州 256603)

癲癇是最常見的中樞神經系統疾病之一，表現為慢性反復發作性短暫腦功能失調。約三分之一的癲癇患者對傳統抗癲癇藥物產生耐藥，嚴重和控制不良的癲癇患者會出現叢集性發作并在短期內再發，增加患者軀體及腦損傷的風險，并導致其沉重的醫療負擔[1]。識別短期內癲癇再發患者，及時提供干預，可以幫助他們改善病情[2]。然而，臨床上目前尚無有效的生物學標志物可用于短期內癲癇再發人群的預估。癲癇的發病機制復雜，新近研究表明，多種炎癥介質在癲癇的發生發展過程中發揮關鍵作用[3]。其中，NOD樣受體家族含pyrin結構域蛋白3(NOD-like receptor family pyrin domain-containing protein 3， NLRP3)炎癥小體的作用引起了人們的關注。NLRP3炎癥小體主要由NLRP3蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和磷酸化的Caspase-1前體組成[4]。NLRP3炎癥小體是免疫炎癥反應的重要組成部分，通過激活炎癥相關通路，促進炎癥反應的級聯放大。NLRP3炎癥小體及其下游炎癥介質活化的Caspase-1和IL-18在腦缺血再灌注損傷、阿爾茲海默病等神經系統疾病中均有明顯的促炎作用。最新研究表明，NLRP3炎癥小體在急性癲癇模型中表達水平升高[5]。本課題組的前期研究也證明，慢性癲癇大鼠腦組織中NLRP3蛋白、Caspase-1和IL-18表達水平升高，抑制其表達可以降低癲癇發作強度，起到神經保護作用[6]。但NLRP3水平與短期內癲癇再發的關系尚未見明確報道。本研究通過分析成人癲癇患者外周血中NLRP3水平與短期內癲癇再發的關系，探究NLRP3水平對短期內疾病再發的預測價值，以期為臨床提早識別及防治癲癇發作提供可能的生物標志物。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2018年9月—2019年8月濱州醫學院附屬醫院收治的成人全面強直-陣攣性癲癇發作患者61例。其中，男性35例，女性26例，年齡(57.56±13.06)歲。入選標準：(1)年齡18周歲以上，于癲癇發作24 h內就診。(2)根據家屬描述，患者發病年齡21～83歲，發病時出現發作性意識喪失，伴四肢強直-陣攣性發作，結合既往癲癇發作史及入院后影像學和腦電圖檢查，所有患者病情均符合2017年國際抗癲癇聯盟制定的《癲癇診治指南》中相關診斷標準[7]，均為癲癇全面強直-陣攣性發作。(3)排除癲癇發作前有嚴重心、肺、肝、腎功能障礙等疾病的患者及拒絕參加研究者，不能配合完成隨訪者。(4)入院患者均為急性發作入院，非叢集性發作癲癇患者給予口服丙戊酸鈉或卡馬西平治療[丙戊酸鈉服用劑量為0.2 g/次，3次/d；卡馬西平0.1 g/次，3次/d；觀察期間(7 d內)持續服藥]。叢集性發作癲癇患者給予苯巴比妥鈉注射治療(苯巴比妥鈉注射液100 mg，肌注，早晚各1次，連續治療2 d；后改為1次/晚，連續治療3 d后停用)，同時給予口服或鼻飼丙戊酸鈉(0.2 g/次，3次/d)或卡馬西平(0.1 g/次，3次/d)[觀察期間(7 d內)持續服藥]。研究均獲得受試者或其家屬知情同意，本研究獲得濱州醫學院附屬醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 一般資料的采集 詳細記錄入選患者臨床資料，包括性別、年齡、實驗室檢查結果[NLRP3水平、血糖、血鈣、血鎂、白細胞(white blood cell， WBC)計數、膽固醇、尿酸]和癲癇分型(叢集性發作或短期內癲癇再發)。

1.2.2 叢集性發作及短期內癲癇再發作的判定 根據臨床癥狀、腦電圖及影像學檢查結果，患者24 h內發作1次為非叢集性發作；24 h內發作≥2次為叢集性發作[8]。所有患者均經住院觀察或門診隨訪7 d，第1次癲癇發作后7 d內再次發作判定為短期內癲癇再發。

1.2.3 患者血清NLRP3蛋白水平的檢測 入院后采集患者空腹靜脈血5 mL，以1 500×g離心10 min后分離上清液，ELISA檢測血清樣本中NLRP3蛋白水平。具體為向包被鼠抗人NLRP3單抗的微孔中依次加入患者血清，再與兔抗人/小鼠NLRP3-HRP抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經徹底漂洗后加入底物3，3＇，5，5＇-四甲基聯苯胺(3，3＇，5，5＇-tetramethylbenzidine， TMB)顯色。用酶標儀檢測光密度D(450 nm)值，通過標準曲線計算樣本中NLRP3蛋白濃度(上述所用人NLRP3 ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司)。

2 結果

2.1 成人癲癇患者再發組與未再發組一般資料、實驗室檢查結果及NLRP3水平比較61例成人癲癇患者中，叢集性發作者30例，非叢集性發作者31例；隨訪7 d，有13例癲癇患者再次發作，其中叢集性發作者10例(76.92%)，非叢集性發作者3例(23.08%)；再發組與未再發組癲癇患者比較，性別、血糖、血鈣、血鎂、WBC計數、膽固醇和尿酸等指標比較差異無統計學意義(均P>0.05)；2組之間叢集性發作率、年齡、NLRP3炎癥小體水平的差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01，P<0.05，表1)。

表1 成人癲癇患者短期再發組與未再發組一般資料、實驗室檢查結果及NLRP3炎性小體水平比較

2.2 叢集性與非叢集性發作癲癇患者NLRP3水平及疾病短期再發率的比較叢集性發作癲癇患者NLRP3水平、癲癇短期再發率均顯著高于非叢集性發作癲癇患者(均P<0.05，表2)。

表2 叢集性與非叢集性發作癲癇患者NLRP3水平及疾病短期再發率的比較

2.3 成人癲癇后短期內再發影響因素的多因素Logistic回歸分析以成人癲癇后短期內再發情況為因變量，上述具有統計學差異的相關指標(年齡、叢集性發作率、NLRP3水平)為自變量，進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示，血清NLRP3水平及年齡是成人短期內(≤7 d)癲癇再發作的獨立危險因素(OR值分別為1.104、0.925,95%CI1.021～1.193、0.871～0.982,均P<0.05, 表3)。

表3 患者短期內癲癇再發影響因素的多因素Logistic回歸分析

2.4 NLRP3水平預測成人癲癇患者短期內再發的價值NLRP3水平預測成人癲癇后短期內再發的AUC為0.769，95%CI0.608～0.931，截止值91.47 μg/L，敏感度84.6%，特異度64.6%；NLRP3水平預測非叢集性癲癇患者短期內再發的AUC為0.929，95%CI0.827～1.031，截止值94.62 μg/L，敏感度100.0%，特異度85.7%；NLRP3水平預測叢集性癲癇患者短期內再發的AUC為0.675，95%CI0.448～0.902，截止值98.85 μg/L，敏感度60.0%，特異度25.0%。詳見圖1。

注：A. NLRP3炎癥小體水平預測總體癲癇患者短期內再發的ROC曲線；B. NLRP3炎癥小體水平預測非叢集性癲癇患者短期內再發的ROC曲線；C. NLRP3炎癥小體水平預測叢集性癲癇患者短期內再發的ROC曲線。圖1 NLRP3炎癥小體水平預測成人癲癇患者短期內再發的ROC曲線

3 討論

癲癇是一種多危險因素并具強烈遺傳傾向的復雜病癥[9]，大約每27人中就有1人在一生中的某個時候癲癇發作。癲癇患者過早死亡的風險很大，多達三分之一的過早死亡直接(如癲癇持續狀態、癲癇所致腦損傷、癲癇所致猝死)或間接(如吸入性肺炎、自殺、溺水)與癲癇相關[10]，然而近乎一半的癲癇患者在目前的治療方案下病情沒能得到充分緩解[11]。一旦首次發作，癲癇將會對患者產生巨大的心理和生理影響。所以在初發后，迫切需要對患者病情進行適當的評估和干預。但在一般人群中，癲癇治療后的復發率差異很大。有文獻證明，局灶性發作、夜間發作、腦損傷既往史、癲癇家族史、神經系統檢查異常、腦電圖癲癇樣放電和神經影像學異常都預示著癲癇再發風險的增加[12-13]。然而，對成人癲癇患者短期內(≤7 d)再發風險生物學標志物的探尋尚未見明確報道。

癲癇的發病機制復雜，越來越多的證據表明，腦內的炎癥反應過程可能是導致癲癇病理生理變化的1個重要機制[14-15]。炎癥介質可以通過激活特異性信號轉導通路受體如N-甲基-D-天冬氨酸受體和TLR而觸發神經元過度興奮，最終導致癲癇發作及再發的可能性增加[16]。NLRP3炎癥小體是目前研究的熱點，它是免疫炎癥反應的重要組成部分，能識別內源性危險信號并激活Caspase-1，繼而活化IL-1β等細胞因子，參與諸多慢性疾病的非感染性炎癥反應過程[17]。有研究證實，中樞神經系統中NLRP3主要定位于小膠質細胞，其被激活后形成NLRP3炎癥復合體，觸發和促進炎癥反應過程并誘導程序性細胞死亡。癲癇發作又加重了血腦屏障的損傷，促進了腦部炎癥反應，星形膠質細胞和小膠質細胞被激活，釋放炎性細胞因子如IL-1β，進一步降低癲癇發作閾值，進而導致大腦的興奮性增加和癲癇的反復發作[18-19]。因此，作者推測NLRP3炎癥小體可能對短期內癲癇再發風險具有預測價值。而本研究結果也證實，成人短期內癲癇再發組血清NLRP3水平較非再發組顯著升高(P<0.05)；多因素Logistic回歸分析也顯示，NLRP3水平是成人癲癇患者短期內再發的獨立危險因素。它預測成人癲癇后短期內再發的AUC為0.769，95%CI0.608～0.931，截止值91.47 μg/L，敏感度84.6%，特異度64.6%。上述結果說明，NLRP3水平可以較好地預測成人短期內癲癇再發風險。

癲癇叢集性發作的定義為24 h內癲癇發作≥2次，患有未經治療的叢集性癲癇的患者生活質量明顯下降，癲癇持續狀態、急診和住院風險更大，其癲癇再發率也更高[20]。本研究也證實，叢集性發作癲癇患者血清NLRP3水平[(95.66±13.76) μg/L]、短期再發率(33.33%)均顯著高于非叢集性發作癲癇患者[(87.85±7.90) μg/L、再發率9.68%](均P<0.05)，這說明叢集性發作的患者體內炎癥反應水平升高，導致短期內再發的可能性顯著增加(均P<0.05)。然而，多因素Logistic回歸分析顯示叢集性發作不是成人癲癇患者短期內再發的獨立危險因素，而且NLRP3水平預測非叢集性癲癇后短期內再發的AUC為0.929，預測叢集性癲癇后短期內再發的AUC為0.675。作者推測這可能與病例數相對較少，且叢集性癲癇發作患者入院時病情相對較重有關。此外，應用長效抗癲癇藥物苯巴比妥鈉對后續疾病發作有所影響，從而影響NLRP3預測癲癇后短期內再發的精確性。

另外，研究顯示癲癇再發組年齡小于癲癇非再發組，多因素Logistic回歸分析也顯示年齡是成人癲癇患者短期內再發的的獨立危險因素(P<0.05)，需要引起重視。本研究認為，這可能與年齡小者大多為原發性癲癇，病情與病史長、熬夜、疲勞、服藥不規律，而年齡大者多為卒中后癲癇有關。有研究表明，NLRP3激活劑包括膽固醇和尿酸結晶，子癇前期患者血清總膽固醇和尿酸水平升高[21]。但本研究結果顯示癲癇再發組和未再發組患者血清膽固醇和尿酸水平未見明顯異常。由于病例數相對較少，未能對膽固醇或尿酸針對NLRP3炎癥小體的影響進行深入分析。

本研究不足之處是研究病例數相對較少，觀察時間短，對NLRP3水平檢測的時間點不夠多，未能完整地展現出患者再發癲癇前后的NLRP3水平變化曲線。同時，樣本既包括原發性癲癇，也包括繼發性癲癇，其NLRP3炎癥小體的激活機制可能不同。另外，納入患者均為入院患者，而門診患者被排除在外，這些患者病情相對較重，對短期癲癇再發的發生率可能也有影響。

綜上所述，NLRP3水平升高是成人癲癇患者短期內再發的重要危險因素，對短期內癲癇再發具有一定的預測價值。NLRP3可能是新的癲癇治療靶點，臨床上其檢測簡便易行，具有較大的實用價值，值得應用及推廣。